一种rna的制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种RNA的制备方法，通过将线性DNA模板在短链DNA和DNA连接酶的作用下连接成环，形成环状DNA；利用RNA聚合酶，以滚环扩增的形式合成出长链RNA，含有所需RNA序列的串联重复序列；最后利用特异性的核酸序列和其它酶或者化合物，将串联产物在特异性位点切割，生成所需序列。本发明RNA合成过程更加简洁、高效，并且合成的RNA序列具有高忠实度，过程中大大减少原料浪费，对于产物不需要再进行冗繁的修饰切割，更加经济，尤其适用于大量小RNA的合成。
【专利说明】一种RNA的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物【技术领域】，尤其涉及一种RNA的制备方法。
【背景技术】
[0002]现有RNA合成技术均采用固相化学合成，与DNA的合成相比，需要对2’-OH进行特殊的保护，在合成结束后，统一再对2’ -OH进行脱保护，这样造成了较高的RNA合成成本。同时，RNA序列在合成过程中，每添加一个核糖核酸，最优产物转化率也仅在97~99%之间，对于长RNA序列，例如，IOOntRNA,收率一般在10%以下，对核糖核苷酸原料是一种浪费。
[0003]除了固相化学合成外，现有RNA合成技术还包括启动子引发的酶法RNA合成，该方法虽然能克服化学合成存在的一些固有问题，但是其合成必须依赖双链DNA形式的启动子序列，并且对RNA序列的合成具有偏好性,5 ’端富含嘌呤的RNA合成效率远高于不含嘌呤序列。同时，启动子依赖的酶法RNA制备需使用DNAzyme等酶切初级产物，DNAzyme的切割也有序列偏好性，能切割的RNA序列有限，因此可以用该方法合成的RNA种类也有限。此外，DNAzyme切割的效率不及蛋白酶，且容易受催化微环境的影响。以上的问题阻碍了启动子依赖的酶法RNA制备作为化学合成RNA的代替方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种RNA的制备方法，旨在解决现有技术所存在的问题与不足。
[0005]本发明是这样实现的，一种RNA的制备方法，包括以下步骤:
[0006](I)设计与目的RNA互补的c`DNA，将所述cDNA在短链DNA和DNA连接酶的作用下连接成环，形成环状DNA;
[0007](2)利用RNA聚合酶，以滚环扩增的形式合成出长链RNA，该长链RNA含有所需RNA序列的串联重复序列；
[0008](3)利用特异性的核酸序列和其它酶或者化合物，将串联产物在特异性位点切割，生成所需序列。
[0009]优选地，在步骤(1)中，所述短链DNA序列和cDNA链的首尾序列进行碱基互补配对，并使cDNA首尾相接，形成环状cDNA。
[0010]优选地，所述短链DNA长度为11~15nt。
[0011]优选地，在步骤(2)中，所述RNA聚合酶为T7RNA聚合酶、E.coliRNA聚合酶或Syn5RNA聚合酶。
[0012]优选地，在步骤(3)中，所述特异性的核酸序列为氧甲基化修饰的短链DNA序列，所述DNA序列同RNA产物在预期位置互补配对结合，并在RNaseH的作用下，在特定位点切割RNA，得到目的RNA序列。
[0013]本发明克服现有技术的不足，提供一种RNA的制备方法，通过将线性cDNA模板在短链DNA和DNA连接酶的作用下连接成环，形成环状cDNA ;利用RNA聚合酶，以滚环扩增的形式合成出长链RNA，含有所需RNA序列的串联重复序列；最后利用特异性的核酸序列和其它酶或者化合物，将串联产物在特异性位点切割，生成所需序列。
[0014]在本发明中通过将滚环扩增(RCA)与RNaseH酶切技术结合来制备RNA，其中，RCA是以环状DNA为模板，通过一个短的DNA/RNA引物(与部分环状模板互补)，在酶催化下将NTPs转变成单链核糖核酸，产物单链包含成百上千个重复的模板互补片段。这种方法可以直接扩增合成单链的RNA。RCA以往多用于信号扩增检测目标核酸分子，但由于其产生单链的特性，可以用来合成制备RNA。RCA扩增的产物为单链的RNA，是模板cDNA的互补序列。通常情况下，RCA可以将模板扩增IO3~IO4倍，产物均为串联重复序列。在此基础上，结合RNA聚合酶作用下的滚环扩增和特异性RNA剪切的方法生产所需RNA，扩增效率可以达到IO4 ~105。
