专利名称：核酸检测方法
技术领域：
本发明涉及核酸检测方法，特别是核酸的定量检测方法。
检测(尤其是定量检测特定核酸序列)作为有机体存在的指针，比如，临床样品中的病原体或食物或环境样品中的污染菌，例如水源中的产毒蓝细菌，或显示转录水平改变的mRNA，是一种有价值的微生物学工具。另外，在核酸分析的诊断或法医学用途中，或多态性的研究中，在单个碱基变化或错配的检出就足以给出肯定的鉴定时，目标核酸的全测序可能是不需要的，这样的单碱基变化或错配可能(例如)来自等位基因变化或多态性，点突变，或基因材料的任何缺失或插入，其中检测到一个异常或物种特异性的碱基就能得到所需要的信息。
通过我们对开发检测水生细菌方法的研究，我们已开发了一种新的核酸检测方法，适合环境、农业、食品、兽医学、卫生和医药领域的广泛应用，并且确实可作为分子生物学的一种通用工具。
可用于分析核酸的方法有许多，包括制备合成的寡核苷酸探针，特别是标记探针，用来和目标序列杂交；通过PCR和其它相关的扩增方法体外扩增目标核酸序列，以及(自动)直接DNA测序。这些已导致在环境监测中核酸分子检测和特性分析新方法的建立(Bej,A.K.和Mahbubani,M.H.PCR技术目前的创新327-339页，以及Bowman,J.P.和Sayler,G.S.环境微生物学中的分子方法63-97页)。定量测定扩增的DNA有三种主要方法；亦即，通过电泳根据大小分离，与捕获探针杂交，以及实时检测。凝胶电泳法的问题是在一次反应中检测多种目标(序列)，以及结果的解释。多重扩增的大小分离检测也很难达到，因为不同大小的扩增物的扩增率取决于DNA的质量。
捕获探针试验基于全部扩增片段的杂交。显然，该试验不适合分离和定量同源扩增物，例如竞争性扩增产物。不同的扩增物在同源位点会形成夹心杂交，导致同时捕获目标片段和非目标片段，即使捕获位点具有辨别能力。
ABI PRISMTM7700序列检测系统(Perkin Elmer,Foster City,California)提供了实时定量PCR扩增。然而，多重试验受到了可得到的荧光染料数量和它们的重叠荧光光谱的限制。
在核酸检测方法中一向的目标是增加检测的特异性，亦即，减少非特异性结合或非特异性背景信号的检测。一个独立但是相关的目标是增加检测方法的灵敏度，亦即，能测到非常少量的目标核酸。
如果该方法能允许在一次反应中检测和测定几个，优选为多个例如10或更多的多态性位点，例如，允许在一次多重试验中检测和定量测定数个不同的目标有机体，这将代表一重大进步。
我们已开发了一种方便的检测方法，它提供了良好的灵敏度和特异性，以及在一次反应中检测和定量大量多态性位点的能力。特别是，该方法代表了优于琼脂糖凝胶或直接定量检测扩增的DNA的重大进步。
本发明因此提供了一种检测核酸分子中目标核苷酸序列的方法，它包括(a)将一寡核苷酸探针和所述核酸分子结合；(b)在存在所述目标核苷酸序列时，选择性标记所结合的寡核苷酸探针；(c)将标记的寡核苷酸和互补序列杂交；以及(d)随后检测该标记。
本发明的方法可用于检测所有的目标核苷酸序列，例如DNA序列，特别是PCR扩增循环得到的DNA。DNA可以是天然的或用反转录酶从mRNA形成的cDNA。DNA可以是单链或双链，线状或环状。目标核酸可以是RNA，例如mRNA或特别是以多拷贝存在于细胞中的核糖体RNA，例如每细胞3,000-20,000拷贝。
在本发明中，术语“核苷酸序列”可以指长度仅为一个核苷酸的“序列”，其中感兴趣的核酸和其它本方法不想要检测的(非目标)序列仅有一个核苷酸的区别，例如在检测点突变或多态性情况下。更普遍的，被检测的核苷酸序列是一特定核酸或一组核酸、或一特定有机体、或一组有机体例如一个物种的特征，它被用来检测样品中目标(例如核酸/或有机体)的存在，该样品含有许多不同的分子或有机体。例如，用于检测临床或环境样品中的特定细菌。
寡核苷酸探针可包括5到50，优选10到40，更优选20到30个核苷酸。选用该探针与目标核酸，即含有目标核苷酸序列的核酸分子结合。该寡核苷酸应足够大，以提供和目标核苷酸正确的杂交，而且还要适当短，以避免非必要的化学合成。寡核苷酸制备的方法是本领域中的标准方法。
如上文所述，目标核酸可以是DNA，cDNA或RNA。寡核苷酸探针被设计用来和含有目标核苷酸序列的核酸分子中目标区域结合。本文所用的“目标区域”是指与寡核苷酸探针结合的核酸序列。该目标区域可以是“特征序列”的形式，它是一种特定核酸或一组核酸或有机体等的特征，或可以是就在感兴趣的某个碱基位置之前的核酸片断，如果待检测的是多态性、点突变、插入或缺失。
当然理想的是样品中的任何非目标分子中无此目标区，以在目标核苷酸序列和非目标核苷酸序列之间引入选择性。这种结合特异性可在探针区域中掺入与所需目标区域互补或基本互补，以及/或与非目标序列错配的序列来实现。互补性区域可能存在于探针片断的末端或内部，或两者中。
