专利名称：一种高生物活性卵黄抗体及其制备方法
技术领域：
一种抗气溶素及胞外蛋白酶复合型强化卵黄抗体干粉的制备技术，用于鱼类细菌性疾病防治。属于生物制品及工业化分离技术领域。
背景技术：
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是一类广泛存在于水环境的常在菌，是我国淡水养殖鱼类暴发性出血病等细菌性疾病的主要病原，水产生产过程中由其引起的疾病危害种类多、流行范围广、死亡率高，给水产养殖带来较大损失。传统疗法是使用抗菌药，有时配合中药制剂。但抗菌药的使用不仅带来严重的耐药性问题，而且在水产品中易产生残留。因此，寻找一种安全、高效的抗菌药替代品成为一个亟待解决的问题。特异性卵黄抗体 (Egg yolk immunoglobulin, IgY)可治疗由细菌或病毒感染引起的疾病，具有安全无残留、 不产生耐药性、价廉易得等优点，是一种具有广阔应用前景的抗生素替代品。目前，卵黄抗体研制技术正成为国内外医药领域的新热点。在国内，关于卵黄抗体在动物多种感染性疾病防治中的应用已有很多报道，但关于特异性卵黄抗体在鱼类疾病防治方面的相关研究仅查到2篇，大连水产学院王斌等Q006)从大菱鲆体内分离得到迟缓爱德华氏菌制成灭活苗，免疫蛋鸡后获得特异性卵黄抗体，对攻毒大菱鲆具有明显防治效果。 湖南农业大学雷勇等0006，硕士论文)研制了抗病毒卵黄抗体用来治疗虾白斑病，注射途径无效，但口服抗体对虾白斑病的预防和治疗均有明显保护作用。国外对卵黄抗体在鱼类细菌性疾病防治方面的应用也有研究。Hatta等报道了用于防治鳗的特异性卵黄抗体；八田一用抗爱德华氏菌的卵黄抗体粉末投喂鳗，结果证明完全可以预防鳗的爱德华氏菌病； Arastech等用卵黄抗体对虹鳟进行被动免疫预防试验，发现虹鳟服用卵黄抗体15d后，对鳗弧菌产生了明显的免疫力；Gutierrez等用卵黄抗体对日本鳗鲡进行口服免疫，发现免疫后其肠道中迟缓爱德华氏菌的数量显著减少，因而抑制该病原从受伤的肠壁入侵肝脏和肾脏，降低了该病的死亡率。但针对鱼类暴发性出血病的主要致病菌——嗜水气单胞菌的卵黄抗体目前尚无公开生产技术。嗜水气单胞菌的主要致病因子Aer毒素是目前国际公认的嗜水气单胞菌主要毒力因子，其基因结构有较高的同源性；胞外蛋白酶(ECPase)是嗜水气单胞菌分泌的胞外产物之一，是另一种主要致病因子，具有很好的抗原保护作用，不同来源的ECPase基因序列具有高度同源性。申请人:通过试验发现，嗜水气单胞菌不同菌株的气溶素Aer和胞外蛋白酶ECPase 能分别交叉抑制溶血和溶蛋白反应，可弥补菌株之间几乎不能交叉反应的缺陷，并进一步增强IgY的作用，而且三者之间之间不会相互抑制抗体的产生，都能产生较高水平抗体。
发明内容
本发明目的在于提供一种高生物活性卵黄抗体，用于防治鱼类细菌性疾病尤其是鱼类暴发性出血病具有显著效果。
