一株含有刺激植物响应蛋白Epl1基因的大肠杆菌工程菌及其构建方法
【专利摘要】一株含有刺激植物响应蛋白Epl1基因的大肠杆菌工程菌及其构建方法，它涉及一株含有刺激植物响应蛋白Epl1基因的大肠杆菌工程菌及其构建方法。本发明一株含有刺激植物响应蛋白Epl1基因的大肠杆菌工程菌BL21-Epl1为革兰氏阴性短杆菌，兼性厌氧菌，菌落呈圆形、光滑、无色、透明。构建方法为：一、提取深绿木霉的菌丝体cDNA；二、原核表达载体pGEX-Epl1的构建；三、大肠杆菌转化，即完成。本发明的大肠杆菌工程菌在其发酵性能不受影响的情况下，重组蛋白rEpl1诱导后对山新杨的水杨酸、茉莉酸和生长素信号传递途径相关基因表达有明显激发作用，而且生产工艺简单，成本低廉。本发明应用于农学领域。
【专利说明】一株含有刺激植物响应蛋白EpM基因的大肠杆菌工程菌及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌及其构建方法。
【背景技术】
[0002]很多研究发现植物真菌病害生物防治菌深绿木霉(Trichoderma atroviride)能激发植物本身的防御系统而使植物能够抵御病原菌的侵害，即诱导植物产生抗病性，从而促进植物的生长。木霉菌诱导植物抗病性机制是对植物免疫能力的整体提升，而竞争、重寄生、抗生机制是植物病害生物防治菌与病原微生物单一的作用过程。系统获得抗性(Systemic acquired resistance, SAR)和诱导系统抗性(Induced systemic resistance,ISR)是诱导抗性的两种形式。SAR指植物由坏死性病原物侵染或者局部组织经化学诱导物处理后，导致植物对后续多种病原物侵染产生的广谱、持久和系统的抗性，主要通过水杨酸(Salicylic acid，SA)信号传递途径激活；ISR指生物或非生物因子作用于宿主植物后，激活了该植物自身的物理或化学屏障，从而产生系统抗性的过程，茉莉酸(Jasmonic acid,JA)是ISR的一个重要信号传递途径。许多研究发现，深绿木霉ACCC30153中分泌的刺激植物响应蛋白Epll (Eliciting plant response proteinl)是一种小分子分泌型半胱氨酸富含蛋白，属于cerato-platanin家族,含有4个半胱氨酸残基组成2个二硫键，N端存在分泌信号肽，具有疏水性，无毒，该蛋白无任何酶活性，却具有较高的刺激植物响应的作用，能够诱导植物产生抗性，同时还能促进植物生长。但是，深绿木霉菌丝体发酵后产生的蛋白及代谢产物较多，很难直接分离Epll蛋白，工作量大、成本较高。
【发明内容】
`[0003]本发明的目的是要解决深绿木霉菌丝体发酵后产生的蛋白及代谢产物较多，很难直接分离Epll蛋白，工作量大、成本较高的问题，提供了一株含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌及其构建方法。
[0004]本发明一株含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌BL21_Epll为革兰氏阴性短杆菌，兼性厌氧菌，菌落呈圆形、光滑、无色、透明。
[0005]本发明一株含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，是通过以下步骤进行的:
[0006]一、提取深绿木霉的菌丝体cDNA:在28°C，200转/分钟的条件下，将深绿木霉菌丝体在1/4H)培养基中培养48h，收集菌丝体，然后提取总RNA，并将总RNA反转录为cDNA ；
[0007]二、原核表达载体pGEX-Epll的构建:以步骤一得到的深绿木霉的菌丝体cDNA为模板，Eple和Ep2e为引物进行PCR扩增和纯化，得到PCR产物；再从大肠杆菌T0P10-pGEX-4T-2中提取质粒pGEX_4T_2，然后先用BamHI分别对质粒pGEX_4T_2和PCR产物进行单酶切，回收酶切产物，再用SacI分别对酶切产物进行单酶切，获得载体DNA质粒和DNA纯化片段，将载体DNA质粒和DNA纯化片段通过DNA连接酶进行连接，再通过大肠杆菌TOPlO感受态细胞进行转化后得到重组载体pGEX-Epll，其中DNA连接酶为T4DNA Ligase ；