常规上，核酸检测方法涉及先标记寡核苷酸探针，然后和目标核酸序列杂交。然而，在我们的方法中，标记探针依赖于探针所结合的核酸分子序列。换言之，标记探针是模板序列依赖性的(亦即，序列特异性)-标记的掺入仅当在目标分子中存在所需或所选“序列”时才发生，它可能在目标区域或在目标核苷酸序列本身中，或它可能选择性发生，亦即，标记掺入寡核苷酸探针的步骤可以具有辨别能力(亦即，基于“小型测序”原理)。这对该过程增加了额外的选择性(特异性)；寡核苷酸探针结合将一开始就能辨别非目标序列，但预计和非目标序列也有某种结合。结合前如果探针本身已被标记，那么进一步辨别是不可能的。
本发明另一方面在存在目标核苷酸序列时，增加了将一个标记选择性(序列特异性)掺入寡核苷酸探针的步骤。这种选择性可通过当只存在目标核苷酸序列时掺入标记而达到，或以选择性或辨别性方式掺入标记，从而使目标核苷酸序列可以被分辨，或同时通过这两种途径。
方便的选择性标记可采用标记的核苷酸而实现，亦即，通过在寡核苷酸探针中掺入(或不掺入)带有标记的核苷酸。换言之，选择性标记可通过使用聚合酶掺入一个标记的核苷酸延伸寡核苷酸探针链而产生。就RNA目标而言，聚合酶可以是反转录酶。链延伸(亦即，碱基掺入)条件和合适的聚合酶是本领域内公知的，并在文献中有广泛描述。
寡核苷酸选择性标记优选通过掺入一个标记的双脱氧核苷酸而达到。
本文所用的术语双脱氧核苷酸包括所有2′-脱氧核苷酸，其中3′羟基基团缺失或被修饰，并因此在存在聚合酶时能够被加到寡核苷酸探针上，而不能进入随后的聚合反应。这意味着只有一个碱基被加到探针上。
此方式的链终止使得反应可受到控制，并且如需要可定量分析(见下文)。
优点是，如上所述，本发明涉及寡核苷酸探针的链延伸以掺入一个标记。本发明允许选择性标记通过下列两种方法得到以选择性方式掺入一个标记的核苷酸(亦即，根据该标记(存在或不存在)辨别，或通过选择性检测一特定标记)，或以选择性方式掺入核苷酸，这种核苷酸(不论标记与否)的掺入只在存在目标核苷酸序列时发生(或更准确说，如不存在目标核苷酸序列，掺入效率会大大降低)(亦即，根据核苷酸掺入或不掺入而辨别)，或同时通过这两种途径。
作为这种方法的范例，如果目标序列是一个关键的鉴别碱基，例如该碱基在核酸分子中与探针结合的目标区域紧邻为胞嘧啶，那么可将标记的双脱氧鸟嘌啉三磷酸(ddGTP)加入反应混合物以掺入。如果探针已结合于非目标序列的核酸，下一个核苷酸不可能和关键碱基相同，则标记ddGTP不可能掺入该寡核苷酸中，亦即掺入寡核苷酸只有在(或主要在，或基本在)存在目标时才发生。如果关键碱基是鸟嘌啉，腺嘌啉，胸腺嘧啶或尿嘧啶，上述采用的鉴别方法应作必要的修正。
为了进一步降低标记的双脱氧核苷酸错误掺入的可能性，在反应混合物中也可加入未标记的双脱氧核苷酸三磷酸。用于上述范例，(其中加入标记的ddGTP)，也可加入未标记的ddCTP,ddATP和ddTTP(其中目标核酸分子是DNA)。如果仅存在一个ddNTP，则不管碱基配对规则，可能的风险是该ddNTP将掺入关键碱基不是其天然碱基对的位置，虽然频率很低。这可能导致该试验中背景或噪声信号。包含其它ddNTP意味着这些碱基将根据碱基配对的正常规则(C-G和A-T/U)择优掺入，而标记的ddNTP错误掺入可以显著降低。采用未标记ddNTP因而是本发明的优选例。
在本发明的另一个优选例中，标记反应的选择性还通过在紧靠关键碱基的上游掺入错配而增加。因此，寡核苷酸探针被设计成在3′末端具有一或多个和非目标核苷酸序列的错配，而且错配的存在将降低寡核苷酸延伸的可能性。因此，即使结合的寡核苷酸末端后面的下一个碱基正好和关键碱基相同，由于在探针和它结合的核酸之间有错配，在非目标序列中ddNTP的掺入也会降低。
许多合适的标记物和标记方法是本领域中已知的，并描述于文献中。任何可检测或产生信号的标记或报道分子都可用。便利的标记包括比色、化学发光、染料、放射活性和荧光标记，但也可使用酶或基于抗体的标记方法或信号产生系统。因此本文所用的术语“标记”不仅包括直接可检测的产生信号分子，还包括任何一种产生信号或参与信号产生反应的分子。荧光素或其它荧光标记的ddNTP特别合适，它们允许通过荧光直接检测或通过抗体反应间接检测。这些材料可得自商品，例如NEN/Dupont。ddNTP可用例如[35S],[3H]或[32P]标记，如Syvnen,A.C.等，基因组学8,,684-692所述。
为了增强灵敏度，可进行多个标记步骤。换言之，选择性标记步骤可重复一或多次，亦即，循环进行。增加循环次数增加了灵敏度，而且当进行定量分析试验时(见下文)，增加该方法的定量范围是通过提高探针的标记饱和度。为了促进循环标记，在标记掺入步骤中可使用耐热聚合酶。方便的是，选择性标记步骤的循环次数可以从1到50轮，例如10到30轮，但这可根据选择而变动。某给定系统的合适或方便的循环次数可通过常规实验确定。