本发明的另一目的是提供制备该高生物活性卵黄抗体的制备方法。本发明的目的是通过以下方式实现的一种高生物活性卵黄抗体，该抗体由嗜水气单胞菌气溶素及胞外蛋白酶作为免疫原分别免疫产蛋鸡，并收集被免疫鸡所产的鸡蛋，从该鸡蛋中分离得到高生物活性卵黄抗体。所述的作为免疫原的嗜水气单胞菌气溶素是通过以下步骤制备得到的嗜水气单胞菌培养上清，经20 % 60 %饱和度的硫酸铵溶液分级沉淀，冷藏过夜，离心(优选 5000rpm离心)，用pH = 7. 8 8. 0，50mmol/L Tris-HCl缓冲液溶解并透析；离心(优选 12000rpm离心)，上清调整蛋白浓度至100 200μ g/mL。在免疫使用时可与等量弗氏佐剂充分乳化。所述的作为免疫原的胞外蛋白酶是通过以下步骤制备得到的嗜水气单胞菌培养上清，用50% 100%饱和度的硫酸铵溶液沉淀，冷藏过夜，用PH = 7. 8 8.0，50mmol/ L Tris-HCl缓冲液溶解并透析；离心(优选12000rpm离心)，上清调整蛋白浓度至100 200μ g/mL。在免疫使用时可与等量弗氏佐剂充分乳化。所述的蛋鸡免疫为将嗜水气单胞菌气溶素和胞外蛋白酶两种免疫原分别多点注射产蛋鸡，各分三次免疫，每次免疫间隔时间为至少2周，免疫剂量每次0. 5 3mL/只。分离卵黄抗体的方法采用辛酸-硫酸铵法分离得到卵黄抗体。所述的采用辛酸-硫酸铵法分离得到卵黄抗体具体步骤为免疫后的卵黄先与PH5. 0醋酸钠缓冲液混合， 加入4%正辛酸，室温混合，冷藏静置池以上，使其充分沉淀；辛酸沉淀后抽滤，抽滤液离心，收集上清，冰浴条件下加入等体积饱和硫酸铵溶液，使抗体沉淀，离心，收集卵黄抗体。分离卵黄抗体后可对卵黄抗体进行干燥，优选采用喷雾干燥法，进口温度为 130 140°C，出口温度为70 90°C。上述高生物活性卵黄抗体的制备方法是将嗜水气单胞菌气溶素及胞外蛋白酶作为免疫原分别免疫产蛋鸡，并收集被免疫的鸡所产的鸡蛋，从该鸡蛋中分离得到高生物活性卵黄抗体。本发明卵黄抗体可在制备防治鱼类细菌性疾病的药物中应用，特别可用于制备防治鱼类暴发性出血病的药物。使用时，可将抗体拌料混饲后通过消化道给药或非消化道给药。本发明所用的嗜水气单胞菌适宜的培养基为营养琼脂或营养肉汤，培养温度优选为观 30°C。所述的嗜水气单胞菌气溶素分级沉淀提取方法优选先用20%饱和度的硫酸铵溶液沉淀杂蛋白，再用60%饱和度的硫酸铵溶液沉淀气溶素Aer ；最后用50mmol/L Tris-HCl缓冲液溶解并透析。胞外蛋白酶ECPase的提取方法优选采用70%饱和度的硫酸铵溶液沉淀ECPase后，再用50mmol/L Tris-HCl溶解并透析。卵黄抗体的提取、纯化优选方案是先用4%正辛酸沉淀杂蛋白，再用50%饱和度的饱和硫酸铵溶液提纯。本发明所述的免疫原为气溶素Aer和胞外蛋白酶，免疫程序为两种免疫原分别免疫蛋鸡，接种途径为胸肌或皮下多点注射，基础免疫一次后再加强免疫二次，间隔时间为至少2周，优选每次间隔2周。免疫剂量以每次0. 5 3mL/只为宜，三次免疫剂量可依次递增。最后一次免疫后一周即可收集鸡蛋，纯化抗体。本发明采用的市售嗜水气单胞菌均可使用。
与现有技术比较本发明的有益效果与用嗜水气单胞菌菌苗免疫相比，采用嗜水气单胞菌主要致病因子气溶素Aer和胞外蛋白酶ECPase分别作为免疫原制备IgY，不仅更好地克服了嗜水气单胞菌血清型对抗体保护效果的影响，且获得的抗体效价更高。抗体粉生产过程中使用的仪器设备简单，所用试剂价廉易得，无污染，获得的抗体效价高，免疫活性强，对鱼类暴发性出血病的防治效果好，不产生药物残留，可保障水产品的安全。此外，高免蛋的生产模式可采用与蛋鸡养殖户签订协议的形式，利用本发明技术以蛋鸡作为生物反应器，既避免蛋鸡养殖环节的投入和风险，以低成本方式获得大量高免蛋，易于实施，社会效益高。
