检测尿路感染的方法和使用液相色谱的样本分析方法与流程

本发明涉及检测尿路感染(uti)的方法。本发明还涉及使用液相色谱的临床样本分析。

背景技术：

超过75％的尿路感染(uti)是由来自肠杆菌科(enterobacteriaceaefamily)的生物引起的，其包括如下微生物的一种或多种：大肠杆菌(ec)；克雷伯菌属，诸如肺炎克雷伯菌(kp)或产酸克雷伯菌(ko)；奇异变形菌(proteusmirabillis，pm)；肠杆菌属(enterobacterspecies，esp)；和柠檬酸杆菌属(csp)(以下简称常见uti-致病微生物)。

尿路感染(uti)非常常见，超过半数的妇女在其一生中会发生尿路感染。结果是，尿培养是微生物学中最常做的检测。现在的uti诊断方案需要细菌培养步骤，这会带来长的诊断时间表。使用现在的技术，它需要大约两天时间来鉴定uti-致病生物并描绘其抗生素敏感性特征。

在理想的情况下，在医生开抗生素之前会鉴定造成uti的生物并测量它们的抗生素敏感性以便确保适当的感染管理。然而，uti诊断需要的长时间表使得等待临床结果是不切实际的。因此，很多患者被给予了与他们的症状不是恰当匹配的抗生素疗法。较快的诊断方法会降低因未恰当治疗uti而引发的并发症。

技术实现要素：

已经发明了检测尿路感染(uti)的方法。

已经发明了用于分析尿样以便测定其是否含有与尿路感染有关的微生物的方法。可以对尿样进行分析以便测定其是否含有选自胍基丁胺(agmatine)、腐胺(putrescine)或尸胺(cadaverine)的至少一种脱羧氨基酸代谢物。尿中存在胍基丁胺、腐胺或尸胺表明了任何常见uti-致病微生物引发的尿路感染。胍基丁胺的存在强烈地表明了任何常见uti-致病微生物引发的尿路感染。

因此，根据本发明的一个方面，提供了诊断患者尿路感染(uti)的方法，该方法包括：从患者获得免培养(culture-independent)尿样；分析免培养尿样；其中，如果在免培养尿样中检测到胍基丁胺、腐胺或尸胺的至少一种，那么将患者诊断为患有uti。

根据本发明另一广泛的方面，提供了用于治疗患uti患者的抗生素，所述uti与免培养尿样中检测到存在胍基丁胺、腐胺或尸胺的至少一种有关；其中，选择对肠杆菌科的物种具有活性的抗生素；其中，在患者免培养尿样中检测到胍基丁胺、腐胺或尸胺的至少一种。

根据本发明另一广泛的方面，提供了抗生素用于治疗患uti患者的用途，所述uti与患者免培养尿样中存在胍基丁胺、腐胺或尸胺的至少一种有关；其中，抗生素被选择为对肠杆菌科的物种具有活性；其中，在患者免培养尿样中检测到代谢物。

虽然可以采用各种方法分析尿样的胍基丁胺、腐胺或尸胺的至少一种，但是快速样本分析方法是非常有价值的，因为由于uti频发而造成实验室每天有成百上千的样本需要分析。因此，也已经发明了用于或不用于uti组织的样本分析方法。该方法能够快速分析复杂样本诸如体液，例如uti病例的尿样和血流感染病例的血样。该方法对化学物质采用液相色谱和质谱分析，其中，在靶物质在等度连续条件下洗脱的条件下将样本以一系列连续样本塞(sampleplug)形式注入液相色谱系统。在另一实施方案中，该方法采用多阶段等度连续洗脱，在一个阶段连续注入并且在第二阶段从柱快速洗脱。

因此，根据本发明的其他方面，提供了多个样本的快速样本分析方法，用于分析是否存在目标化合物，该方法包括：一次一个按顺序将多个样本与等度溶剂(isocraticsolvent)一起连续注入lc柱，等度溶剂基本上提供了目标化合物的逐步洗脱；将一个或多个分析物接收至质谱仪进行分析物检测以便确定一个或多个分析物是否包括目标化合物。

根据本发明的另一广泛的方面，提供了用于检测目标化合物的快速样本分析的lc-ms仪器，该仪器包括：第一柱，配置为用于液相色谱；第二柱，配置为用于液相色谱并且平行于第一柱；检测器，用于检测包括目标化合物的化合物，其从第一柱和第二柱洗脱；进样器，用于连续交替地将多个样本连同第一流动相注入第一柱和第二柱；溶剂泵，用于将不同于第一流动相的第二流动相交替注入第一柱和第二柱；阀门开关，用于将进样器和溶剂泵交替连接至第一柱和第二柱。

根据本发明的另一广泛的方面，提供了快速样本分析的lc-ms仪器，其提供了多个免培养样本的连续洗脱，用于检测目标化合物，该仪器包括：lc柱；第一流动相，用于将样本注入lc柱；第二流动相，具有配置为将样本从lc柱洗脱下来的不同于第一流动相的组成；检测器，用于检测从lc柱洗脱的化合物，其包括了目标化合物；进样器，配置为将多个免培养样本连续注入lc柱；阀门开关，在第一流动相和第二流动相之间切换；其中，阀门开关配置为在将多个样本注入lc柱之后从第一流动相切换至第二流动相，并且，阀门开关配置为在将多个样本从lc柱洗脱之后从第二流动相切换至第一流动相。

根据本发明的另一广泛的方面，提供了分析体液样本以便确定其是否含有与感染有关的微生物的方法，该方法包括：提供来自患者的体液样本；在液相色谱质谱(lc-ms)设备中分析样本，其中，采用lc-ms设备分析样本，并且用等度溶剂运行液相色谱(lc)；其中，如果通过等度连续lc-ms在体液样本中检测到微生物的代谢物，那么体液样本含有与感染有关的微生物。