检测多个单核苷酸多态性的微型测序方法已知涉及与荧光标记双脱氧核苷酸的单核苷酸延伸反应(Pastinen,T.等，临床化学(1996)42卷，9,1391-1397)。在该例中，用凝胶电泳分析微型测序反应产物。相反，本发明涉及标记寡核苷酸和其互补核酸序列之间的杂交反应，然后进行检测和分析。
因此，选择性标记步骤之后，使已标记寡核苷酸探针和互补核酸序列杂交。通常，这涉及将已标记寡核苷酸探针与前面的反应混合物分离。通过掺入一个标记的核苷酸进行标记掺入，导致这样标记的寡核苷酸探针与目标核酸分子杂交。用来分离探针的链分离可用本领域传统变性方法来实现，例如高温加热，用高pH(碱)处理等。步骤(c)，然后可发生标记的寡核苷酸和互补序列杂交。根据本发明，该“互补序列”可以是任一核苷酸序列，它含有与探针绝对或基本互补的区域，从而能发生探针和该“互补序列”的结合。该互补序列可以是DNA或它的修饰物例如PNA。方便的是，互补序列可采用探针互补(链)的形式(亦即，和探针完全互补的序列)。然而，可以理解的是，这不是绝对必要的，而且“互补(链)”可以包含在更长的序列中，可以是部分或截短的，以及/或可以含有序列变化(亦即，不是完全互补)，只要探针和“互补序列”的结合仍能发生。
在优选例中，互补序列固定于固相载体。互补链可以附着的合适固定载体是本领域已知的，包括在固定、分离等中目前已广泛使用或计划使用的任何熟知的载体或基质。这些载体或基质可采取颗粒，薄片，凝胶，滤纸，膜，纤维，毛细管，芯片或微量滴定带，试管，板或孔等形式。寡核苷酸固定或附着于固相载体的方法也为本领域熟知。特别优选的是膜条(商品可得自NEN，称为Genescreen)，互补序列可点样于膜条上，然后紫外光交联，或点样于分子生物学方法中现在常用的DNA芯片(微芯片，玻璃芯片)。这些固相载体的使用，特别是芯片，能带有寡核苷酸阵列，亦即，数目，例如多达250个与本试验前面部分使用的寡核苷酸探针互补的不同寡核苷酸，这代表了本发明一特别优选例。
杂交步骤(c)允许定量测定分离的标记探针。这是定量试验的优点。
杂交步骤后，检测寡核苷酸探针上的标记。如上文标记中所提到的，可以通过任何本领域已知的方法检测，这取决于所选择的标记。如果需要，如本领域描述还可采用信号扩增，(见，例如，P.Komminoth和M.Werner，目标和信号扩增，增加原位杂交灵敏度的方法，1997，组织化学，细胞生物学。108:325-333)。检测可以是定性，或定量或半定量的。因此，例如，可视比色、色素、荧光或其它可从标记检测到的信号可用来对目标核苷酸序列存在或不存在提供简单的是或否的判定。然而好处是，该检测可对样品中存在的目标核苷酸量进行定量评估。这可以是目标核苷酸存在量的绝对指标，或某些其它定量或半定量指标，例如百分比，比率，或相似指标，例如样品中总核酸的相对量。
目标核苷酸序列的定量还可能和有机体或细胞数量的定量有关，这些有机体或细胞含有所讨论的目标(序列)。因此在另一方面，本发明还提供采用本文前述的核酸检测试验确定目标核苷酸序列量或含有目标核苷酸序列的细胞数量的方法。
如上所述，目标核酸可以是任何DNA或RNA分子。因此它可以直接是目标细胞或有机体的核酸。然而，理想的是，在采用本发明试验方法检测前先扩增核酸，而且有利的是目标核酸可以是体外扩增反应的扩增物。然而，扩增也可以通过其它方法进行，包括体内克隆方法。可以使用任何体外扩增方法，包括线性和指数方法。因此，代表性方法包括PCR,NASBA和连接酶链式反应。由于方便，PCR和它的不同形式常常是被选择的方法。
在定量试验中，体外扩增方法中的定量测定可以和本发明的检测试验相结合。特别是，在本发明方法的优选例中，在寡核苷酸探针结合步骤前进行竞争性PCR反应。有各种不同的竞争性PCR方法，文献中有描述。可使用任何一种已知技术(综述见例如Srebert,P.D.和Larrick,J.W.自然科学杂志，369,557-558)。
在这样的方法中，将掺入目标核苷酸序列的核酸与所选的竞争性分子共扩增，该竞争性分子含有和目标分子相同的引物模板序列，因此该竞争性分子和(目标)分子竞争与PCR引物的结合和扩增。该竞争分子包括和目标(序列)区别的序列，方便的是包括了一个和竞争序列特异性寡核苷酸探针结合的识别序列，该探针和前述检测试验中“目标特异性”寡核苷酸探针(亦即，上文步骤(a)中的探针)类似。因而该识别序列和上文寡核苷酸探针的“目标区域”类似。可加入一已知量的竞争分子，以和标准曲线比较，或使用不同量的竞争分子，例如系列稀释液来进行系列扩增。在感兴趣的核酸分子中加入与目标核苷酸序列旁侧序列(亦即竞争分子中的相同序列)互补的引物，并进行PCR扩增。竞争性PCR使检测得以进行并和参照物一起提供更准确的结果分析。标准曲线可以用本领域常规标准技术构建。