[0008]三、大肠杆菌转化:将步骤二得到的重组载体pGEX-Epll转化到大肠杆菌BL21感受态细胞，然后置于含50 μ g/mL氨苄青霉素的LB固体培养基中，在37°C的条件下倒置培养12h后得到含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌BL21-Epll单菌落，即完成含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌的构建。
[0009]本发明的含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌在其发酵性能不受影响的情况下，重组蛋白rEpll诱导后对山新杨(Populus dividianaXP.bolleana)的水杨酸、茉莉酸和生长素信号传递途径相关基因表达有明显激发作用，而且能引起山新杨生理酶活性的显著变化。因此，重组蛋白rEpll不仅能诱发山新杨产生抗性，提升山新杨防御能力，还能有效促进山新杨生长。筛选得到的大肠杆菌工程菌BL21-Epll能高效表达Epll蛋白，且对发酵设备及条件没有特殊要求，生产工艺简单，成本低廉，因而有广泛的应用前景，能为林区带来显著经济效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为试验I步骤一中Epll基因PCR产物的电泳图；
[0011]图2为试验I步骤二中重组载体pGEX-Epll的PCR检测的电泳图，M为DNA markerDL2000 ;1~3为重组载体pGEX-Epll的目的基因PCR产物；
[0012]图3为试验I步骤二中重组载体pGEX-Epll的酶切检测的电泳图，其中M为DNAmarker DL2000 ;1~3 为重组载体pGEX-Epll的酶切产物；4为空载体pGEX_4T_2的酶切产物；
[0013]图4为试验I步骤三中含氨苄青霉素LB固体培养基上筛选转化子的图片；
[0014]图5为试验2步骤一中重组菌株BL21-Ep 11表达蛋白电泳图，其中M:蛋白Marker ；
I~4为分别诱导2、3、4、5h后的转化子细胞中蛋白条带；5，6为分别诱导3、5h后的转化子发酵液中蛋白条带为对照；箭头为目的蛋白位置；
[0015]图6为试验2步骤一中纯化后的rEpll蛋白电泳图，M:蛋白Marker ；1:纯化后的rEpll蛋白条带；箭头为目的蛋白位置；
[0016]图7为试验2步骤三中水杨酸信号传递路径；
[0017]图8为试验2步骤三中重组蛋白rEpll诱导后水杨酸信号路径NPRl基因的表达的图片，其中?为rEpll蛋白诱导山新杨的基因表达，X为对照诱导山新杨的基因表达；
[0018]图9为试验2步骤三中重组蛋白rEpll诱导后水杨酸信号路径PRl基因的表达的图片，其中?为rEpll蛋白诱导山新杨的基因表达，X为对照诱导山新杨的基因表达；
[0019]图10为试验2步骤三中茉莉酸信号传递路径；
[0020]图11为试验2步骤三中重组蛋白rEpll诱导后茉莉酸信号路径JARl基因的表达的图片，其中?为rEpll蛋白诱导山新杨的基因表达，X为对照诱导山新杨的基因表达；
[0021]图12为试验2步骤三中重组蛋白rEpll诱导后茉莉酸信号路径COI基因的表达的图片，其中?为rEpll蛋白诱导山新杨的基因表达，X为对照诱导山新杨的基因表达；
[0022]图13为试验2步骤三中重组蛋白rEpll诱导后茉莉酸信号路径JAZ基因的表达的图片，其中?为rEpll蛋白诱导山新杨的基因表达，X为对照诱导山新杨的基因表达；[0023]图14为试验2步骤三中重组蛋白rEpll诱导后茉莉酸信号路径MYC2基因的表达的图片，其中?为rEpll蛋白诱导山新杨的基因表达，X为对照诱导山新杨的基因表达；
[0024]图15为试验2步骤三中生长素信号传递路径；
[0025]图16为试验2步骤三中重组蛋白rEpll诱导后生长素信号路径AUXl基因的表达的图片，其中?为rEpll蛋白诱导山新杨的基因表达，X为对照诱导山新杨的基因表达；