[0015]本发明采用环状DNA模板进行扩增合成，不需要再制备双链DNA形式的启动子序列以引发扩增。同时，滚环扩增的产物为长链的目的RNA的串联重复序列，克服了 RNA聚合酶5'选择性和3'末端随机添加I~2nt碱基的缺点。同时，对产物可以选用多种方法进行切割。其中利用修饰的核酸序列同RNaseH联合进行RNA的特异性切割，对RNA的切割没有序列限制，可以根据要求合成任何序列的RNA。同时RNaseH的催化效率较高，并且不易受pH、温度和体系离子强度的影响。
[0016]因此，本发明RNA合成过程更加简洁、高效，并且合成的RNA序列具有高忠实度，过程中不产生原料浪费，对于产物不需要再进行冗繁的修饰，更加经济，尤其适用于大量小RNA的合成。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1是本发明的RNA的制备方法的全部步骤示意图；
[0018]图2是本发明实施例中线性cDNA成环原理示意图；
[0019]图3是本发明实施例中短链DNA的结构与成环原理示意图；
[0020]图4是本发明实施例中RCA转录扩增原理示意图；
[0021]图5A是本发明实施例中本发明实施例中RNaseH特异切割长链RNA原理示意图，5B为RNaseH特异切割序列的细节图。
【具体实施方式】
[0022]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0023]实施例
[0024]一种RNA的制备方法，如图1所示，包括以下步骤:
[0025]步骤(1):设计与目的RNA互补的cDNA，将所述cDNA在短链DNA和DNA连接酶的作用下连接成环，形成环状cDNA ；
[0026](2):环状cDNA模板在T7RNA聚合酶的作用下，以短链DNA为引物，引发滚环转录扩增，形成由目标RNA组成的串联重复的长链RNA ；
[0027](3):利用RNaseH和氧甲基修饰的短链DNA联合，在特异位点目标对长链RNA进行切割；
[0028](4):经过切割的RNA长链，得到目的RNA序列，其分子数是模板cDNA的IO4~IO5倍。
[0029]在步骤(1)中，如图2所示，更具体包括以下步骤:
[0030](a)设计并合成与目标RNA互补的cDNA模板，以及成环所需要的短链DNA序列，cDNA的5'端进行磷酸化修饰，以便于连接酶进行连接；
[0031](b)将cDNA与成环所需要的短链DNA混合，在T4DNA连接酶的作用下，将链状cDNA模板首尾相连，形成环状cDNA模板。
[0032]其中，短链DNA序列长度为11~15nt，且短链DNA序列和cDNA链的首尾序列进行碱基互补配对，并使cDNA首尾相接，形成环状cDNA。在实际应用过程中，短链DNA序列长度没有特别限制，只要能够使cDNA首尾相接成并稳定成环的序列，都可以作为短链DNA。短链DNA的结构与成环原理如下图3所示，其中，黑色字体部分序列即为短链DNA的一种，其能够同cDNA灰色的首尾(下滑线所示)互补，在DNA连接酶的作用下将cDNA连接成环状，同时其3’端-OH也作为RNA聚合酶的起始合成位点，引发转录。
[0033]步骤(2):利用RNA聚合酶，以滚环扩增的形式合成出长链RNA，该长链RNA是所需RNA序列组成的串联重复序列；
[0034]在步骤(2)中，如图4所示，连接好的环状cDNA为扩增合成RNA的模板，同时短链DNA退火与环状模板成局部的双链，其3’ -OH作为扩增引发的起始位点。在体系中加入T7RNA聚合酶、NTPs、RNA酶抑制剂，以环状cDNA为模板起始转录。T7RNA聚合酶以环状cDNA为模板，严格按照碱基互补配对原则，将NTPs参入到RNA链中。RNA聚合酶沿着模板工作一轮，合成一个单位的RNA。由于T7RNA酶具有的链置换能力，每进行一轮扩增，就会将上一轮存在于cDNA模板上的RNA置换下来,循环往复，最终合成的长链RNA,是由多个同模板cDNA互补的RNA单位重复串联所组成，重复次数为IO4~IO5次左右。