在一种实施方案中，将已知量的同位素标记的物质诸如脱羧氨基酸加入至复杂样本以便能够通过测量同位素比值来量化目标物质。

应当理解的是，本发明的其他方面通过如下详细描述对本领域技术人员将变得显而易见，其中，通过实施例的方式显示并描述本发明的各种实施方案。应认识到，本发明能够用于其他和不同的实施方式，并且其设计和实现的若干细节能够在各种其他方面进行修改，都在本发明权利要求的范围之内。因此，详细的说明和实施例被认为本质上是说明性的而非限制性的。

附图说明

为了更好的理解本发明，附下图：

图1是两阶段等度连续色谱法(two-stageisocraticcontinuouschromatography)的示意图，设有复合柱注入模式(multiplexedcolumninjectionschedule)，其中采用了两根柱。

图2a至图2d是四种不同色谱法的多次进样lc分析(td)的时间安排方案(ti)：常规3分钟梯度(图2a)；等度连续色谱法(图2b)；两阶段等度连续色谱法(图2c)；和复合的(multiplexed)两阶段等度连续色谱法，其中有两根色谱柱，每根在两阶段等度连续色谱法中运行(图2d)。等度连续色谱法(图2b)包括重复进样(箭头)的时间ti，随后使用等度溶剂进行样本洗脱检测td，可能地，随后使用选择的流动相进行柱修复tr以便清洗柱子。两阶段等度连续色谱法(图2c)包括第一阶段，包括使用溶剂b(即第一流动相)进样ti，和第二阶段，包括使用不同于溶剂b的溶剂(即第二流动相)进行样本洗脱，在此期间，分离的分子以峰形式洗脱并被检测td，可能地，随后使用选择流动相进行柱修复tr以便清洗柱子。复合的两阶段等度连续色谱法(图2d)包括两根柱子，其中，当柱1在第二阶段td和tr时，柱2在第一阶段ti并且柱子阶段相互交替–如此，随着时间的推移能够分析更多样本并且能够实现检测器的更高效利用。

图3a至图3c是对每实验室单位时间洗脱的样本峰的比较：常规3分钟梯度(图3a)，等度连续色谱法(图3b)和两阶段等度连续色谱法(图3c)。洗脱的样本产生自含5um胍基丁胺标准品的尿样的重复注入。

图4表示等度连续色谱样本运行(上曲线)和使用同位素标记的胍基丁胺c13的等度连续色谱样本运行(下曲线)期间不同的离子抑制(differentialionsuppression)造成的误差效应，其表明胍基丁胺与同位素标记的胍基丁胺的比值能够用于修正误差。

图5显示了证实使用等度连续色谱法通过高于临床相关胍基丁胺浓度的同位素标记的胍基丁胺能够实现精确测量胍基丁胺的两幅图，将同位素标记的胍基丁胺作为每个样本的内参加入，通过胍基丁胺与同位素标记的胍基丁胺的比值计算浓度。上曲线显示了加入到含有100nm¹³c胍基丁胺的尿样中的¹²c胍基丁胺标准品的校正曲线。下曲线显示了独立质控尿样，¹²c胍基丁胺与根据观测到的同位素比计算的胍基丁胺浓度相比的量是已知的。

图6是采用等度连续色谱法分析的9份大肠杆菌培养物和9份铜绿假单胞菌培养物中¹²c和¹³c腐胺水平的比较(3次技术重复)。用于产生这些样本的培养方法与检测血流感染的成熟方法相匹配。

图7是使用等度连续色谱法检测为细菌生长阴性的96份人尿样(左上方图)相对于使用等度连续色谱法检测为大肠杆菌感染阳性的96份人尿样(右上方图)中¹²c和¹³c胍基丁胺水平的比较。由¹²c/¹³c比值乘以¹³c胍基丁胺标准品已知浓度计算得到¹²c胍基丁胺浓度(下方曲线显示同位素标记的胍基丁胺标准品)。

图8是使用设有复合柱注入模式(使用了两根柱子)的两阶段等度连续色谱法检测细菌生长为阴性的96份人尿样(左上方图)相对于使用设有复合柱注入模式(使用了两根柱子)的两阶段等度连续色谱法检测为大肠杆菌感染阳性的96份人尿样(右上方图)中¹²c和¹³c胍基丁胺水平的比较。由¹²c/¹³c比值乘以¹³c胍基丁胺标准品已知浓度计算得到¹²c胍基丁胺浓度(下方曲线显示同位素标记的胍基丁胺标准品)。

图9是显示来自健康者(neg)和患有6种不同类型细菌-大肠杆菌(ec)；克雷伯菌属，诸如肺炎克雷伯菌(kp)或产酸克雷伯菌(ko)；奇异变形菌(pm)；肠杆菌属(esp)；和柠檬酸杆菌属(csp)引发的尿路感染患者的尿样中观察到的胍基丁胺浓度的图。上方的方块代表样本中观察到的胍基丁胺浓度，下方的方块显示了以log10为尺度的相同数据。第二个方块中的虚线表示58nm的阈值，这是由同位素比值确定的并且对应于与0.94的灵敏性和0.99的特异性有关的uti检测阈值。

图10是显示代谢偏好检测(mpa)的原理图，mpa用于测定8份临床大肠杆菌分离物(行11-18)对一系列浓度的4种抗生素的敏感性。通过琥珀酸水平(培养物中大肠杆菌分泌的代谢物)监控代谢活动。相对于对照培养基，代谢物产率增加(浅灰色)表示代谢活动的特征是对给定浓度的抗生素具有抗性。相对于对照，代谢物产率减少(深灰色)表明抗生素敏感性。在每种条件下，每个分离物进行3次技术性重复。黑条表示在区域诊断实验室(cls)由基于传统培养的方法测定的每种分离物的抗生素敏感性图。浓度单位是μg/ml。其中，t/s指的是甲氧苄啶-磺胺甲基异恶唑。