[0026]图17为试验2步骤三中重组蛋白rEpll诱导后生长素信号路径LAX2基因的表达的图片，其中?为rEpll蛋白诱导山新杨的基因表达，X为对照诱导山新杨的基因表达；
[0027]图18为试验2步骤三中重组蛋白rEpll诱导后生长素信号路径TIRl基因的表达的图片，其中?为rEpll蛋白诱导山新杨的基因表达，X为对照诱导山新杨的基因表达；
[0028]图19为试验2步骤三中重组蛋白rEpll诱导后生长素信号路径IAA8基因的表达的图片，其中?为rEpll蛋白诱导山新杨的基因表达，X为对照诱导山新杨的基因表达；
[0029]图20为试验2步骤三中重组蛋白rEpll诱导后生长素信号路径MP基因的表达的图片，其中?为rEpll蛋白诱导山新杨的基因表达，X为对照诱导山新杨的基因表达；
[0030]图21为试验2步骤三中重组蛋白rEpll诱导后生长素信号路径GH3基因的表达的图片，其中?为rEpll蛋白诱导山新杨的基因表达，X为对照诱导山新杨的基因表达。
【具体实施方式】
[0031]【具体实施方式】一:本实施方式一株含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌BL21-Epll为革兰氏阴性短杆菌，兼性厌氧菌，菌落呈圆形、光滑、无色、透明。
[0032]本实施方式的含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌在其发酵性能不受影响的情况下，重组蛋白rEpll诱导后对山新杨(Populus dividianaXP.bolleana)的水杨酸、茉莉酸和生长素信号传递途径相关基因表达有明显激发作用，而且能引起山新杨生理酶活性的显著变化。因此，重组蛋白rEpll不仅能诱发山新杨产生抗性，提升山新杨防御能力，还能有效促进山新杨生长。
[0033]【具体实施方式】二:本实施方式一株含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，是通过以下步骤进行的:
[0034]一、提取深绿木霉的菌丝体cDNA:在28°C，200转/分钟的条件下，将深绿木霉菌丝体在1/4H)培养基中培养48h，收集菌丝体，然后提取总RNA，并将总RNA反转录为cDNA ；
[0035]二、原核表达载体pGEX-Epll的构建:以步骤一得到的深绿木霉的菌丝体cDNA为模板，Eple和Ep2e为引物进行PCR扩增和纯化，得到PCR产物；再从大肠杆菌T0P10-pGEX-4T-2中提取质粒pGEX_4T_2，然后先用BamHI分别对质粒pGEX_4T_2和PCR产物进行单酶切，回收酶切产物，再用SacI分别对酶切产物进行单酶切，获得载体DNA质粒和DNA纯化片段，将载体DNA质粒和DNA纯化片段通过DNA连接酶进行连接，再通过大肠杆菌T0P10感受态细胞进行转化后得到重组载体pGEX-Epll，其中DNA连接酶为T4DNA Ligase ；
[0036]三、大肠杆菌转化:将步骤二得到的重组载体pGEX-Epll转化到大肠杆菌BL21感受态细胞，然后置于含50 μ g/mL氨苄青霉素的LB固体培养基中，在37°C的条件下倒置培养12h后得到含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌BL21-Epll单菌落，即完成含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌的构建。
[0037]本实施方式中的深绿 木霉购 买自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCC30153 ;大肠杆菌T0P10-pGEX-4T-2、大肠杆菌TOPlO感受态细胞和大肠杆菌BL21感受态细胞为购买得到。
[0038]本实施方式中1/4H)培养基的配方为马铃薯50g、葡萄糖20g、蒸馏水1000mL。
[0039]本实施方式得到的大肠杆菌工程菌BL21_Epll能高效表达EplI蛋白，且对发酵设备及条件没有特殊要求，生产工艺简单，成本低廉，因而有广泛的应用前景，能为林区带来显著经济效益。
