一种提取毕赤酵母各生长时期总rna的改良方法

专利名称：一种提取毕赤酵母各生长时期总rna的改良方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学研究领域，为一种提取毕赤酵母各生长时期总RNA的改良方法。
背景技术：
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近年来发展起来的较为完善的，被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统，外源蛋白在毕赤酵母中的过量表达，经常伴随着其他基因表达水平的改变，通过分析相关基因表达水平的差异，便于找到影响外源蛋白表达量的关键问题，而基因表达水平的分析常常涉及到总RNA的提取。与其他细胞相比，毕赤酵母由于具有较坚固的细胞壁，尤其是处于稳定期的毕赤 酵母细胞，其细胞壁更厚、通透性差，这些因素都增加了总RNA的提取难度，而总RNA提取质量直接会影响后续基因表达水平测定的准确性。

发明内容
本发明的目的是提供一种提取毕赤酵母各生长时期总RNA的改良方法，用以解决分子研究中遇到的毕赤酵母细胞总RNA提取(尤其是稳定期总RNA的提取)困难的问题。毕赤酵母总RNA的提取，关键问题是细胞壁的去除，酵母生长的不同时期，其细胞壁的厚度会发生变化，一般稳定期较对数期的细胞壁要厚，这样就使稳定期总RNA的提取更加困难，但与基因组的提取不同，酵母总RNA提取之前的去壁处理不能用酶解法，因为此法需在37°C进行，该温度会使酵母中某些基因的转录情况发生改变。针对以上问题，本发明研究出了一种较为快速且适用于毕赤酵母各生长时期总RNA提取的改良方法，此法在总RNA提取的纯度与质量上都满足QRT-PCR的要求。本发明是在上海生工UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒的基础上进行改良，即在抽提前，对毕赤酵母细胞的破碎进行改良通过毕赤酵母细胞和酸洗玻璃珠在液氮条件下共研磨，使毕赤酵母细胞充分破碎，此破碎方法适合各生长时期的毕赤酵母细胞。然后再利用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒中的的Trizol试剂，进行抽提及后续操作，经过改良，提取的毕赤酵母总RNA，有清晰整齐的28SrRNA和18SrRNA条带，并且成2倍关系，表明此法提取的总RNA完整，再通过核酸浓度测定仪测定，0D26(i/0D28(i = I. 9 2. 0，表明纯度也满足要求，综上说明此法提取的总RNA质量满足QRT-PCR要求。本发明具体包括以下材料(I)毕赤酵母细胞破碎所需材料瓷研钵、液氮、酸洗玻璃珠(400nm)、Trizol试剂。(2)上海生工UNIQ-IO柱式Trizol总RNA抽提试剂盒组成为Trizol Reagent、RPE Solution、DEPC-treated ddH20、吸附柱和收集管。(3)其余试剂及耗材无水乙醇、氯仿、I. 5mL EP管、用O. 1% DEPC预处理的枪头和EP管。本发明具体实验步骤为
(I)取约I X IO7个待测毕赤酵母细胞(任何生长时期的细胞)于灭菌的I. 5mL EP管中，利用液氮法快速冷冻后冻存于_70°C冰箱。(2)先将瓷研钵用液氮预冷，然后倒入O. 3g酸洗玻璃珠。(3)向冻存的毕赤酵母细胞中加入50 μ L DEPC-treated ddH20，重悬菌体后转入加有酸洗玻璃珠的预冷瓷研钵中。(4)倒入适量液氮，使细胞和酸洗玻璃珠共研磨，直至酸洗玻璃珠磨至粉末(约5min)，此研磨过程液氮挥发尽后，需及时补加液氮，整个过程要一直保持低温状态。(5)研磨完毕后，向其中加入O. 5mL Trizol试剂,室温放置5min。(6)将研钵中所有物质转入1.5mLEP管中，用枪头吹打2min后，室温静置 5_10mino(7)后续实验步骤按上海生工UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒操作进行。本发明的主要优点(I)与hot acid phenol方法相比,此法适用于毕赤酵母各生长时期总RNA的提取，即使对于细胞壁很厚的稳定期细胞，此法仍然可以成功地提取出总RNA,提取结果稳定。(2)此法提取的总RNA质量好，有清晰整齐的28SrRNA和18SrRNA条带，并且成2倍关系，且满足OD26tZOD28tl在I. 8-2. I之间的纯度要求，较少出现降解情况。