在这样一个竞争性PCR步骤中，从目标DNA和竞争性DNA产生扩增物。对竞争性产物和上述的目标扩增产物以类似方式接受检测试验程序。扩增的竞争性序列包括已知识别序列，它和被检测的目标核酸分子中目标区域行为相同。例如，在反应混合物中加入和竞争分子的识别区域选择性结合的一种寡核苷酸探针，该探针和针对目标分子目标区域的探针同时加入，两种寡核苷酸都被设计成当和它们各自的目标序列结合时，有一个标记的ddNTP碱基延伸。还提供一种竞争性寡核苷酸探针的互补序列，其和竞争分子结合后受到标记，而且该固定和标记的核苷酸探针优选在检测前和该互补序列杂交。目标核苷酸和竞争性寡核苷酸的标记因而可检测到，特别是，用来评估原始样品中存在的目标核酸量的被测定信号的相对长度，给出了加入到系统中的竞争分子的已知量。本发明的该方面表示于
图1。竞争分子和目标序列的标记不需要相同，事实上它们优选为相同。竞争分子和目标(序列)之间的区别，如多种不同目标序列之间的区别，优选为空间差异；每种寡核苷酸探针的互补序列在例如微芯片阵列中的位置是已知的，而且每个位置的信号强度已被测定。
可用滴定实验来确定在任何特定试验中使用的竞争分子最适用量，如下列实施例中所述。所选的竞争分子量优选能检测到低频率的目标核酸分子和可重复扩增。合适浓度可在6×10-8到8×10-9pmol变化，优选为4×10-9-8×10- 9-pmol。
优选的，进行足够的PCR循环，从而达到饱和水平；那样扩增的DNA含有和PCR前基本相同的目标DNA对竞争性DNA的比率。
提供PCR时竞争性DNA和目标DNA能同等有效扩增的条件是有益的，因此理想的是每个片段的大小和GC含量基本保持相同。在一些例子中，也必需考虑样品细胞裂解的效率，它可使一些基因组DNA不能用于PCR。另外，目标DNA可能在最初循环中是染色体DNA的一部分，而竞争性DNA可以是(例如)小质粒形式。因此，校正这些早期PCR循环的相对扩增效率是必须的。
其它扩增方法也可用于本发明的这个方面，例如NASBA和连接酶链式反应。
可以使用任何合适的聚合酶，虽然优选使用嗜热酶，例如Taq聚合酶，以允许进行重复温度循环而不用在每个循环中再加入聚合酶，例如在Klenow片段。
如上文所述，目标核酸可以是样品中合成自mRNA的cDNA，因此本发明的方法可根据特征性mRNA应用于诊断。可通过反转录酶预先处理进行这种预先合成，方便的是在随后扩增(例如PCR)步骤中使用了相同的缓冲液系统和碱基。由于PCR程序需要加热来实现链分离，在第一循环中反转录酶将被灭活。当mRNA是目标核酸时，可能用固定化聚dT寡核苷酸处理最初样品是有利的，以通过mRNA末端的聚A序列来收回所有mRNA。另外，可使用特异性寡核苷酸序列通过特异性RNA序列来收回RNA。然后该寡核苷酸可作为cDNA合成的引物，如国际专利申请WO-A-90/11446中所述。
目标核酸和竞争性核酸的PCR(或其它体外方法)扩增提供了第一水平的特异性，但在该反应中也会低水平扩增非目标/非竞争性分子，因而根据本发明，寡核苷酸探针的选择性标记根据的是目标扩增物和竞争性扩增物中的特征序列。定量只是根据目标分子对竞争分子的信号比，而不受第一反应中已被扩增的非目标/非竞争性分子的影响。
当主要检测试验在PCR或其它基于链延伸的体外扩增步骤后进行时，必须将前面反应的dNTP从PCR产物中分离出来，或将他们灭活，以确保它们不能参与后续的与结合于终止性ddNTP位置上的目标/竞争性核酸的寡核苷酸延伸。从PCR产物中物理分离dNTP是可能的，例如用凝胶电泳、沉淀、亲和纯化、层析或过滤。然而，灭活dNTP优选是通过用磷酸酶除去反应性磷酸基团，从而使核苷酸不能再用于有效链延伸。
本发明的方法中所用的目标核酸可通过本领域任何常规技术获得或制备。在文献中描述了许多从细胞和有机体分离核酸的不同方法，其中任何一种都可用。
例如，从环境样品中提取核酸的方法见Bowman,J.P.和Sayler,G.S.在环境微生物学的分子方法(1996),63-97页描述。然而本发明的具体优选例将上述检测方法和我们在Rudi等，应用环境微生物学(1998),64(1),34-77页所述的联合细胞与核酸分离的固相方法结合起来。
在该论文中所述的从细胞样品中分离核酸的方法，包括(a)将样品中的细胞和固相载体结合以从样品分离细胞；(b)裂解分离的细胞；以及(c)将所述裂解细胞释放的核酸与所述同一固相载体结合。
结合的核酸可直接用于本发明的检测试验，或可从载体上释放。
本发明的检测试验可有利的用于任何需要检测核酸的程序，例如，在任何依靠DNA或RNA鉴定的程序中，比如诊断、检测感染或污染有机体或病原体，临床监测，法医学，食物和环境安全与监测，或用于区别不同的细胞或细胞类型，突变检测，多态性分析，如在组织分类和作为通用分子生物学工具。完整的基于核酸的试验包括样品制备，DNA扩增，选择性标记和检测，它在对水源产毒性蓝细菌定量检测上特别有益。这种分离和检测的联合方法是本发明的一特定优选例。该试验提供了更低的检测极限为200细胞/ml，优选100细胞/毫升(特定蓝细菌对其它蓝细菌的背景是105细胞/毫升)，以及大于3个数量级的定量范围。上文原理中和下文更详细描述的方法适用于自动化，提供了开发常规环境监测的高通量系统的工具。
