基于免疫沉淀法的从水稻中提取多聚核糖体的方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学【技术领域】，具体为一种基于免疫沉淀法的从水稻中提取多聚核糖体的方法。本发明以免疫法为主，使用亲和层析的方法富集Flag标签标记的核糖体-mRNA复合物，选用EGTA螯合组织匀浆液中的其它金属离子，并加入氯霉素和放线菌酮抑制核糖体和mRNA的解离，其中改进抽提溶液和洗脱溶液配方、材料匀浆和浓缩方式，使用终浓度为0.1M的EDTA洗脱核糖体-mRNA复合物。本发明预期将分离2-4个重要的参与低温胁迫的新功能基因，为低温胁迫下的植物生长正常进行以及繁衍提供保障，最终在产量建成上发挥重要作用。
【专利说明】基于免疫沉淀法的从水稻中提取多聚核糖体的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学【技术领域】，具体涉及一种从水稻中提取多聚核糖体的方法。
【背景技术】
[0002]多聚核糖体是指合成蛋白质时,多个甚至几十个核糖体串联附着在一条mRNA分子上，形成的似念珠状结构。在合成多蛋白质时，核糖体并不是单独工作的，常以多聚核糖体的形式存在。在mRNA的起始密码子部位，核糖体亚基装配成完整的起始复合物，然后向mRNA的3’端移动，直到到达终止密码子处。当第一个核糖体离开起始密码子后，空出的起始密码子的位置足够与另一个核糖体结合时，第二个核糖体的小亚基就会结合上来，并装配成完整的起始复合物，开始蛋白质的合成。同样，第三个核糖体、第四个核糖体，依次结合到mRNA上形成多聚核糖体。在生物体将mRNA中的遗传信息翻译成有功能的蛋白质的过程里，该复合物起到了关键的作用。不同于转录组所体现的全部转录的总RNA包含了全部的翻译与非翻译的RNA，多聚核糖体中所结合的RNA全部都是会被最终翻译成蛋白质的mRNA，其分析结果将在转录组与蛋白组之间架起桥梁。
[0003]1963年，Warner等发现了细胞内的多聚核糖体的结构。2003年，Arava等利用多聚核糖体芯片技术研究了酵母全基因组范围内的mRNA翻译谱。随着二代测序技术的深入发展，Ingolia等基于核糖体保护的mRNA不被核糖核酸酶所降解而保留下来，而裸露的mRNA被消化的原理，获得基因组范围内核糖体覆盖的mRNA片段，并对这些片段进行深度测序，从而提出了全基因组范围内分析核糖体的分布情况，同时可以进一步在单核苷酸水平上分析蛋白质翻译事件的核糖体谱技术。可见多聚核糖体技术的产生和不断发展为蛋白质翻译事件、蛋白质组学、microRNA的作用原理以及分子机理研究提供了另一个维度上重要并且精确的手段。而精确高效地提取生物组织中的多聚核糖体是开展上述研究和分析的重要基础。
[0004]1998年有文献报道用镁离子沉淀多聚核糖体，只提取细胞质RNA。这样既减少了提取的总RNA中的其它成分，特别是核前体RNA和细胞器RNA的干扰，同时也浓缩了细胞中的mRNA。但本方法适合细胞来源较少时提取多聚核糖体。
[0005]目前使用较广泛的提取多聚核糖体的方法主要分为蔗糖密度梯度离心法和免疫沉淀法。蔗糖密度梯度离心法主要在对细胞进行破碎、过滤之后，将匀浆液加入蔗糖密度梯度溶液中，并使用超速离心仪进行离心分离。该方法虽然收率较高，但有着设备要求高，操作复杂的缺点。有文献报道使用垂直转头密度梯度超速离心法，快速分级分离多聚核糖体，但对仪器设备要求同样较高。
[0006] 现有的免疫沉淀法在植物中的拟南芥中有应用，但该方法由于提取液配方的原因导致收率较低，不适合做后续的深入研究。而且有关从水稻组织中提取多聚核糖体的报道并不多，方法也不成熟，因此需要对提取水稻组织中提取多聚核糖体的方法进行改良。
【发明内容】
[0007]本发明针对现有技术存在的上述不足，提出了一种基于免疫沉淀法的从水稻中提取多聚核糖体的方法，以解决以往提取多聚核糖体时对实验设备要求高，操作过程复杂，并且产物收率较低的问题。
