本发明涉及一种快速批量提取鱼组织总RNA的方法，尤其是一种适合快速批量提取鱼组织总RNA的方法，属于鱼类RNA提取技术领域。
背景技术：
总RNA提取技术是分子生物学的基础实验技术之一。纯度高、完整性好的总RNA是进行基因克隆、基因表达、基因功能分析等研究的必要前提。目前试验室常用的总RNA提取技术是低温匀浆后Trizol法提取。低温匀浆一般采用液氮研磨法、手动或电动匀浆器研磨法。液氮研磨法处理样品时，由于液氮极易挥发，研磨过程中需要持续地向研钵中添加液氮，耗费时间长，操作不方便，存在安全隐患。手动或者电动匀浆器研磨法要求在冰上完成，防止样品过热引起RNA降解。但是实践中极易引起样品局部温度升高。并且，两者的共同不足之处在于（1）每次只能处理一个样品，无法批量操作；（2）损耗部分样品，这对于初始样品量少的试验影响大；（3）处理过程中样品位于开放容器中，容易引起样品污染。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种适合快速批量提取鱼组织总RNA的方法，既实现样品批量操作，又能降低样品损耗和污染。
按照本发明提供的技术方案，一种快速批量提取鱼组织总RNA的方法，步骤如下：
（1）处理前准备：取研磨珠，用乙醇溶液浸泡15-30分钟后晾干；取若干2mL冻存管，每个冻存管中均添加研磨珠，并加入1mL Trizol；
（2）鱼的前处理：解剖鱼，取得鱼组织20-100mg，经焦碳酸二乙酯DEPC处理过的水漂洗后，剪碎组织块，迅速投入步骤（1）处理过的冻存管中，旋上管盖，投入液氮冷冻；
（3）研磨：取步骤（2）处理后的样品1-50个，装入高通量组织研磨仪，以100-120次/分的速度研磨5-10分钟；
（4）离心：取步骤（3）处理后的若干样品室温放置4-6分钟，分别转移至1.5mL的离心管中，每支离心管加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15-30秒，室温放置2-4分钟；2-8℃、10000×g离心14-16分钟；
（5）二次离心：取步骤（4）所得上清液转移到新管中，加入等量异丙醇，室温放置10分钟；2-8℃、10000×g离心10分钟，移去上清，得到RNA沉淀；
（6）干燥：用1mL乙醇溶液洗涤步骤（5）所得RNA沉淀，2-8℃、7500×g离心5分钟，弃去上清，得到RNA沉淀；
（7）溶解：室温放置干燥或真空抽干步骤（6）所得RNA沉淀，加入20-200μL无RNase的水，-70℃保存。
所述乙醇溶液的质量浓度为70%-75%。
步骤（1）所述研磨珠为2mm的氧化锆珠，每个2mL冻存管中加入研磨珠2-4颗。
本发明的有益效果：本发明将样品、研磨珠和Trizol加入冷冻管中，经液氮冷冻以后装入高通量研磨仪中处理，一方面保证样品研磨过程中始终处于Trizol保护和低温状态，双重保护RNA防止降解；另一方面，相比于液体状态下（手动或者电动匀浆器匀浆）匀浆，低温干磨能缩短匀浆时间、匀浆更彻底。同时，研磨过程中样品始终在封闭的冻存管中，基本无样品损耗，因此本发明对初始样品量要求低，适于微量组织样品的总RNA提取。最后，本发明可同时研磨1-50个样品，实现样品的批量处理，大大缩短了试验时间。
附图说明
图1是实施例1对提取罗非鱼肝总RNA后进行琼脂糖电泳后的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
以下实施例中液氮和Trizol均为市场上采购的常规产品。
实施例1 采用从罗非鱼分离的肝作为样品，具体包括以下工艺步骤：
（1）处理前准备：取研磨珠，用乙醇溶液浸泡15分钟后晾干；取若干2mL冻存管，每个冻存管中均添加研磨珠，并加入1mL Trizol；