图1实施例2气溶素Aer的SDS-PAGE图谱(气溶素Aer约为45kDa)图2实施例3胞外蛋白酶ECPase的SDS-PAGE图谱(ECPase约为!35kDa)图3实施例4两种免疫原同时免疫卵黄抗体效价随时间变化曲线图4实施例5中纯化后卵黄抗体的SDS-PAGE图谱(3和4为辛酸-硫酸铵法提纯的2种卵黄抗体)
具体实施例方式实施例1嗜水气单胞菌F8(由上海海洋大学提供，分离自草鱼)的培养以琼脂平板或营养肉汤(pH7. 0 7. 5)接种嗜水气单胞菌，于观 30°C培养，接种后6 1 为对数生长期。菌落形态为光滑、边缘整齐，表面湿润、圆形、微凸，有特殊芳香气味，白色至淡黄色。实施例2嗜水气单胞菌气溶素的提取和油苗的制备嗜水气单胞菌用LB培养基于28 30°C培养48 60h，4500rpm离心取上清，先用20%饱和度的硫酸铵在4°C沉淀4h，5000rpm离心，取上清，再用60%的饱和度的硫酸铵沉淀，4°C过夜，5000rpm离心，用50mmol/L Tris-HCl (pH = 7. 8 8. 0)溶解并透析两天， 12000rpm离心5min，去杂质，上清调整蛋白浓度至100 μ g/mL，与上清等量的弗氏佐剂充分乳化，至滴入水中后Imin内不分散即可。实施例3胞外蛋白酶ECPase的提取和油苗的制备嗜水气单胞菌用LB培养基于28 30°C培养48 60h，4500rpm离心，取上清，用 70%饱和度的硫酸铵沉淀，4°C过夜，5000rpm离心，用50mM Tris-HCl (pH7. 8 8. 0)溶解并透析两天，12000rpm离心5min，去杂质，上清调整蛋白浓度至200 μ g/mL,与上清等量的弗氏佐剂充分乳化。实施例4蛋鸡免疫剂量和免疫程序25周龄罗曼蛋鸡，饲养观察2周后，将按上述实施例1-3所述方法得到的气溶素 Aer和胞外蛋白酶ECPase两种油苗分别胸肌或皮下多点注射，各分三次免疫产蛋鸡，每次免疫间隔时间为2周。免疫剂量依次为0.5mL/只、ImL/只、2mL/只。最后一次免疫后一周开始收集鸡蛋，采用间接ELISA法测定卵黄抗体效价。首免后不同时间卵黄抗体效价如表 1和图3。间接ELISA测定卵黄抗体效价方法为方阵滴定法。基本程序为酶标板1 8行依次以10,5,2. 5,1. 25,0. 625,0. 31,0. 15mg/mL气溶素Aer或胞外蛋白酶ECPase和包被液包被，4°C过夜；洗涤，拍干，重复3次；每孔加OVA 200μ ，37 封闭60min ；洗涤4次， 拍干；每孔加100 μ L不同稀释倍数的待测卵黄抗体液(卵黄液按实施例5中实施所得)， 37°C温育60min ；重复洗涤4次，拍干；加羊抗鸡HRP-IgG (1 5000)，100 μ L/孔，37°C温育 60min ；洗涤 5 次；每孔加 TMB-H2O2 100 μ L，37°C避光反应 15min ；每孔加 50 μ LH2SO4 (2mol/ L)，终止反应，在450nm处测OD值。以OD值接近1且与周边孔跳跃最大的孔所对应的抗体稀释度作为抗体效价。 表1首免后不同时间卵黄抗体效价