[0040]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】二不同的是:步骤二所述的PCR扩增的反应体系为:10Xbuf?er2μL，dNTP0.8μL，模板2μL，引物EplelμL，引物Ep2elμL，去离子水12.8 μ L，EXTaq0.4 μ L,总体积20 μ L。反应程序:94°C预变性5min ;94°C变性30s，58 V退火40s，72 V延伸80s，35个循环；72 V补平20min，4°C下保存，其中模板为cDNA，引物Eple和引物Ep2e的浓度为20 μ M。其它与【具体实施方式】二相同。
[0041]【具体实施方式】四:本实施方式与【具体实施方式】二或三不同的是:步骤二所述的酶切的体系为:第一次BamHI酶切反应体系为10Xbuffer2 μ L，BamHI酶I μ L，浓度为
0.1 μ g/ μ L的目的片段10 μ L，去离子水7 μ L，总体积20 μ L，37°C酶切12h之后用酶切回收试剂盒回收，回收产物进行第二次酶切；第二次SacI酶切反应体系为IOXbufferfy L，SacI酶1.5 μ L,浓度为0.1 μ g/μ L的目的片段15 μ L,去离子水10.5 μ L,总体积30 μ L,37°C酶切12h。其它与【具体实施方式】二或三相同。
[0042]【具体实施方式】五:本实施方式与【具体实施方式】二至四之一不同的是:步骤二所述的连接体系为:T4buf f er I μ L，胶回收DNA纯化片段4.5 μ L，载体DNA质粒3.5 μ L，T4DNALigaselyL，共10yL，16°C连接12~16h。其它与【具体实施方式】二至四之一相同。
[0043]通过以下试验验证本发明的有益效果:
[0044]试验1、本试验一株含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌的构建方法是通过以下步骤进行的
[0045]一、生物信息学分析:提取深绿木霉的菌丝体cDNA:在280C，200转/分钟的条件下，将深绿木霉菌丝体在1/4H)培养基中培养48h，收集菌丝体，然后提取DNA及总RNA，并将总RNA反转录为cDNA ;利用PCR技术克隆刺激植物响应蛋白Epll基因片段，引物为Eplc和 Ep2c ；
[0046]二、原核表达载体pGEX-Epll的构建:以步骤一得到的深绿木霉的菌丝体cDNA为模板，Eple和Ep2e为引物进行PCR扩增和纯化，得到PCR产物；再从大肠杆菌T0P10-pGEX-4T-2中提取质粒pGEX_4T_2，然后先用BamHI分别对质粒pGEX_4T_2和PCR产物进行单酶切，分别回收两次酶切的产物，再用SacI分别对两次酶切产物进行单酶切，获得载体DNA质粒和DNA纯化片段，将载体DNA质粒和DNA纯化片段通过DNA连接酶进行连接，再通过大肠杆菌T0P10感受态细胞进行转化后得到重组载体pGEX-Epll，其中DNA连接酶为 T4DNA Ligase ；
[0047]其中PCR 扩增的反应体系为:10Xbuffer2y L，dNTP0.8 μ L，模板(DNA 或 cDNA)
2μ L，引物 Eple (20 μ Μ) lyLj|*Ep2e (20 μ Μ) I μ L，去离子水 12.8 μ L, EXTaq0.4 μ L,总体积20 μ L。反应程序:94°C预变性5min ;94°C变性30s，58°C退火40s，72°C延伸80s，35个循环；72°C补平20min，4°C下保存。酶切的体系为:第一次BamHI酶切反应体系为10Xbuffer2y L, BamHI酶1μ L，浓度为0.1 μ g/ μ L的目的片段10 μ L，去离子水7 μ L，总体积20yL，37°C酶切12h之后用酶切回收试剂盒回收，回收产物进行第二次酶切。第二次SacI酶切反应体系为10 X buffer3 μ L，SacI酶1.5 μ L，浓度为0.I μ g/ μ L的目的片段15 μ L，去离子水10.5 μ L，总体积30μ L，37°C酶切12h。