例如，蓝细菌形成的水花具有相对高频率的毒性(大约25％和70％之间)，并对畜牧业和人构成潜在的健康威胁。这特别在属于微囊蓝细菌属的蓝细菌水花的情况中出现。该属的各种菌可产生数种毒素，其中肝毒性微囊藻素是最强的毒素。因此，如果能开发出一种方法，提供可靠，快速和便利的方法来监测和定量这些细菌将是理想的。
本发明的方法特别适合于这个方面，通过选择与感兴趣的不同细菌基因组中特征序列互补的寡核苷酸，可在一个程序中分析一个样品中的数种不同微生物有机体。区别细菌组别的特征序列众所周知，并在文献中出版，对于蓝细菌，可使用基于16S rDNA序列信息的分类系统(见例如J.R.Marchesi,T.Sato,A.J.Weightman,T.A.Martin,J.C.Fry,S.J.Hiom，和W.G.Wade,1998，扩增编码细菌16S rRNA基因的有效细菌特异性PCR引物的设计和评估。应用环境微生物学。64:795-799；Tumer,S.编辑(1998)藻类和它们质体的起源，13-53页，Bhattacharya,D.,NY:Springer-Verlag和Giovanni,S.J.,Turner,S.,Olsen,G.J.,Barns,S.,Lane,D.J.和Pace,N.R.(1988)细菌学杂志170,3584-92页)。
后面的实施例描述了分析复合蓝细菌群落的整个综合试验。本发明的方法也同样适用于其它微生物群落的调查。
可将不同的标记寡核苷酸的互补序列以预先确定的方式排列在一块微芯片上，优选通过比较竞争性信号和每个细菌组信号的比率来定量测定不同细菌的水平。这样的多重定量试验优选使用固定在玻璃芯片上的高密度寡核苷酸阵列，然后直接检测荧光标记(见例如Schena,M.等，科学，(1996)270:467-470；和R.J.Lipshutz,D.M.Morris,M.Chee,E.Hubbell,M.J.Kozal,N.Shah,N.Shen,R.Yang，和S.P.A.Fodor.，用寡核苷酸探针阵列来测定基因多样性，生物技术19:442-47)。
本发明还包括用于实施本发明方法的试剂盒。这些通常包括至少下列成分(a)一种寡核苷酸探针，它能够和含有目标核苷酸序列的目标核酸分子结合(亦即，针对该核酸分子中的一个目标区域)；(b)选择性标记该寡核苷酸探针的方法；以及(c)与该寡核苷酸探针互补的核苷酸序列，优选固定于固相载体上。
选择性标记的方法将常规包括一种聚合酶和至少一个标记的核苷酸，优选是标记的ddNTP，也可任选的存在相应的未标记的核苷酸。
上述发明现在将用以下关于蓝细菌检测领域的非限制性实施例，并参考附图来说明，其中图1是定量标记试验的示意图。将已知浓度的竞争性DNA加到纯化的目标(DNA)中，并用相同引物碱基对共同扩增(A)。两种寡核苷酸，一种和竞争DNA的一个内部片段互补，另一种和目标序列的一个内部片段互补，它们通过热循环用标记荧光的双脱氧胞嘧啶特异性序列延伸(B)。然后使标记引物和它们的固定互补序列杂交(C)。最后，进行标记的显色检测(D)，并测定相对信号强度。
图2(A)-显示分离自铜绿微囊蓝细菌NWA-CYA 43的DNA系列稀释度竞争性PCR的凝胶结果， (B)-显示标记试验的结果，(C)-显示相对于总信号强度的目标信号强度的图。
对系列稀释的纯化DNA进行了该试验。DNA量作为基因组拷贝给出(假定基因组拷贝的重量是5fg)。在A组中，竞争性PCR反应的10微升产物被加到1.5％琼脂糖凝胶(含有30微克/毫升溴乙锭)的泳道上，并用IxTBE 100伏特电泳1小时。产物用紫外透射显像。B组显示的标记试验按实施例所述进行。在C组中，组A中的目标信号强度(信号和背景之间以8位灰度平均象点值差异来衡量)相对于目标和竞争性序列(●)的总信号强度测定。B组中也显示了标记试验的各自值(▲)。图片用Cohu高性能CCD照相机拍摄，用数字式彩色打印机打印(Mavigraph UP-D1500CNE.Sony,Japan)。
图3是显示目标点信号强度相对于总信号强度的百分比，用所有实验的平均值，以及误差条图作为标准偏差(自由度为3)。用6x10-9pmol竞争物对不同水环境中系列稀释的铜绿微囊蓝细菌NIVA-CYA 43进行了整个试验。细胞稀释于无菌水，含有累氏鱼腥蓝细菌NIVA-CYA 83/1(105细胞/毫升)的水、含有阿氏浮游发菌(Planctothrix prolifica)NIVA-CYA 29(105细胞/ml)的水、以及挪威Akersvatnet湖的水(采样日1996年5月30日)。包括固相细胞浓缩和DNA纯化的整个试验按如实施例中所述进行。
图4-(A)-显示如实施例所述的固相细胞浓缩和DNA纯化后的标记试验的结果。用6×10-8pmol竞争物对系列稀释的挪威Akersvarnet湖的水中铜绿微囊蓝细菌NIVA-CYA43(采样日1996年5月30日)进行了整个试验。
(B)-显示了目标点信号强度相对于总信号强度的百分比图。图片用Cohu高性能CCD照相机拍摄，用数字式彩色打印机打印(Mavigraph UP-D1500CNE)。