[0008]本发明提出的基于免疫沉淀法的从水稻中提取多聚核糖体的方法，涉及一种过表达融合了 Flag标签的核糖体蛋白RPL18的水稻植株，在此转基因植物体内得到Flag标签标记的核糖体-mRNA复合物，从而可以使用亲和层析的方法将此复合物富集起来。
[0009]具体步骤如下:
(一)首先，确定需要过表达的基因和水稻宿主。
[0010]所述的融合Flag标签的核糖体蛋白RPL18在水稻中有6个基因编码，其中3 个属 RPL18A，另外三个属 RPL18B，选取 0sRPL18Bl (0s03g0341100) (SEQ.1D.N0.1)、0sRPL18B2 (0s05g0155100) (SEQ.1D.N0.2)两个基因添加标签。[0011]所述的水稻宿主为日本晴。
[0012]其次，构建植物表达载体，并转化水稻。
[0013]所述的过表达植株通过构建融合Flag标签的0sRPL18Bl (0s03g0341100)、0sRPL18B2(0s05g0155100)植物表达载体，分别转入水稻日本晴中，以使融合蛋白在35S启动子及Ω-HF增强子的启动下实现过表达。
[0014]然后，鉴定过表达植物中的核糖体-mRNA复合物。
[0015]所述的Flag标签标记的核糖体-mRNA复合物通过对获得的转基因株系进行⑶S染色及western blot鉴定。
[0016](二)以免疫法为主，使用亲和层析的方法富集Flag标签标记的核糖体-mRNA复合物，即选用EGTA螯合组织匀浆液中的其它金属离子，并加入氯霉素和放线菌酮抑制核糖体和mRNA的解离。其中，改进抽提溶液和洗脱溶液配方、材料匀浆和浓缩方式，使用终浓度为
0.1M的EDTA洗脱核糖体-mRNA复合物。具体步骤为:
首先，进行植物组织的破碎。所有实验器具均需保证没有RNA酶污染，并尽量保持冰上或4°C下操作。所述的材料匀浆要求加入材料二倍体积的PEB于液氮研磨的材料粉末之中，并在液氣中共研。
[0017]所述的EGTA螯合剂保持溶液中高浓度的镁离子状态，配制母液0.5M EGTA，用NaOH 调至 ρΗ8.0。
[0018]所述的氯霉素和放线菌酮能够有效抑制核糖体和mRNA的解离,配制母液50mg/mL放线菌酮(Cycloheximide),乙醇溶解；50mg/mL氯霉素(Chloramphenicol),乙醇溶解。
[0019]其次，使用亲和层析的方法富集多聚核糖体，所述的匀浆、浓缩要求后续体系中没有DTT和低去垢剂含量，使用超滤的方法将抽提溶液逐步置换为Wash溶液。同时，超滤也去除了一部分低分子量的成分，减少了杂质。
[0020]原来抽提溶液体系内含有大量的内源RNase却没有任何抑制RNase的成分，因此对操作要求高，本发明进行了改进，加入终浓度20U/ml的RNAsin，可减少RNA的降解。
[0021]所述的Wash溶液也是体系与Flag beads结合时的溶液,而Flag beads在有DTT存在的体系中易被还原破坏，因此在本发明配方中除去DTT成分，仅靠PMSF来防止蛋白质降解。[0022]最后，将富集的多聚核糖体上的mRNA洗脱下来，在高浓度EDTA的存在下，由于镁离子被结合，核糖体-RNA复合物会发生解离。因此可以用该方法低成本地得到RNA。从洗脱液中提取mRNA并鉴定洗脱效率和收率。
[0023]所述的洗脱液为终浓度0.1M EDTA,配制母液0.5M EDTA,用NaOH调至pH8.0。
[0024]本发明预期将分离2-4个重要的参与低温胁迫的新功能基因，为低温胁迫下的植物生长正常进行以及繁衍提供保障，最终在产量建成上发挥重要作用。
[0025]本发明研究内容获国家有关部门的资助，项目名称:
基因克隆新技术和新方法研究基于多聚核糖体技术克隆响应非生物胁迫的植物生殖发育的新功能基因研究编号:2013ZX08009-001-008。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为本发明的水稻及拟南芥中RPL18蛋白的聚类分析示意图。
[0027]图2为本发明的0sRPL18Bl及0sRPL18B2载体结构示意图。
[0028]图3为本发明的转基因株系⑶S染色鉴定示意图。