图11是显示胍基丁胺可用作uti存在的标志的原理图。从艾伯塔省公共实验室(albertapubliclaboratories)获得了519份样本并对它们进行了分析。胍基丁胺浓度与含有肠杆菌科(enterobacteriaceae)的培养阳性样本联系紧密。在原理图中，根据物种形成结果将样本分为亚组。

具体实施方式

以下给出的详细描述和实施例旨在描述本发明的各种实施方案，而非仅代表发明人考虑到的实施方案。详细描述包括用于全面理解本发明的具体细节。然而，对本领域技术人员显而易见的是没有这些具体细节也可以实践本发明。

人尿样的分析表明，出乎意料地，在至少75％的尿路感染(uti)中，尿样中存在水平升高的胍基丁胺、腐胺或尸胺，而健康者的尿样却没有出现这种情况。研究显示，鉴于试验的检测限(50nm)，未患uti的人类受试者的尿中胍基丁胺、腐胺或尸胺的浓度是检测不到的。

可理解的是，代谢物的类似物，诸如加合物、同位素、片段、多电荷态等，也被认为是代谢物。应注意的是，光谱分析中的代谢物信号可以是复合体(complex)且事实上每个分子可包括不止一种信号。总的来说，该分子的信号组可以被分解并认为是单一的代谢物信号。例如，质谱仪对每个分子检测10-50个信号，前述分子包括原始分子(亲代)和原始分子的各种类似物，包括片段、加合物(发生在仪器中的化学结合)、多电荷态和同位素(具有1个或多个额外中子的分子的自然发生形式)。检测这些信号中的任何信号能够表示一个分子，在本申请中，胍基丁胺、腐胺或尸胺的任何类似物包括在感兴趣的代谢物中：胍基丁胺、腐胺或尸胺。

本研究出乎意料地得出结论：肠杆菌科的微生物造成的uti能够通过检测患者尿中的胍基丁胺、腐胺和/或尸胺来进行诊断。肠杆菌科的微生物包括：大肠杆菌，奇异变形杆菌，柠檬酸杆菌属(包括布氏柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、无丙二酸柠檬酸杆菌(citrobacteramalonaticus)、法氏柠檬酸杆菌(citrobacterfarmeri)和克氏柠檬酸杆菌(citrobacterkoseri))，肠杆菌属(包括产气肠杆菌(现在归类为产气克雷伯氏杆菌(klebsiellaaerogenes))和阴沟肠杆菌(enterobactercloacaecplx.))，克雷伯菌属(包括产酸克雷伯菌和/或肺炎克雷伯菌)。研究的所有肠杆菌都产生胍基丁胺、腐胺和/或尸胺。因此，不管感染是否是由大肠杆菌、克雷伯菌属、奇异变形杆菌、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属引起的，通过分析患者尿样中胍基丁胺、腐胺或尸胺的一种或多种的浓度就能够识别感染。尿中170nm胍基丁胺或更大的阈值表示肠杆菌感染。

胍基丁胺可从被如下至少一种微生物感染的患者样本中识别出：大肠杆菌，奇异变形杆菌，柠檬酸杆菌属(包括布氏柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、无丙二酸柠檬酸杆菌、法氏柠檬酸杆菌、和克氏柠檬酸杆菌)，肠杆菌属(包括产气肠杆菌和阴沟肠杆菌)，克雷伯菌属(包括产酸克雷伯菌和肺炎克雷伯菌)。例如，参考图9和图11，对来自人类受试者的尿样进行分析，被如下微生物感染的受试者的样本含有胍基丁胺：大肠杆菌(ec)，奇异变形杆菌(pm)，柠檬酸杆菌属(csp)(包括布氏柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、无丙二酸柠檬酸杆菌、法氏柠檬酸杆菌和克氏柠檬酸杆菌)，肠杆菌属(esp)(包括产气肠杆菌和阴沟肠杆菌)，克雷伯菌属(包括产酸克雷伯菌(ko)或肺炎克雷伯菌(kp))，未患任何uti(即uti阴性)的受试者的样本没有可检测到的胍基丁胺水平。因此，出乎意料地，针对尿中胍基丁胺的测试能够用于可靠地的表明患者患有任一常见uti-致病微生物引起的感染。在一些情况下，腐胺(图6)和尸胺也能够用作诊断人类受试者uti的指标。

肠杆菌科，诸如大肠杆菌、奇异变形杆菌、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属和克雷伯菌属，产生胍基丁胺且有时候产生腐胺或尸胺，但是，人体在尿路中不会产生任何胍基丁胺、腐胺或尸胺。蛋白质的分解，特别是氨基酸，会产生胍基丁胺、腐胺和尸胺。胍基丁胺是化学精氨酸脱羧产生的氨基胍。腐胺或四亚甲基二胺(tetramethylenediamine)是鸟氨酸或胍基丁胺的代谢物。尸胺，又称作五亚甲基二胺(pentamethylenediamine)，由化学赖氨酸脱羧产生。

因此，在一种实施方案中，一种确定患者是否有尿路感染的方法可包括：分析患者尿样是否存在胍基丁胺、腐胺或尸胺，阳性结果表明患者患有大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、奇异变形菌、肠杆菌属或柠檬酸杆菌属的至少一种引起的尿路感染。因为该分析检测的是微生物的代谢物而不是直接检测微生物，所以样本处理被简化，例如，样本不需进行任何培养就可使用，因此可避免培养所需的材料和时间。

在一种实施方案中，来自患者的尿样在收集后可直接进行分析。样本不需培养，因此可使用免培养样本并且可进行免培养分析。

收集之后，可采用该方法直接检测尿样。可选地，人尿样可使用防腐剂进行保存，例如硼酸缓冲溶液，其防止人尿样中任何微生物的生长。可选地，尿样在收集后可使用固定剂(例如甲醇)进行固定以便停止微生物活性。人尿样的准备还可包括例如通过过滤或离心去除固体。其后，分析尿样的液体部分(例如在离心情况下的上层清液)是否存在胍基丁胺、腐胺或尸胺。