（2）鱼的前处理：解剖鱼，取得鱼组织30mg，经焦碳酸二乙酯DEPC处理过的水漂洗后，剪碎组织块，迅速投入步骤（1）处理过的冻存管中，旋上管盖，投入液氮冷冻；
（3）研磨：取步骤（2）处理后的样品6个，装入高通量组织研磨仪，以100次/分的速度研磨7分钟；
（4）离心：取步骤（3）处理后的样品室温放置6分钟，随后转移至1.5mL的离心管中，每支离心管加入0.2mL氯仿，剧烈振荡30秒，室温放置4分钟；4℃、10000×g离心16分钟；
（5）二次离心：取步骤（4）所得上清液转移到新管中，加入等量异丙醇，室温放置10分钟；随后在4℃、10000×g离心10分钟，移去上清，得到RNA沉淀；
（6）干燥：用1mL乙醇溶液洗涤步骤（5）所得RNA沉淀，4℃、7500×g离心5分钟，弃去上清，得到RNA沉淀；
（7）保存：室温放置干燥或真空抽干步骤（6）所得RNA沉淀，加入30μL无RNase的水，-70℃保存。
所述乙醇溶液的质量浓度为70%。
步骤（1）所述研磨珠为2mm的氧化锆珠，每个2mL冻存管中加入研磨珠2颗。
实施例2采用从罗非鱼分离的头肾组织作为样品，具体包括以下工艺步骤：
（1）处理前准备：取研磨珠，用乙醇溶液浸泡30分钟后晾干；取若干2mL冻存管，每个冻存管中均添加研磨珠，并加入1mL Trizol；
（2）鱼的前处理：解剖鱼，取得鱼组织70 mg，经焦碳酸二乙酯DEPC处理过的水漂洗后，剪碎组织块，迅速投入步骤（1）处理过的冻存管中，旋上管盖，投入液氮冷冻；
（3）研磨：取步骤（2）处理后的样品40个，装入高通量组织研磨仪，以120次/分的速度研磨6分钟；
（4）离心：取步骤（3）处理后的样品室温放置4分钟，转移至1.5mL的离心管中，每支离心管加入0.2mL氯仿，剧烈振荡20秒，室温放置2分钟；4℃、10000×g离心15分钟；
（5）二次离心：取步骤（4）所得上清液转移到新管中，加入等量异丙醇，室温放置10分钟； 4℃、10000×g离心10分钟，移去上清，得到RNA沉淀；
（6）干燥：用1mL乙醇溶液洗涤步骤（5）所得RNA沉淀，4℃、7500×g离心5分钟，弃去上清，得到RNA沉淀；
（7）溶解：室温放置干燥或真空抽干步骤（6）所得RNA沉淀，加入50μL无RNase的水，-70℃保存。
所述乙醇溶液的质量浓度为75%。
步骤（1）所述研磨珠为2mm的氧化锆珠，每个2mL冻存管中加入研磨珠3颗。
实施例3采用从罗非鱼分离的肌肉组织作为样品，具体包括以下工艺步骤：
（1）处理前准备：取研磨珠，用乙醇溶液浸泡30分钟后晾干；取若干2mL冻存管，每个冻存管中均添加研磨珠，并加入1mL Trizol；
（2）鱼的前处理：解剖鱼，取得鱼组织90mg，经焦碳酸二乙酯DEPC处理过的水漂洗后，剪碎组织块，迅速投入步骤（1）处理过的冻存管中，旋上管盖，投入液氮冷冻；
（3）研磨：取步骤（2）处理后的样品50个，装入高通量组织研磨仪，以120次/分的速度研磨10分钟；
（4）离心：取步骤（3）处理后的样品室温放置4分钟，转移至1.5mL的离心管中，每支离心管加入0.2mL氯仿，剧烈振荡30秒，室温放置2分钟；4℃、10000×g离心15分钟；
（5）二次离心：取步骤（4）所得上清液转移到新管中，加入等量异丙醇，室温放置10分钟； 4℃、10000×g离心10分钟，移去上清，得到RNA沉淀；
（6）干燥：用1mL乙醇溶液洗涤步骤（5）所得RNA沉淀，4℃、7500×g离心5分钟，弃去上清，得到RNA沉淀；
（7）溶解：室温放置干燥或真空抽干步骤（6）所得RNA沉淀，加入60μL无RNase的水，-70℃保存。
所述乙醇溶液的质量浓度为75%。
步骤（1）所述研磨珠为2mm的氧化锆珠，每个2mL冻存管中加入研磨珠4颗。