图5-(A)-显示代探针的膜条。
(B)-显示各探针的信号强度。
(C)-显示不同探针的系统发育的位置。
探针以下列顺序点样于膜上第一列-pKO,pAP，和pMI3；第二列-pMI2,pDK和pPL2；第三列-pPL1,pAL和pNOS；第四列-pUN。测试的菌株是膜a1；柔细蓝束丝蓝细菌(Aphanizomenon gracile)NIVA-CYA103,a2；累氏鱼腥蓝细菌(Anabaena lemermannii)NIVA-CYA 266/1,a3；念珠蓝细菌(Nostoc sp.)NIV-CYA 123,b1；席蓝细菌(Phormidium sp.)NIVA-CYA 203,b2；阿氏浮游发菌(Planctothrix prolifica)NIVA-CYA 320,b3；铜绿微囊蓝细菌(Microsystisaeruginosa)NIVA-CYA 143,c1；水花微囊蓝细菌(Microcystits flos-aquae)NIVA-CYA 144,c2；湖泊假鱼腥蓝细菌(Pseudanabaena limnetica)NIVA-CYA276/6，以及c3；绿菌(Chlorobium)。测定了每个点的信号强度。不同菌株和探针的系统发育位置用系统树表示。系统树用邻基连接算法建立，使用Kimura距离。树上的每个分枝有大于65％的基线(bootstrap)支持。
图6-显示7个挪威湖泊的水概貌分析。湖泊从具有相对低生物量(半自养)湖泊到具有高生物量内容(富养)湖泊。相对于通用探针pUN的信号强度乘以从纯水培养物获得的一个因子，来纠正探针标记效率的差异，以获得样品中不同基因型的相对丰度。
用标准的酚/氯仿法从单种藻培养物的细胞沉淀，或通过固相细胞浓缩和DNA纯化法(Rudi,K.,Larson F.和Jakobsen,K.J.实用和环境微生物学，(1998),64.卷1，34-37页)纯化DNA。在固相法中，1毫升水溶液中的蓝细菌细胞用20分钟吸附到缓冲液中的顺磁珠上(最终体积2毫升)，所用缓冲液含有50％异丙醇，0.75M醋酸铵和1U(珠于200微升裂解缓冲液中)Dynabeads DNA Direct(DynalA/S,0slo,Norway)的缓冲液中。顺磁珠和吸附的细菌用MPC-Q磁铁(Dynal A/S)吸附到2毫升微量离心试管壁上。然后加入20微升4M鸟嘌啉硫氰酸酯-1％十二烷基肌苷酸钠，65℃培养10分钟。DNA通过加入40微升96％乙醇沉淀到珠上，然后室温培养5分钟。最后，DNA和玻璃珠复合物用500微升70％乙醇洗两次，在每次洗涤之间使用磁铁。为了除去剩余乙醇，将复合物在65℃干燥5分钟。全部珠和DNA复合物然后用于扩增反应。
竞争性PCR(示意图见图1A)为了选择性扩增微囊蓝细菌基因组DNA，我们使用了16S rDNA引物5′-AGCCAAGTCTGCCGTCAAATCA-3′(CH)和5′-ACCGCTACACTGGGAATTCCTG-3′(CI)(Rudi,K.等，实用环境微生物学。63,2593-2599)。竞争序列5′AGCCAAGTCTGCCGTCAAATCAAGCTGCCTCACTGCGGAGCTCGGACCAGGAATTCCCAGTGTAGCGGT -3′是具有与PCR引物CH-CI互补序列的寡核苷酸，而引物DK(见下文)用于PCR循环标记反应。扩增反应使用GeneAmp 2400 PCR热循环仪(Perkin Elmer,Norwalk,Conn.)，含有10pmol引物，6x10-9pmol竞争序列，各200μM的各个脱氧核苷酸三磷酸，10mM Tris-HCl(pH8.8),1.5mM MgCl2,50mM KCl,0.1％Triton X-100,1U DynaZyme DNA聚合酶(Finnzymes Oy,Espoo,Finland)和最终体积50微升的纯化DNA。在扩增前，DNA在94℃变性4分钟，扩增后72℃进行7分钟延伸步骤。循环用以下参数进行40轮94℃30秒，58℃30秒，和72℃30秒。
循环标记(示意图见图1B)在循环标记反应中采用了竞争反应的5微升PCR产物。双脱氧核苷酸三磷酸通过加入100nm Tris-HCl(pH 8.0),50nm MgCl2和1U虾碱性磷酸酶(USB,Cleverland,OH)去磷酸化，然后37℃培养1小时。最后，96℃加热10分钟灭活磷酸酶。
循环标记反应以20微升体积进行，含有3pmol引物5′-GTCCGAGCTCCGCAGTGAGGCAG-3′(DK)，与竞争序列互补。3pmol引物5′-TCTGCCAGTTTCCACCGCCTTTAGGT-3′(DB)，与微囊蓝细菌扩增物互补。10pmol ddATP,10pmol ddGTP,10pmol ddTTP(Boehringer GmbH,Mannheim,Germany),7pmol荧光素-12-ddCTP(NEN,Boston,Mass.),1.25μl热测序酶反应缓冲液(AmershamInternational plc,Buckinghamshire,England)和6μ1磷酸酶处理过的PCR产物。标记用以下参数进行25轮95℃30秒和50℃4分钟。