任意地，在固定和去除固体之后可使用固相提取富集样本。固相提取用于纯化生物样本。固定相(例如二氧化硅)连同高ph流动相用于捕获尿样中的分子。然后，当降低流动相ph时，固定相洗脱分子，因而纯化生物样本。固相提取的方法包括在实施例8中。

如果样本分析给出了胍基丁胺、腐胺或尸胺中至少一者的阳性结果，从而表明患者患有尿路感染，那么，若需要，可进一步分析样本以便测定关于uti原因的更多信息。例如，可测试尿样的抗生素耐药性以便测定可用于治疗uti的合适抗生素(图10)。如果样本给出阳性结果，那么可进行代谢偏好检测以便确定因抗生素耐药性而不能用于治疗uti的抗生素类。该代谢检测还可表明存在的病原体类型，例如，革兰氏阴性或阳性、属、种等，因此，代替常用抗生素，可给予患者特效的、适当疗程的抗生素治疗。

代谢偏好检测可识别阳性结果样本中细胞类型，该检测包括：在生长培养基中培养样本；培养之后，采用化学分析对培养的生长培养基进行分析以便测定培养的生长培养基中代谢物水平；和，通过将代谢物水平和参考代谢物图进行比较以及将代谢物水平与表示细胞类型的参考代谢物图进行匹配来识别细胞类型。生物体的细胞类型可以是生物体的一般分类(即，革兰氏阴性、革兰氏阳性等)、起源的属或种(即，细菌的种等)或者菌株或区别特征(即，对抗生素的抗性或敏感性)。

对于代谢偏好检测，细胞在其中生长的生长培养基提供了营养并积累了废物，称作微生物的代谢物。随着时间的推移，通过生长培养基组分中积累的变化，放大了微生物代谢信号。培养期使阳性结果样本中的细胞通过消耗它们偏好的养分和分泌废物来进行新陈代谢。记录培养基中存在的养分，在分析之后对代谢物进行分析以便获得生长培养基中生物体的代谢数据。将参考代谢图(其是微生物群落或单个种、亚种或菌株的已知代谢结果)与由样本分析得到的代谢数据进行比较，以便对未知生物体进行分类。本申请人的公开日为2018年9月20日的wo2018/165751对该方法进行了更详细的描述，其通过引用并入本申请中。

归因于本申请的快速诊断，如果在尿样中检测到胍基丁胺、腐胺或尸胺，那么能够将更特效的抗生素(诸如氨苄青霉素)施用于患者。其他可能的治疗包括塞普特拉(ceptra)、头孢霉素、呋喃妥因、磷霉素和氟喹诺酮。然而，快速检测会减少对更广谱的试剂的需要，诸如氟喹诺酮或广谱头孢霉素。对于肠杆菌科内实际细胞类型，上述其他抗生素敏感性检测和/或代谢偏好检测可实现对抗生素更加精确和靶向性更强的选择。

分析来自患者的尿样是否存在胍基丁胺、腐胺或尸胺可通过多种技术得以实现。

可以使用光谱分析技术。在某些情况下，在光谱分析之前可以先进行样本分离，例如采用色谱分离。

尤其，可使用检测器来检测患者尿样中胍基丁胺、腐胺或尸胺。可用的检测器包括质谱仪、uv-vis分光光度检测器、阵列二极管检测器或核磁共振波谱仪。

这些检测器可用于在样本分离之后接收样本，或者，有时候直接接收样本。尤其，在一些方法中，尿样可不经分离(诸如色谱法)即进行分析，例如，使用直接注入策略并结合同位素稀释。该策略有时候应用于如下情况：已经从尿样中提纯出目标分析物，或者，离子抑制效应通过同位素稀释得以控制。一种现行做法是通过直接注入技术分析样本，前述直接注入技术是将自动进样器直接连接至质谱分析仪，从而省略了色谱分离步骤。该直接注入策略规避了色谱方法需要的时间，但是在分析低复杂度溶液时仅是粗略定量的。由于诊断应用通常涉及复杂样本的分析，现行做法可包括重复的样本提取和分子纯化步骤，诸如固相提取(spe)。这些方法能够通过快速直接注入方法对复杂样本进行分析，并且使离子抑制造成的定量误差最小化，但是会引入其他实验误差来源。

最常见地，通过先分离再检测来分析复杂样本诸如尿。液相色谱法(lc)公认是从复杂样本分离分析物的有用方法。传统的液相色谱法通常使用两个或更多个溶剂梯度来从每个样本分离成分化合物，其中，在样本注入之后，溶剂的类型和浓度随时间发生变化。将每个样本注入到柱子，然后使用溶剂流(流动相)洗脱，如图2a所示，溶剂流的组成随时间发生改变。虽然传统色谱法是有效的，但是，注入样本、完成梯度和使柱子重新平衡需要的时间长度对于在最短时间内分析多个样本的分析来说是不理想的。采用传统lc，在分析复杂样本诸如尿(图3)时，难以使用小于3分钟的lc运行时间来实现有效的数据质量。虽然这样的时间框架在一些情况下是可接受的，但是大多数诊所处理的与uti有关的大量临床样本强调了样本处理量的重要性。复杂生物样本通常需要扩大的lc梯度或多步提取方案来使与离子抑制有关的定量问题最小化。然而，对于每天通常要看上百个样本的临床应用来说，时间密集型方法是不理想的。因此，临床lc必须对处理量和定量特性进行平衡。