[0035]步骤(3)利用特异性的核酸序列和其它酶或者化合物，将串联产物在特异性位点切割，生成所需序列。
[0036]在步骤(3)中，更具体的，在步骤(2)合成长链RNA结束以后，需要对产物进行切害I]，以便获得所需要长度的RNA。切割RNA有多种选择，包括:
[0037](a) RNaseH联合氧甲基化修饰的短链DNA序列；
[0038](b)镧系金属离子联合修饰的DNA;
[0039](c)氨基修饰的环己烷化合物可以用来切割含有环结构的RNA ；
[0040](d) DNAzyme 切割。
[0041 ] 经过切割的RNA长链，得到目的RNA序列，其分子数是模板cDNA的104~105倍。
[0042]以下例举一种具体实施方案:如图5所示，其中，黑色线条表示转录扩增的长链RNA，由多个单位重复串联组成，图5A中，利用氧甲基修饰的短链DNA序列，退火结合到长链RNA单位的相连部位，为RNaseH提供识别结合的位点并指导RNaseH特异性的切割RNA。图5B为氧甲基修饰短链DNA序列同切割位点结合的细节图。下划线标出序列的核苷酸进行氧甲基修饰，其余普通DNA序列，修饰短链序列特异的结合到长链RNA上，同时指导RNaseH，在箭头所指位置(UG之间)进行切割，所获得的产物便为目的RNA。经过RNaseH切割以后，长链RNA被切割成预期长短的RNA，并且该RNA在5'端带有磷酸基团，同天然的小RNA结构完全一致。而化学合成的RNA5'端为-OH，通常在需要磷酸化的情况下，用化学法添加磷酸基团成本会增加很多。使用本方法，具有自动磷酸化RNA的功能。酶切过后经过高效液相色谱的分离，纯化，和冷冻干燥，就能得到同天然状态完全一致的RNA。
[0043]相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果:本发明RNA合成过程更加简洁、高效，并且合成的RNA序列具有高忠实度，过程中大大减少原料浪费，对于产物不需要再进行冗繁的修饰切割，更加经济，尤其适用于大量小RNA的合成。
[0044]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作 的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种RNA的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)设计与目的RNA互补的cDNA，将所述cDNA在短链DNA和DNA连接酶的作用下连接成环，形成环状cDNA ； (2)利用RNA聚合酶，以滚环扩增的形式合成出长链RNA，该长链RNA含有所需RNA序列的串联重复序列； (3)利用特异性的核酸序列和其它酶或者化合物，将串联产物在特异性位点切割，生成所需序列。
2.如权利要求1所述的RNA的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述短链DNA序列和cDNA链的首尾序列进行碱基互补配对，并使cDNA首尾相接，形成环状cDNA。
3.如权利要求2所述的RNA的制备方法，其特征在于，所述短链DNA长度为11~15nt。
4.如权利要求3所述的RNA的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述RNA聚合酶为T7RNA聚合酶、E.coliRNA聚合酶或Syn5RNA聚合酶。
5.如权利要求4所述的RNA的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述特异性的核酸序列为氧甲基化修饰的短链DNA序列，所述DNA序列同RNA产物在预期位置互补配对结合，并在RNaseH的作用下，`在特定位点切割RNA，得到目的RNA序列。
【文档编号】C12N15/10GK103865922SQ201410113861
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月25日 优先权日:2014年3月25日
【发明者】梁兴国, 王星宇 申请人:中国海洋大学