杂交和显色检测(示意图见图1C和D)将1微升(100pmol/μl)引物5′-ACCTAAAGGCGGTGGAAACTGGCAGA-3′(DA)和5′-CTGCCTCACTGCGGAGCTCGGAC-3′(DJ)点样至膜条(0.4x2cm)GeneScreen(NEN)上，然后用5000焦耳/cm2紫外光交联。引物DA和引物DB互补，而引物DJ和引物DK互补。膜条在预杂交溶液中37℃预杂交2小时，该溶液含有0.7xSSC,1x SPEP,5x Denhardts和100μg/ml异源DNA。将循环标记反应的产物加到2ml微量离心管的0.5ml杂交溶液中(0.7xSSC,1xSPEP,1xDenhardts,10％硫酸葡聚糖和100μg/ml异源DNA)，并95℃变性5分钟。加入膜条，继续37℃温和翻转培养2小时。膜条用50毫升(1xSSC,和1％SDS)洗涤，然后用50毫升(0.1xSSC和0.1％SDS)洗涤，最后用50毫升(0.10M Tris-HCl[pH7.5]和0.15M NaCl)洗涤两次。每次洗涤在室温下用简单涡流进行。
为了抗体检测，膜条用20ml(0.10M Tris-HCl[pH7.5],0.15M NaCl和0.5％脱脂牛奶)封闭1小时，然后在含有1/1000抗荧光素-HRP偶联物(NEN)的10毫升同样缓冲液中再培养1小时。膜条以简单涡流用50ml(0.10M Tris-HCl[pH 7.5]和0.15M NaCl)洗涤三次。显色反应参照厂商推荐(NEN)用显色检测HRP的RENAISSANCE 4CN Plus反应5分钟。
相对信号强度用CCD摄像机(Colu高性能CCD摄像机，日本)测定，并用Gel-Pro ANALYZER软件(Media Cybemetics,Silver Spring,Md.)分析。
对含有纯化DNA规定样品的检测试验。通过滴定实验，发现最适竞争序列的量(既要获得检测下限，也要可重复扩增)是每个样品试验6x10-9pmol(亦即，3600分子)。因此，在该试验中对于铜绿微囊蓝细菌NIVA-CYA 43的测试中使用了6x10-9pmol竞争序列。微囊蓝细菌DNA的系列稀释液是从大约107到100基因组拷贝(假定一个基因组大小为5±3Mb(9b))，将该系列稀释液用于竞争性PCR试验(图2A)和随后的标记试验(图2B)。
对目标产物相对于竞争产物比率的测定，如通过琼脂糖凝胶电泳测定，给出了从105到102基因组拷贝的定量范围(图2C)。相反，本发明的标记试验给出了大于107到102的基因组拷贝的定量范围。与琼脂糖凝胶电泳测定试验相比，动态范围大约增加了100倍(图2C)。通过将显色检测反应的培养时间从5增加到30分钟，少至10拷贝也可在标记测试中被检测到。显色检测反应的实时视频捕捉也可用来提供低至该水平的定量范围。亦即，可用目标点和竞争产物点的彩色密度从0到30分钟的时间曲线来外推相对信号强度，虽然竞争点在30分钟后彩色密度达到饱和。
标记反应中循环次数对定量范围的作用。与直接检测扩增的DNA相比，循环标记反应增加了该试验的定量范围。对于竞争性PCR-使用目标浓度的对数比例尺-竞争信号和目标信号比得到一条具有相对窄的定量范围的S形曲线(见图2C)。S形曲线也可通过仅数次循环的循环标记试验得到。然而，通过增加标记循环次数，竞争寡核苷酸或目标寡核苷酸分别在各系列稀释度终点达到标记饱和(所有探针都被标记)，导致具有更宽定量范围的曲线(见图2C)。增加循环次数进一步导致中部更平坦的曲线，由于两种寡核苷酸都在该位置达到标记饱和。
水样品中微囊蓝细菌的定量测定。整个定量试验包括对系列稀释的(105-109细胞/毫升)铜绿微囊蓝细菌(菌株NIVA-CYA 43和228/1)进行固相细胞浓缩和DNA纯化方法。阿氏浮游发菌(Planktothrix agardii)NIVA-CYA 29(丝状)和累氏鱼腥蓝细菌(Anabaena lemermannii)NIVA-CYA 83/1(丝状并含有异型胞)用作反应特异性对照。蓝细菌培养物稀释于纯水、含105细胞/毫升阿氏浮游发菌NIVA-CYA 29的水、含105细胞/毫升累氏鱼腥蓝细菌NIVA-CYA 83/1的水，以及从挪威Akersvatnet湖取得的水样。
对于不同的测试条件，试验特异性和灵敏度无显著差异。用6x10-9pmol竞争物我们在所有情况下都得到了从大于105到低至102细胞/毫升的定量范围(对于铜绿微囊蓝细菌NIVA-CYA 43的结果显示于图3)。通过将显色检测反应的培养时间从5分钟延长到30分钟，我们可检测低至10个细胞/毫升。