为了提高样本处理量而不需要额外的样本纯化过程，理想的是缩短分子色谱分离的时间。在一种实施方案中，本发明提供了将多个样本通过lc系统连续注入连续流动的溶剂中以缩短样本检测运行时间，进而增加样本处理量。这称作等度色谱法。在该实施方案中，可使用随时间推移保持基本恒定成分的流动相色谱溶剂来分析样本(图2b)。因此，可将多个样本注入柱子，而基本上不改变流动相溶液条件并且不使用溶剂梯度。为了能够分离目标分析物，选择流动相的组成以便能够使分析物的结合态和未结合态之间有适度的交换率。溶剂的恒定组成能够优先保留目标分析物。当适当调整流动相条件时，非目标分析物仍将结合在柱子的固定相上或者会快速从柱子上洗脱而目标分子会被保留一段时间，该段时间足以实现目标分子和非目标分子之间的分离。由于该策略的结果是目标分析物穿过柱子持续逐渐迁移，因此可将多个样本注入单一梯度并且每个样本的目标分析物会以时间分辨的多个峰洗脱，峰的顺序与样本注入顺序相匹配(图3b)。最终，柱子需要修复步骤，其中，选择使用新的溶剂组成进行洗脱，从而从柱子清除结合的分子。

对于鉴别目标化合物的存在和分析复杂生物样本(例如尿样)而言，等度连续洗脱是出乎预料地有用的。等度连续lc使样本与样本的间隔是大约1分钟。样本之间的时间间隔受如下因素影响：柱子的物理尺寸、溶剂的流速、溶剂的化学性质、柱子固定相的化学组成、柱子的温度、柱子内的流体压力和自动进样器的运行能力(例如，仪器能够进行重复注入的速度)。在典型的分析条件下，目标分析物洗脱峰之间的时间间隔的范围是30至90秒。这是传统梯度色谱法需要的时间的一小部分，如图3a和图3b的比较所示。

采用光谱法(诸如nmr)、质谱法、uv-vis、阵列二极管等分析从色谱装置洗脱的分子。在一种实施方案中，液相色谱(lc)可与质谱(ms)联合使用。lc-ms的组合是用于医学样本分析的强大工具。

如图4所示，采用lc-ms分析复杂样本时遇到的固有问题是会有不同的离子抑制，其中不同的化合物(诸如盐形式)以不同速度从柱子洗脱至检测器。不同的离子抑制是指离子源内分析物电离的竞争引起的信号变化。不同的离子抑制甚至会造成完全相同的样本在多次注入时以不同强度显现，从而限制了lc-ms的准确性和精确性。例如，在图4中，含有5um¹²c胍基丁胺和0.5um¹³c胍基丁胺(同位素标记)的样本的12份完全相同的试样相继注入至流动着等速流动的溶剂的柱子，产生的ms信号存在35-40％的差别。除了影响信号强度之外，干扰化合物不同程度的保留会改变色谱峰的形状和目标分析物的停留时间。当化合物含有碳(¹³c)或氮(¹⁵n)的稳定同位素时，色谱和电离特性的这些定量与定性改变大体上是不受影响的。为了控制电离和色谱特性的变化，本发明可应用同位素标记的目标化合物胍基丁胺、尸胺或腐胺，其允许对目标化合物进行精确可靠的检测。

因此，在一种实施方案中，等度连续色谱洗脱与如下方法结合：在该方法中，将已知浓度的同位素标记形式的目标分析物加入至每个样本，由观察到的¹²c/¹³c信号比计算目标分析物的浓度。该同位素标准化策略，也称作同位素稀释，纠正了不同的离子抑制导致的误差，因为目标分析物和同位素标记的目标分析物共同洗脱，从而经历了相同的电离和色谱条件。例如，如图4所示，尽管对于相同样本有信号间变化，5um¹²c胍基丁胺与0.5um¹³c胍基丁胺连续分析的信号强度的比值在每个样本中都基本保持一致。尽管lc-ms固有的可变离子抑制，图5显示了使用该同位素标准化方法的已知浓度¹²c胍基丁胺的定量化，并表明目标分析物水平的稳定定量可在大范围浓度值(包括临床相关浓度值)上实现。在该实施例中，使用一组健康尿样评估了该方法的定量性能，前述尿样中加入了一系列¹²c胍基丁胺标准品和100nmu-¹³c胍基丁胺作为内参。注入的样本采用等度运行的柱子进行分析，使用图5所示的校正曲线计算浓度。使用一组独立的质控品评估定量性能。

尿样分析可加入已知浓度同位素的目标分析物，在本发明的检测uti的方法中目标分析物是胍基丁胺、尸胺或腐胺的一种或多种，已知浓度的同位素标记的目标分析物的信号强度可用于使数量变异标准化和计算目标分析物的浓度。该方法包括：检测目标分析物和同时洗脱的同位素标记形式的目标分析物，以及比较它们的峰强度。使用等度连续洗脱和同位素稀释，即使有离子抑制的可变性，也能准确分析样本。该同位素稀释策略能够在按顺序注入到连续等度梯度的多个尿样中使目标分析物被准确量化。

在另一实施方案中，分析物的色谱分离可包括两个阶段，等度连续洗脱以实现好的分离和色谱峰的近间距。图2c说明了该方法。例如，参考图2c，两阶段等度连续色谱法包括：在第一阶段，第一流动相用于将多个样本注入柱子，随后是第二阶段，其中第二流动相用于从柱子洗脱分析物以进行分析物检测，例如使用ms。第二流动相具有不同于第一流动相的组成。取决于样本类型、目标化合物的特性和柱子固定相的理化性质，流动相可在疏水性、溶剂离子强度、溶剂组成、ph等方面存在不同。对于胍基丁胺的情况，第一流动相在其疏水性方面不同于第二流动相，其中第一流动相比第二流动相更加疏水。选择第一流动相以便从lc柱洗脱目标分析物。因此，在第一阶段中使用第一流动相将样本装载到柱上时，目标分析物基本上保留在lc柱上。一旦装载，第二流动相允许目标分析物的加速洗脱。