[0048]三、大肠杆菌转化:将步骤二得到的重组载体pGEX-Epll转化到大肠杆菌BL21感受态细胞，然后置于含50 μ g/mL氨苄青霉素的LB固体培养基中，在37°C的条件下倒置培养12h后得到含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌BL21-Epll单菌落，即完成含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌的构建。
[0049]本试验中的深绿木霉购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCC30153 ;大肠杆菌T0P10-pGEX-4T-2、大肠杆菌T0P10感受态细胞和大肠杆菌BL21感受态细胞为购买得到。
[0050]本试验的引物信息如表1所示。
[0051 ]本试验步骤一中 PCR 反应体系:10 X EXbuffer2 μ L, dNTP0.8 μ L，模板(DNA或 cDNA)2yL，引物 Epic (20 μ Μ) I μ L,引物 Ep2c (20 μ Μ) I μ L，去离子水 12.8μ L,EXTaq0.4 μ L,总体积20 μ L0反应程序:94 °C预变性5min ;94°C变性30s，55 °C退火40s，72°C延伸80s，35个循环；72°C补平20min，4°C下保存。步骤一中利用PCR技术克隆Epll基因，Epll基因的cDNA和DNA序列扩增条带分别为417bp和487bp(见图l)，GenBank的接受号分别为JN695780和JN695781，预测编码138个氨基酸序列，蛋白分子量大小为14.3kDa。
[0052]步骤二重组载体pGEX-Epll的PCR和酶切检测，结果如图2和3，产物大小约为417bp，均呈阳性，证明转化成功，其中PCR反应体系:10Xbuffer2 μ L，dNTP0.8 μ L，模板(DNA 或 cDNA)2y L，引物 Eple (20 μ Μ) I μ L，引物 Ep2e (20 μ Μ) I μ L，去离子水 12.8μ L,EXTaq0.4 μ L,总体积20 μ L0反应程序:94 °C预变性5min ;94°C变性30s，58。。退火40s，72°C延伸80s，35个循环；72°C补平20min，4°C下保存。酶切体系:第一次BamHI酶切反应体系为10Xbuffer2 μ L, BamHI酶I μ `L,浓度为0.1 μ g/ μ L的目的片段10 μ L,去离子水7 μ L，总体积20μ L，37°C酶切12h之后用酶切回收试剂盒回收，回收产物进行第二次酶切；第二次SacI酶切反应体系为10 X buffer3 μ L，SacI酶1.5 μ L，浓度为0.I μ g/ μ L的目的片段15 μ L，去离子水10.5 μ L，总体积30μ L，37°C酶切12h。
[0053]表1
[0054]
引物序列_
Ep I c ATGC A ATTGTCC A ACCTCTTCEp2c CTAGAGGCCGCAGTTGCTCA
Eple ATCGGGATCCTGATACGGTCTCCTACGACAC (戈丨J线为 BamRl 酶切位点)
Cp2e CGATGAGCTCGAGGCCGCAGTTGCTCACGGC (划线为 SacX 1? 位点)
[0055]本试验得到的含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌BL21_Epll单菌落如图4所示，重组大肠杆菌工程菌BL21-Epll为革兰氏阴性短杆菌，兼性厌氧菌，单菌落较小(Imm左右)、圆形、光滑、无色、透明。挑取单菌落置于含50 μ g/mL氨节青霉素的LB液体培养基中，在37°C，200转/分钟的条件下，过夜培养，对菌液进行PCR检测，结果为阳性，证明转化成功，其中PCR体系同步骤二。
[0056]试验2、对试验I得到的含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌BL21-Epll进行验证:
[0057]一、重组蛋白rEpll的诱导表达及纯化
[0058]大肠杆菌工程菌BL21_Epll单菌落在LB液体培养基中37°C培养，当菌液浓度达到 0D_=0.5 时利用 LOmM IPTG (Isopropyl β -D-1-thiogalactopyranoside,异丙基-β -D-硫代半乳糖)进行诱导，诱导温度30°C，诱导转速180~200转/分钟，每Ih取ImL发酵液进行 15%SDS_聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE)检测，以转化空载体pGEX_4T_2的重组菌株作为对照，结果如图5所示，箭头所指条带即为重组菌株表达的重组Epll蛋白，其分子量为40.3kD左右。图5也显示分别培养4h和5h的重组菌株产生的重组蛋白Epll明显比培养2h和3h含量多，并确定重组蛋白培养条件为温度30°C培养时间4h。对培养4h的重组蛋白进行纯化后获得rEpll蛋白，15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果如图6，分子量为40.3kDa左右。一般构建成功的重组载体，目的片段都连接到PGEX-4T-2表达载体N端的GST标签(GlutathioneS-transferase,谷胱甘肽转移酶),诱导大肠杆菌转化子时,GST标签也表达蛋白，分子量大小为26kDa，但不影响蛋白的诱导活性，因此，目的蛋白分子量大小为14.3kDa，与预期理论值相符。
[0059]二、大肠杆菌工程菌BL21_Epll的发酵
[0060]发酵培养基为LB液体培养基；诱导剂为1.0mM IPTG ;发酵生产工艺为pH7.0、温度为30°C、转速180~200转/分钟、通风量1.0~1.5 (体积/体积)、发酵时间4h。IL容量瓶IOOmL培养基培养4h能够产生rEpll蛋白0.75mg/ml，30L小试发酵罐能发酵20L发酵液4h能产生rEpll蛋白约15g。因此，相比分离纯化深绿木霉ACCC30153的天然Epll蛋白，大肠杆菌重组工程菌BL21-Epll的生产工艺更简单高效、成本低廉。
[0061]三、重组蛋白rEpll对山新杨水杨酸、茉莉酸和生长素等激素信号的诱导
[0062]水杨酸、茉莉酸及生长素激素信号传递路径相关基因的名称如表2所示，对大肠杆菌工程菌BL21-EplI进行发酵培养，分离纯化后获得rEplI蛋白，将蛋白用大肠杆菌提取液处理后，30°C用8M尿素变性2h，在4°C下1000Orpm离心15min取上清，再加入20倍TGE万金油(Tris Glycerol EDTA buffer)复性，取 2mL 蛋白液和 3mLl/2MS (Murashige andSkoog medium,含鹿糖20g/L和萘乙酸ΝΑΑ0.25mg/mL)液体培养基配成山新杨(PopulusdividianaXP.bolleana)诱导培养基，导入生根培养了 IOd的山新杨组培苗，对照为灭活的rEpll蛋白。分别在0、4、8、16、24和72h取山新杨的叶片提取RNA，反转录成cDNA，分别利用表3所示引物及内参进行RT-PCR实时荧光定量检测山新杨水杨酸、茉莉酸及生长素等信号传递路径的相关基因表达情况。RT-PCR荧光定量反应体系:2X SYBR GreenRealtime PCR Master mixlO μ L，模板(DNA或cDNA)2 μ L，上游引物(10 μ Μ)0.5 μ L，下游弓丨物(10 μ Μ)0.5 μ L,模板(cDNA)2 μ L,去离子水7 μ L,总体积20 μ L。反应程序:94°C预变性30s ;94°C变性5s，58°C退火15s，72。。延伸3s，82°C补平7s，40个循环；开始读板，55_95°C，每间隔0.5°C读板Is绘制溶解曲线。处理数据，制作曲线图，分析比较各基因在诱导下的表达趋势。
[0063] 表2水杨酸、茉莉酸及生长素等激素信号传递路径相关基因的名称
[0064]
【权利要求】