[0029]图4为本发明的转基因株系western blot验证示意图。
[0030]图5为本发明的最终提取的RNA对Actin基因的定量PCR，不同洗脱效率对比示意图。
【具体实施方式】
[0031]下面结合实施例对本发明的方法做进一步详细说明，但本发明的保护范围，不限于下述的实施例。
[0032]在普通免疫法中，通过过表达融合了 Flag标签的核糖体蛋白RPL18，可以在植物体内得到Flag标签标记的核糖体-mRNA复合物，从而可以使用亲和层析的方法将此复合物富集起来。
[0033]实施例1
融合 Flag 标签的 0sRPL18Bl(0s03g0341100)、0sRPL18B2 (0s05g0155100)植物表达载体的构建，水稻中编码RPL18蛋白的基因有6个，其中3个属RPL18A，另外3个属RPL18B，本发明选取了 0sRPL18Bl(0s03g0341100)、0sRPL18B2 (0s05g0155100)两个基因添加标签，
进行进一步的实验(图1)。
[0034]我们构建了融合Flag 标签的 0sRPL18Bl(0s03g0341100)、0sRPL18B2(0s05g0155100)的植物表达载体，并分别转入水稻日本晴中，以使融合蛋白在35S启动子及Ω-HF增强子的启动下进行过表达(图2)。
[0035]实施例2转基因株系的分子鉴定
由于我们需要尽可能多地在转基因株系中获得具有标签的核糖体-mRNA复合物，因此对获得的转基因株系进行了⑶S染色及western blot鉴定并挑选融合蛋白表达量较高的株系进行进一步的研究。
[0036]通过⑶S染色(图3)和western blot (图4)鉴定，我们选取了 Bl-13、B1-29、B2-26、B2-38四个株系进行接下来的实验。
[0037]实施例3多聚核糖体的提取核糖体在高镁离子的存在下能够保持与mRNA的结合状态，因此选用EGTA螯合组织匀浆液中的其它金属离子；加入氯霉素和放线菌酮也能够抑制核糖体和mRNA的解离。
[0038]所有实验器具均需保证没有RNA酶污染，可根据材质不同使用160°C 4h干灭，
0.1%DEPC或10%过氧化氢浸泡并高压灭菌的方法去除RNA酶。非醇类溶解的溶液需用RNasefree的milliQ水配制。在实验中，尽量保持冰上或4°C下操作。
[0039]I)植物组织的破碎
以下实验中，每半小时在当时体系中添加1%体积的0.1M PMSF ；
加入二倍体积之PEB于液氮研磨的材料粉末之中与液氮共研(至少2ml样品)。将原有文献报道中的玻璃匀浆器混匀，改进为在液氮中共研；
冰上冻融；
4°C, 16000g 离心 15min ；
取上清至新管，用miracloth滤尽残洛；
200 μ I用作抽提总RNA对照及测量0D260。
[0040]2)亲和层析富集多聚核糖体
(1)悬浮aFLAG beads,吸40 μ I于新1.5ml管子中；
(2)加Iml Wash溶液重悬；
(3)8200g离心Imin,弃上清；
(4)重复上述2-3步骤，共3次；
以下实验中，每半小时在当时体系中添加1%体积的0.1M PMSF。由于后续体系中要求没有DTT和低去垢剂含量，因此增加了匀浆液浓缩这一步骤。使用超滤的方法将抽提溶液逐步置换为Wash溶液。同时，超滤也去除了一部分低分子量的成分，减少了杂质，这些为本发明改进之一；
(5)将抽提液加入30kDa的超滤透析管中，加入等体积的Wash溶液，5000g离心5min ；
(6)弃去滤液，在管中再次加入Wash溶液，并于5000g离心5min；
(7)重复步骤6，2次(可5000g离心浓缩体系至2ml左右)；
(8)取抽提液于新15ml离心管中，加入洗好的aFLag beads ；
(9)在旋转混匀仪上4°C孵育2h；
(10)8200g 离心 lmin,4°C ；
(11)上清为未结合部分，可移至新管备用；
(12)沉淀中加入6mlWash溶液，慢摇，4°C5min ；
(13)8200g 离心 lmin, 4°C ；
(14)弃上清,加入6mlWash溶液，慢摇4°C 5min ；