通过在第一阶段将多个样本装载到柱上然后在第二阶段快速洗脱，两阶段等度色谱法能够从多个样本分析目标分析物。第二阶段中所有样本的洗脱可以在比第一阶段样本注入消耗的时间更少(有时候是少得多)的时间内发生。针对目标分析物选择第一流动相以使分析物适度结合至色谱柱固定相，如此，多个样本中的分析物在一系列连续峰中穿过色谱柱迁移。选择第二流动相以便从色谱柱快速洗脱样本，但大体上保持非目标分析物的结合。这种两阶段策略在多个样本中分离目标分子，同时使清洗目标分析物柱需要的时间最小化。第二流动相能够在比单阶段色谱法可能用到的时间要短得多的时间内将分析物从一系列连续样本洗脱。因此，装载到柱上的一系列样本的定量分析可以在装载样本所需时间的一部分时间内完成。

为了对巨大数量的样本保持目标分析物的快速色谱分离，两阶段等度连续色谱法可以进一步包括复合柱注入模式，其中使用了多根色谱柱(图1和图2d)。每根柱能够接收一些样本，这些样本可按顺序装载直至色谱柱达到其载量。该载量取决于色谱柱的理化性质(例如，图8使用的色谱柱的载量是12个样本)。通过两阶段等度色谱法的任何可能节省的时间都限于批量等于或小于柱载量的样品分析。然而，复用多根柱可通过按顺序装载然后从一系列色谱柱洗脱目标分析物来使节省时间扩大至更大数目的样本。此外，能使多根柱装载而同时从其他柱洗脱的设备能够连续分析大量样本。

例如，如图1所示，lc系统可包括两根或多根柱10a、10b，配置为连接至同一检测器，诸如质谱仪12。这提供了样本从多根柱10a、10b的连续洗脱，产生了进入质谱仪用于检测和分析的分析物的基本稳定且高频的流动(图3c)。色谱柱可以从相同来源接收样本，例如自动进样器14，样本为第一流动相(虚线)。柱10a、10b也都可以从其他来源(例如洗脱泵16)接收第二流动相(点线)。阀门开关18a可用于切换进样器和两根柱子的每一根之间的连通，同时，洗脱泵和两根柱子之间的连通也被切换。在柱子的输出端提供另一阀门开关18b，轮流地交替连通检测器和第一与第二柱的每一根。阀门开关适当地将洗脱相引至质谱仪12或废物20。在再修复/平衡阶段，可将从柱子流出的流动相引致废物，任何时候，洗脱的流动相不需要用检测器进行分析。如果需要更多的流动相用于修复，可供给至阀门开关18a及其上游。

运行时，可以使用第一流动相向第一柱10a注入多种样本，而第二柱可以使用第二流动相从样本洗脱分析物。在不同的时间将样本单元注入每根柱子。该方法的这一方面的基本前提是将一系列样本注入第一柱，然后将样本从第二柱洗脱，其中注入和洗脱以交替或依序的方式在分开的柱子上发生。换言之，第一柱在第一阶段，而第二柱在第二阶段。该过程是循环的，当一个柱子将样本洗脱至质谱仪时，另一个柱子会再平衡并装载样本，例如采用自动进样器装载样本。在第一阶段可以有多个柱子，其中样本单元连续不断地注入柱子中。在第二阶段可以有多个柱子，其中样本快速地从柱子洗脱。因此，在根据本发明的方法中，分析包括两个阶段，等度连续洗脱和复合柱注入模式。这实现了在lc-ms平台针对复杂样本中目标化合物检测的高样本处理量和对实验室时间与资源的良好利用。

在如图1所示设置的可能的复合柱注入硬件中，阀门开关18a可用来在两流动相之间快速切换柱子上运行的流动相：来自自动进样器的第一流动相(虚线)，具有选为适合注入样本的组成；来自洗脱泵16的第二流动相(点线)，配置为从柱子快速洗脱目标化合物。在图1中，状态a显示第一阶段的柱1和第二阶段的柱2；状态b已由阀门开关18a进行切换，其显示第二阶段的柱1和第一阶段的柱2。柱子洗脱端的阀门开关18b一次一个的将两根柱子的洗脱分析物交替地送至质谱仪。虽然图1显示了两根柱子，但应当理解的是，该方法能够采用多于两根柱子。

虽然色谱法除了用于诊断uti的方法外还具有其他用途，但组合提供了非常高的样本处理量，在医学实验室中特别有用。考虑到常规梯度方法实现的峰与峰之间的洗脱时间是大约2-4分钟，等度连续系统通常能够实现的峰与峰之间的洗脱时间是大约0.5-1.5分钟，2-阶段等度系统能够实现的峰与峰之间的洗脱时间小于1分钟，例如大约0.25-1分钟(图3a至图3c)。复合的2-阶段系统总体上具有更大的处理量，因为两根或多根柱子能够在同一时间接收样本并输送至一个检测器。因此，在另一实施方案中，等度连续色谱法用来检测选自胍基丁胺、腐胺或尸胺的至少一种脱羧氨基酸代谢物的存在，以用于诊断患uti的患者，其中，采用等度连续色谱法分析来自患者的免培养尿样。在另一实施方案中，两阶段等度连续色谱法用来检测选自胍基丁胺、腐胺或尸胺的至少一种脱羧氨基酸代谢物的存在，以用于诊断患uti的患者，其中，采用两阶段等度连续色谱法分析来自患者的免培养尿样。在另一实施方案中，采用多根柱子的复合柱注入模式和两阶段等度连续色谱法用来检测选自胍基丁胺、腐胺或尸胺的至少一种脱羧氨基酸代谢物的存在，以用于诊断患uti的患者，其中，采用两阶段等度连续色谱法分析来自患者的免培养尿样。