权利要求
1.一种高生物活性卵黄抗体，其特征是该抗体由嗜水气单胞菌气溶素及胞外蛋白酶作为免疫原分别免疫产蛋鸡，并收集被免疫鸡所产的鸡蛋，从该鸡蛋中分离得到高生物活性卵黄抗体。
2.根据权利要求1所述的卵黄抗体，其特征是所述的作为免疫原的嗜水气单胞菌气溶素是通过以下步骤制备得到的嗜水气单胞菌培养上清，经20% 60%饱和度的硫酸铵溶液分级沉淀，冷藏过夜，离心，用pH = 7. 8 8. 0，50mmol/L Tris-HCl缓冲液溶解并透析； 离心，上清调整蛋白浓度至100 200μ g/mL。
3.根据权利要求1所述的卵黄抗体，其特征在于所述的作为免疫原的胞外蛋白酶是通过以下步骤制备得到的嗜水气单胞菌培养上清，用50% 100%饱和度的硫酸铵溶液沉淀，冷藏过夜，用PH = 7. 8 8. 0,50mmol/L Tris-HCl缓冲液溶解并透析；离心，上清调整蛋白浓度至100 200 μ g/mL。
4.根据权利要求1所述的卵黄抗体，其特征在于所述的蛋鸡免疫为将嗜水气单胞菌气溶素和胞外蛋白酶两种免疫原分别多点注射产蛋鸡，各免疫三次，每次免疫间隔时间为至少2周，免疫剂量每次0. 5 3mL/只。
5.根据权利要求1所述的卵黄抗体，其特征在于分离卵黄抗体的方法采用辛酸-硫酸铵法分离得到卵黄抗体。
6.根据权利要求5所述的卵黄抗体，其特征在于所述的采用辛酸-硫酸铵法分离得到卵黄抗体具体步骤为免疫后的卵黄先与PH5. 0醋酸钠缓冲液混合，加入4%正辛酸，室温混合，冷藏静置池以上，使其充分沉淀；辛酸沉淀后抽滤，抽滤液离心，收集上清，冰浴条件下加入等体积饱和硫酸铵溶液，使抗体沉淀，离心，收集卵黄抗体。
7.根据权利要求1所述的卵黄抗体，其特征在于分离卵黄抗体后对卵黄抗体进行干燥，采用喷雾干燥法，进口温度为130 140°C，出口温度为70 90°C。
8.一种高生物活性卵黄抗体的制备方法，其特征是该方法是将嗜水气单胞菌气溶素及胞外蛋白酶作为免疫原分别免疫产蛋鸡，并收集被免疫的鸡所产的鸡蛋，从该鸡蛋中分离得到高生物活性卵黄抗体。
9.权利要求1所述的卵黄抗体在制备防治鱼类细菌性疾病的药物中的应用。
10.权利要求1所述的卵黄抗体在制备防治鱼类暴发性出血病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种高生物活性卵黄抗体及其制备方法。本发明中的抗体以致病性嗜水气单胞菌主要致病因子气溶素和胞外蛋白酶分别作为免疫原，以适宜的免疫程序同时免疫蛋鸡，获得高免蛋，效价可高达1∶212，再以辛酸-硫酸铵法纯化抗体后进行喷雾干燥。按照本发明获得的抗体效价高，可用鱼类细菌性疾病的控制，尤其对出血病发病鱼的免疫保护作用可高达90％。并且采用该方法大批量生产抗体成本低，省力又省厂房，社会效益高，前景广阔。
文档编号C07K16/02GK102276720SQ20111021568
公开日2011年12月14日 申请日期2011年7月29日 优先权日2011年7月29日
发明者吴双, 孟婷, 左伟勇, 成大荣, 朱善元, 杨海峰, 洪伟鸣, 王安平, 王帅兵, 王永娟, 秦枫, 邢晓玲, 郑义, 陆辉, 黄文强 申请人:江苏畜牧兽医职业技术学院