(15)重复步骤13-14两次；
(16)8200g离心lmin, 4°C,弃上清,沉淀转移至1.5ml离心管。
[0041]3)配制母液和工作液 母液:
2M Tris-HCl, pH9.0 (12.41g Tris; 840 μ I 浓 HCl;定容至 50ml)；
2M KCl ；0.5M EGTA,用 NaOH 调至 ρΗ8.0 (3.8g EGTA; 1.05g NaOH ;定容至 20ml)；
0.5M EDTA,用 NaOH 调至 ρΗ8.0 ；
IM MgCl2 ；
20% PTE ；
10% DOC ；
20% 去垢混合液:20% Brij-35; 20% Triton X-100; 20% NP-40; 20% Tween 20 ；
以上需高压灭菌，常温保存；
0.5g/mL 肝素；
0.5g/ml DTT (3.24M)；
50mg/mL放线菌酮Cycloheximide,乙醇溶解；
50mg/mL 氣霉素 Chloramphenicol,乙醇溶解；
0.1M PMSF，异丙醇溶解(不少于5ml)；
以上过滤除菌，_20°C保存；
8M盐酸胍，DEPC水配制。
[0042]工作液:
PEB抽提溶液
抽提溶液在使用中，体系内含有大量的内源RNase却没有任何抑制RNase的成分，因此对操作要求高，本实验进行了改进，加入一定的RNAsin,减少RNA的降解。
【权利要求】
1.一种基于免疫沉淀法的从水稻中提取多聚核糖体的方法，其特征在于具体步骤为: (1)首先，构建融合Flag标签的核糖体蛋白RPL18的过表达水稻植株，在此转基因植物体内得到Flag标签标记的核糖体-mRNA复合物； 其中，所述的融合Flag标签的核糖体蛋白RPL18在水稻中有6个基因编码，其中3个属 RPL18A，另外 3 个属 RPL18B，选取 OsRPL18Bl (0s03g0341100)、0sRPL18B2 (0s05g0155100)两个基因添加标签； 所述的过表达植株通过构建融合Flag标签的OsRPL18Bl (0s03g0341100)、.0sRPL18B2(0s05g0155100)植物表达载体，分别转入水稻日本晴中，以使融合蛋白在35S启动子及Ω-HF增强子的启动下实现过表达； (2)其次，使用亲和层析方法，将此Flag标签标记的核糖体-mRNA复合物富集起来，具体是选用EGTA螯合组织匀浆液中的其它金属离子，并加入氯霉素和放线菌酮抑制核糖体和mRNA的解离；其中，改进抽提溶液和洗脱溶液配方、材料匀浆和浓缩方式，使用终浓度为.0.1M的EDTA洗脱核糖体-mRNA复合物；具体步骤为: 首先，进行植物组织的破碎，所用的材料匀浆要求加入材料二倍体积的PEB于液氮研磨的材料粉末之中，并在液氮中共研； 所述的EGTA螯合剂保持溶液中高浓度的镁离子状态，配制母液0.5M EGTA，用NaOH调至 pH8.0 ； 所述的氯霉素和放线菌酮能够有效抑制核糖体和mRNA的解离,配制母液50mg/mL放线菌酮，乙醇溶解；50mg/mL氯霉素，乙醇溶解； 其次，用亲和层析的方法富集多聚核糖体，使用超滤的方法将抽提溶液逐步置换为Wash溶液；同时，超滤也去除一部分低分子量的成分，减少了杂质； 在抽提溶液体系中，加入终浓度为20U/ml的RNAsin ； 所述的Wash溶液也是体系与Flag beads结合时的溶液，配方中除去DTT成分，仅靠PMSF来防止蛋白质降解； 最后，将富集的多聚核糖体上的mRNA洗脱下来，在高浓度EDTA的存在下，由于镁离子被结合，核糖体-RNA复合物会发生解离；
洗脱用的洗脱液为终浓度0.1M EDTA,配制母液0.5M EDTA,用NaOH调至pH8.0。
【文档编号】C12N15/10GK103911368SQ201410122208
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月30日 优先权日:2014年3月30日
【发明者】明凤, 王尧峰, 奚丹丹, 罗莉琼, 沈佳斌 申请人:复旦大学