在另一实施方案中，通过使用lc-ms着重检测胍基丁胺来实现对患者尿样的分析。胍基丁胺已显示最高的电离水平和相对于腐胺与尸胺的最高预测能力。

此外，虽然本文描述了分析uti且尤其是关于目标分析物胍基丁胺、腐胺或尸胺的方法，但是，应当理解的是，本文描述的lc方法可用于样本中目标化合物检测的其他应用。

实施例

实施例ia–使用等度连续色谱法分析尿样

将未标记的胍基丁胺加入至健康的尿对照样本中来构建模拟uti样本，使用该模拟uti样本首先对连续等度色谱法进行优化。胍基丁胺的最佳等度溶剂组成测定为具有0.1％(v/v)甲酸的86％乙腈，这能够在实现高效吸附的同时保持胍基丁胺在柱子上的流动性，进而实现快速塞式间隔(plugspacing)。吸附和洗脱之间大约4％的偏移(offset)被认为是有利于改善色谱峰的形状同时能够加快色谱柱洗脱并保持样本峰之间的基线分离，如图3b所示。这些条件能够实现连续注入，而峰之间的间隔可低至30秒。一旦确定了最佳溶剂比，就注入尿样和同位素标记的¹³c胍基丁胺。

实施例ib–同位素稀释的两阶段等度连续洗脱并采用复合柱注入的分析

尿样中加入¹³c胍基丁胺并在thermoq-exactive^tmhflc-ms平台使用syncronis^tmhilic柱进行分析。二元溶剂体系包含20mm甲酸铵ph3.00(溶剂a)和具有0.1％(v/v)甲酸的乙腈(溶剂b)，将该二元溶剂体系用于色谱分离。在正离子模式下使用平行反应监测采集质谱。具有复合柱注入模式分析的同位素稀释的两阶段等度连续洗脱通过以下步骤得以实施：i)在连续的86％溶剂b(第一流动相)等度流中连续注入同位素标记的尿样，和ii)使用等度步骤以82％溶剂b(第二流动相)洗脱这一系列的样本塞。包括开关阀门的硬件(图1)确保步骤i)在第一柱进行而步骤ii)在第二柱进行，并且确保在以交替方式将洗脱从第一流动相变至第二流动相再变回第一流动相时溶剂会立即改变。通过对天然胍丁胺代谢物与共洗脱¹³c标准品之间的同位素比进行量化，从而控制不同的离子抑制。

实施例1c–如图4所示的误差修正

使用等度连续色谱法连续12次注入加入了5um¹²c和500nmu-¹³c胍基丁胺的尿样。注意两种目标化合物的信号误差如何(以信号间的方差来说明)，特别地，每个样本的胍基丁胺和同位素标记的胍基丁胺都相同。因此，由观察到的¹²c与¹³c比值删除误差项来计算¹²c分析物的浓度，误差项例如是不同的离子抑制，其可能由样品间电离或色谱的变化而引起。即使在检测系统的性能方面存在显著的样本间或柱间变化，该方法仍能精确测定分析物浓度。

实施例2–如图6所示的血培养诊断

虽然上面显示了尿分析，但本发明的方法还可应用于其他系统。例如，如图6所示，将两阶段等度连续色谱法用于区分铜绿假单胞菌(pae)与大肠杆菌(eco)的九份微生物培养物。铜绿假单胞菌不产生腐胺，而大肠杆菌在本实验的微生物培养条件下会产生显著水平的腐胺。因此，根据样本中观察到的腐胺水平，可将生长大肠杆菌的培养物与生长铜绿假单胞菌的培养物区分开。如图6所示，检测到9个峰，代表9份尿样，随着时间的推移洗脱出3组峰，代表进行的3次技术重复，证明了该方法的稳定性和可靠性。本文使用的微生物培养实施例说明了该方法对微生物分析的普遍适用性。此外，本研究使用的微生物培养条件类似于血流感染(bsi)分析中使用的条件，从而表明该方法适用于其他临床应用，包括bsi检测。

实施例3–uti检测–图7和图8

进行优化之后，来自患有和未患有尿路感染(uti)的患者的96份尿样在如下两种条件下进行分析：i)实施例ia，即同位素标记的等度连续色谱法(图7)；和ii)实施例ib，即同位素标记的两阶段等度连续色谱法，设置有复合柱注入模式(图8)。本研究得到了令人满意的结果。利用同位素比值的定量方法得到的误差率相当于在更传统的15分钟线性梯度中观察到的误差率。

尤其，显示了与来自健康受试者的96份尿样进行比较的来自患uti(尤其是大肠杆菌)患者的96份尿样。图7和图8的底部的图显示了同位素标记的¹³c胍基丁胺的检测，图7和图8的左上方的图显示了检测为uti阴性的96份尿样，图7和图8的右上方的图显示了检测为大肠杆菌阳性的96份尿样。在图7中，按照实施例ia中描述的方法采用等度连续色谱法分析样本，在图8中，按照实施例ib中描述的方法采用设置有复合柱注入模式的两阶段等度连续色谱法分析样本。图7和图8都在左上方图中显示了阴性尿样(未被uti-致病微生物感染)并在右上方图中显示大肠杆菌感染的尿样。

这些数据表明等度连续色谱法和设置有复合柱注入模式的两阶段等度连续色谱法都是对选择的生物标志物进行高通量定量分析的可行策略。此外，这些方法可直接应用于uti检测。

通过对图7和图8的结果进行比较，我们注意到，设置有复合柱注入模式的两阶段等度连续色谱法(图8)进行样本检测的运行时间比等度连续色谱法(图7)短。我们注意到，使用等度连续色谱法进行样本检测的运行时间是每分钟检测一个样本至每30秒检测一个样本，而使用设置有复合柱注入模式的两阶段等度连续色谱法可进一步压缩样本洗脱/检测时间。