1.一株含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌，其特征在于含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌BL21-Epll为革兰氏阴性短杆菌，兼性厌氧菌，菌落呈圆形、光滑、无色、透明。
2.如权利要求1所述的一株含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌的构建方法是通过以下步骤进行的: 一、提取深绿木霉的菌丝体cDNA:在28°C，200转/分钟的条件下，将深绿木霉菌丝体在1/4H)培养基中培养48h，收集菌丝体，然后提取总RNA，并将总RNA反转录为cDNA ； 二、原核表达载体pGEX-Epll的构建:以步骤一得到的深绿木霉的菌丝体cDNA为模板，Eple和Ep2e为引物进行PCR扩增和纯化，得到PCR产物；再从大肠杆菌T0P10-pGEX-4T_2中提取质粒PGEX-4T-2，然后先用BamHI分别对质粒pGEX_4T_2和PCR产物进行单酶切，回收酶切产物，再用SacI分别对酶切产物进行单酶切，获得载体DNA质粒和DNA纯化片段，将载体DNA质粒和DNA纯化片段通过DNA连接酶进行连接，再通过大肠杆菌TOPlO感受态细胞进行转化后得到重组载体pGEX-Epll，其中DNA连接酶为T4DNA Ligase ； 三、大肠杆菌转化:将步骤二得到的重组载体pGEX-Epll转化到大肠杆菌BL21感受态细胞，然后置于含50 μ g/mL氨苄青霉素的LB固体培养基中，在37°C的条件下倒置培养12h后得到含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌BL21-Epll单菌落，即完成含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌的构建。
3.根据权利要求2所述的一株含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于步骤二所述的PCR扩增的反应体系为:IO X buffer 2 μ L，dNTP0.8 μ L，模板 2 μ L，引物 Eplel μ L，引物 Ep2el μ L，去离子水 12.8μ L, EXTaq0.4 μ L,总体积20 μ L ;反应程序:94°C预变性5min ;94°C变性30s，58 °C退火40s，72 °C延伸80s，35个循环；72°C补平20min，4°C下保存，其中模板为cDNA，引物Eple和引物Ep2e的浓度为20 μ Μ。
4.根据权利要求2所述的一株含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于步骤二所述的酶切的体系为:第一次BamHI酶切反应体系为10Xbuffer2y L, BamHI酶1μ L，浓度为0.1 μ g/μ L的目的片段10 μ L，去离子水7 μ L，总体积20μ L，37°C酶切12h之后用酶切回收试剂盒回收，回收产物进行第二次酶切；第二次SacI酶切反应体系为10 X buffer3 μ L，SacI酶1.5 μ L，浓度为0.I μ g/ μ L的目的片段15 μ L，去离子水10.5 μ L，总体积30μ L，37°C酶切12h。
5.根据权利要求2所述的一株含有刺激植物响应蛋白Epll基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于步骤二所述的连接体系为:T4bufferl μ L，胶回收DNA纯化片段·4.5 μ L，载体 DNA 质粒 3.5 μ L，T4DNA Ligasel μ L，共 10 μ L，16°C连接 12 ~16h。
【文档编号】C12N15/70GK103865866SQ201410113769
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月25日 优先权日:2014年3月25日
【发明者】刘志华, 遇文婧, 王志英, 刁桂萍, 张荣沭, 范海娟, 黄颖, 宋小双 申请人:东北林业大学