图I :X-33和GSl 15毕赤酵母在72h和96h总RNA的提取结果。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。实施例1X-33和GSl 15毕赤酵母细胞在72h和96h总RNA的提取总RNA提取所需材料(I)毕赤酵母细胞破碎所需材料瓷研钵、液氮、酸洗玻璃珠(400nm)、Trizol试剂。(2)上海生工UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒组成为Trizol Reagent、RPE Solution、DEPC-treated ddH20、吸附柱和收集管。(3)其余试剂及耗材无水乙醇、氯仿、I. 5mL EP管、用O. 1% DEPC预处理的枪头和EP管。总RNA提取具体步骤为(I)分别取约1父107个乂-33(7211和9611)或GS115 (72h和96h)细胞于灭菌的
I.5mL EP管中，利用液氮法快速冷冻后冻存于_70°C冰箱。(2)先将瓷研钵用液氮预冷，然后倒入O. 3g酸洗玻璃珠。(3)向冻存的毕赤酵母细胞中加入50 μ L DEPC-treated ddH20，重悬菌体后转入加有酸洗玻璃珠的预冷瓷研钵中。(4)倒入适量液氮，使细胞和酸洗玻璃珠共研磨，直至酸洗玻璃珠磨至粉末(约5min)，此研磨过程液氮挥发尽后，需及时补加液氮，整个过程要一直保持低温状态。(5)研磨完毕后，向其中加入O. 5mL Trizol试剂,室温放置5min。(6)将研钵中所有物质转入I. 5mL EP管中，用枪头吹打2min后，室温静置5_10mino
(7)后续实验步骤按上海生工UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒操作进行。结果如图I 所示。其中 1-4 孔道分别为X-33-72h、X_33_96h、GS115_72h、GS115-96h的RNA提取结果。操作中还应注意I.在RNA提取的整个过程中，要防止RNase的污染(I)提取RNA所需的枪头和EP管和水，都需要O. I % DEPC进行预处理。(2)提取RNA的整个过程，需要佩戴手套和口罩，并且要常换，操作需要避免交叉 污染。(3)提取好的RNA要保存于_70°C冰箱中，并且避免反复冻融，以避免影响RNA的降解。(4)所有离心步骤均使用台式离心机，在4°C下进行离心。
权利要求
1.一种可以提取毕赤酵母各生长时期总RNA的改良方法，其特征在于包括以下材料(1)毕赤酵母细胞破碎所需材料瓷研钵、液氮、酸洗玻璃珠(400nm)、Trizol试剂。
(2)上海生工UNIQ-IO柱式Trizol总RNA抽提试剂盒组成为TrizolReagent、RPESolution、DEPC-treated ddH20、吸附柱和收集管。(3)其余试剂及耗材无水乙醇、氯仿、I.5mL EP管、0. I % DEPC预处理的枪头和EP管。
2.权利要求I所述的提取毕赤酵母各生长时期总RNA改良方法，其特征在于按如下步骤操作(1)取约IX IO7个待测毕赤酵母细胞(任何生长时期的细胞)于灭菌的I. 5mL EP管中，利用液氮法快速冷冻后冻存于_70°C冰箱。
(2)先将瓷研钵用液氮预冷，然后倒入0.3g酸洗玻璃珠。(3)向冻存的毕赤酵母细胞中加入50ii L DEPC-treated ddH20，重悬菌体后转入加有酸洗玻璃珠的预冷瓷研钵中。
(4)倒入适量液氮，使细胞和酸洗玻璃珠共研磨，直至酸洗玻璃珠磨至粉末(约5min)，此研磨过程液氮挥发尽后，需及时补加液氮，确保整个过程一直保持低温状态。
(5)研磨完毕后，向其中加入0.5mLTrizol试剂,室温放置5min。(6)将研钵中所有物质转入I.5mLEP管中，用枪头吹打2min后，室温静置5_10min。
(7)后续实验步骤按上海生工UNIQ-IO柱式Trizol总RNA抽提试剂盒操作进行。
全文摘要
本发明涉及分子生物学领域，为一种提取毕赤酵母各生长时期总RNA的改良方法，用以解决分子研究中遇到的毕赤酵母细胞总RNA提取困难的问题。本发明是在上海生工UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒的基础上进行改良，与hot acid phenol提取总RNA的方法相比，此法适用于毕赤酵母各生长时期总RNA的提取，即使对于细胞壁很厚的稳定期细胞，此法仍然可以成功地提取出总RNA，提取结果稳定；再有此法提取的总RNA质量好，有清晰整齐的28SrRNA和18SrRNA条带，并且成2倍关系，还有满足OD260/OD280在1.8-2.1之间的纯度要求，较少出现降解情况，满足QRT-PCR测定的要求。
文档编号C12N15/10GK102965366SQ20121048775
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月27日 优先权日2012年11月27日
发明者刘立明, 龚香艺, 马冬玲, 王蒙, 冯斌 申请人:江南大学