实施例4–盲法临床研究

为了验证本发明的方法，对来自患者的一组随机尿样实施设置有复合柱注入模式的两阶段等度连续色谱法以便检测天然胍基丁胺含量。通过传统uti诊断方法分别分析患者尿样。只使用胍基丁胺，数据表明未培养的或免培养的尿样中存在的胍基丁胺能够大致诊断出85％的临床表现为细菌性尿路感染的患者。在本研究中，192份患者样本进行如实施例ib所示的多柱、两阶段且等度连续色谱分析。总的运行时间是430分钟，包括192份患者样本进行两次技术重复和一些质控品注入，总计448次注入。这平均是每份患者样本的平均运行时间是1.1分钟，每次注射平均时间0.96分钟。在192份患者样本中，只观察到一次假阳性。假阳性可能是因为内部阳性阈值和传统微生物检测的阈值之间存在差别。所有的假阴性都在预料之中，其来自于尿中产生胍基丁胺的未知微生物。总的来说，与常规检测方法相比，这是极其快速且有效的筛选，一旦实施，会对uti诊断速度有极大影响并且可免去培养85％的患者样本的需要。只需要培养阴性样本来确认细菌uti。

实施例5-尿和硼酸实验

通常在含有硼酸缓冲溶液的尿培养管中收集尿样，硼酸缓冲溶液可在将样本送至微生物实验室期间降低微生物生长。为了评价生长防腐剂对胍基丁胺产量的影响，将7株大肠杆菌(mg1665、atcc25922、esblatccbaa-196和4株临床分离株)接种至muellerhinton培养基，过夜培养，在具有或不具有防腐剂(硼酸，2.63mg/ml；硼酸钠，3.95mg/ml；甲酸钠，1.65mg/ml)的过滤除菌的尿中进行继代培养。在96孔板上按10⁵cfu/ml将细菌样本分别接种至培养基，在37℃、存在5％co2，静置培养。使用microskango平板读取器(thermoscientific，沃尔瑟姆，马塞诸塞州)监测生长(od600nm)。先对用于ms的样本进行离心(4200g，10分钟，4℃)以去掉微生物。然后，将上层清液在甲醇中按1:1稀释，-20℃储存。解冻样本，立即再次离心(4200g，10分钟，4℃)以便沉淀析出任何残留蛋白，用50％甲醇稀释至1:20的最终稀释度。在qexactive^tm高频质谱仪(thermoscientific，沃尔瑟姆，马塞诸塞州)分析样本。lc-ms分析显示，具有防腐剂的样本在培养时间之后的胍基丁胺浓度与接触防腐剂之前实际上是相同的；在整个培养过程中，在含有硼酸防腐剂溶液的样本中没有检测到显著的微生物生长或胍基丁胺生成，而在不包括防腐剂的样本中观察到了显著生长和胍基丁胺生成。因此，我们发现，超过符合临床实践的样本储存时间时，硼酸防腐剂溶液基本上抑制了微生物生长和胍基丁胺生成。可确定，标准尿样采集于硼酸管中不会影响样本中的胍基丁胺浓度。

实施例6–代谢偏好检测

采用代谢偏好检测来分析一批具有不同敏感性曲线的大肠杆菌阳性尿样。将这些样本中的细菌沉淀、洗涤并重新悬浮于等体积的muellerhinton培养基中。96孔板接种10％的洗涤细胞，存在或不存在临床相关浓度的抗生素条件下培养4小时，用lc-ms分析(图10)。基于代谢偏好检测的诊断近似地重现了通过传统培养方法报导的抗生素敏感性曲线。针对抗生素采用基于代谢偏好检测测定的断点与基于传统培养方法测定的断点大体上一致。代谢偏好检测策略在97％的样本中正确地确定了抗生素敏感性。

实施例7–胍基丁胺作为uti的指标

为了评估胍基丁胺作为uti预测指标的性能，对从艾伯塔公共实验室获得的519份尿样的数据组进行了分析。该数据显示天然胍基丁胺浓度与含有肠杆菌科的培养阳性样本联系密切(图11)。数据组中观察的11种肠杆菌科的种以2.1μm的中值浓度产生胍基丁胺，而在培养阴性样本中或被艾伯塔公共实验室划分为临床意义不确定的样本中不存在可检测的胍基丁胺(图11)。虽然大部分uti是由肠杆菌科引发的，但是小部分uti是其他微生物引起的。数据组包括了数量有限的这些有机体，其中都不产生可检测水平的胍基丁胺。使用数据组，计算出区分培养阴性样本与培养阳性样本的胍基丁胺诊断阈值是大约0.17μm。校正该阈值，对应于诊断肠杆菌科相关uti的大约97％特异性和94％灵敏性。

实施例8–从尿样固相提取胍基丁胺

按14,800g对溶于50％甲醇(1.2ml)的尿样进行离心5分钟。从这些样本，将800μl尿加入到200μl同位素稀释溶液中，该同位素稀释溶液是1μm[u-13c]胍基丁胺和100mm碳酸氢铵(ph8.0)溶于50％甲醇的溶液，其终浓度是200nm[u-13c]胍基丁胺和20mm碳酸氢铵。用400μlhplc-级甲醇随后400μl50％hplc-级甲醇/h2o预平衡thermoscientifichypersep硅96-孔板(25mg床体积，1ml柱容量)。平衡后，将1ml准备的样本加入到色谱柱并滴过(dripthrough)。接下来，用1mlhplc甲醇进行甲醇洗涤，随后用1mlhplc水进行水洗。洗涤步骤使用的所有溶液都借助离心力(20g，5min)穿过柱子。然后，通过加入250μl的99.9％甲醇与0.1％甲酸将柱子准备好。为了洗脱目标分子，使125μl有2％甲酸的h2o滴过柱子。加入碳酸氢铵(ph＝8.0)至终浓度100mm，以便在lc-ms/ms分析之前将溶液ph提高至ph>3.0。注意：第一组的196份样本包括100nm的13c胍基丁胺浓度和500μl的最终体积。

前面的描述和实施例能够使本领域技术人员更好的理解本发明。本发明并不限于这些描述和实施例，而是基于所附权利要求给出宽泛的解释。