整个检测试验(包括固相细胞浓缩和DNA纯化)的检测曲线和获自纯化DNA系列稀释液的曲线具有相同的斜率(比较图2C和3)，表明细胞浓缩和DNA纯化(样品制备)方法不受样品组成的影响。另外，这些结果也显示固相细胞浓缩和DNA纯化方法可用于对水样直接定量分析。
检测极限取决于所用的竞争物量，具有更低的竞争物下限(6x10-9pmol)。10倍增加竞争物量(6x10-8)也导致检测下限增加10倍(图4)。然而，将(竞争物)量降低至6x10-10pmol得到不可重复性结果。因此，我们的结论是6x10-9pmol的竞争物量对于水样的完全试验是获得检测下限和重复性检测的最适竞争物量。
定量测定水中蓝细菌的完整试验。属于微囊蓝细菌属的蓝细菌能产生数种不同的毒素，而肝毒性微囊藻素是最强的。该毒素不仅导致肝损伤的急性中毒，而且可能是长期低剂量接触的致癌性肿瘤促进剂。因此，用来筛选产生该毒素的有机体存在的连续监测系统是重要的。
澳大利亚卫生局(新南威尔士蓝绿藻特遣部队，1992)已经采纳了基于水中蓝细菌细胞数目的三级警报系统。第1级为500-2000细胞/毫升，在该级警告水源管理当局，并增加监测的水样。第2级是2000-15000细胞/毫升，在该点进行毒性测试。第3级为15000细胞/毫升以上，如果不能用活性炭(清除毒性)，则宣布该水对人类使用不安全。由于微囊蓝细菌检测下限为100细胞/毫升和大于此3个数量级的定量范围，本文所述的方法适用于监测饮用水中低微囊蓝细菌浓度和强毒性水花的检测。
多重试验的发展。用固相细胞浓缩和DNA纯化方法常规制备样品，与检测方法的特异性结合，使得多重测定成为可能。使用竞争性PCR，多重目标DNA可以通过在竞争性反应中使用通用的16S rDNA引物定量测定。然后，可根据不同细菌群的特征性序列标记不同寡核苷酸探针，最后，可比较竞争物信号比率与各细菌组的信号。
实施例2与根据形态学/细胞学的传统分类法不同，根据核酸序列的分类法反映了有机体的进化和系统发育。构建了目标为16S rDNA的探针，来检测主要的蓝细菌群微囊蓝细菌，阿氏浮游发菌，鱼腥蓝细菌和束丝蓝细菌。还构建了探针来区别系统发育深度不同的蓝细菌群。构建了一种探针来检测念珠蓝细菌群(它包含鱼腥蓝细菌和束丝蓝细菌)，而构建了另一种探针来检测所有的真杆菌(包含叶绿体)。构建的探针的特异性用单种藻培养物检测。该信息然后用于确定在7个湖泊群落中目标有机体的相对分布和丰度。
有机体和样品的制备使用了挪威水研究所的下列单种藻培养物柔细蓝束丝蓝细菌NIVA-CYA103，累氏鱼腥蓝细菌NIVA-CYA 266/1，念珠蓝细菌NIVA-CYA 124，席蓝细菌NIVA-CYA 203，阿氏浮游发菌NIVA-CYA 320，铜绿微囊蓝细菌NIVA-CYA 143，水花微囊蓝细菌NIVA-CYA144，湖泊假鱼腥蓝细菌NIVA-CYA276/6。在培养液Z8中进行培养[挪威水研究所，Oslo(1990)藻类培养收集，菌株目录]。荧光灯提供光照，用30μEm-2s-1照射菌株。用微量离心机5,000rpm离心10分钟沉淀稠培养液等分(1毫升含有大约107个细胞)，然后立即-80℃冷冻。用磁珠DNA直接DNA分离试剂盒(Dynal A/S,Oslo,Norway)从冷冻沉淀物中纯化DNA，使用修改的蓝细菌纯化[Rudi K.,Kroken,M.,Dahlberg,O.J.,Deggerdal,A.,Jakobsen,K.S.和Larsen,F.(1997)生物技术22,506-11]的方案。
如下文所述的细胞浓缩步骤，将野外收集的样品立即保存在异丙醇中。然后将样品送到实验室，进行进一步加工。用固相细胞浓缩和先前由Rudi等(1998)开发的DNA纯化法纯化DNA。在固相法中，将0.8ml水溶液中的细胞用20分钟吸附到缓冲液中的顺磁珠上(最终体积为2毫升)，所用缓冲液含有50％异丙醇，0.75M醋酸铵和1U(珠在200微升裂解液中)Dynabeads DNA DIRECT(Dynal A/S,Oslo,Norway)。磁珠和吸附的细菌用MPC-Q磁铁(Dynal A/S)吸着到2毫升微量离心管壁上。然后加入20微升4M鸟嘌啉硫氰酸酯-1％十二烷基肌苷酸钠，65℃培养10分钟。加入40微升96％乙醇将DNA沉淀到珠上，然后室温培养5分钟。最后，DNA和珠复合物用500微升70％乙醇洗两次，在每次洗涤之间使用磁铁。为了除去剩余乙醇，将复合物在65℃干燥5分钟。全部珠和DNA复合物然后用于扩增反应。
PCR扩增核糖体DNA用通用引物组合CC-CD扩增。扩增反应使用GeneAmp 2400PCR热循环仪(Perkin Elmer,Norway,Conn.)，含有10pmol引物，各200μM各种脱氧核苷酸三磷酸，10mM Tris-HCl(pH8.8),1.5mM MgCl2,50mM KCl,0.1％Triton X-100,1U DynaZyme DNA聚合酶(Finnzymes Oy,Espoo,Finland)和纯化的DNA终体积50微升。在扩增前，DNA在94℃变性4分钟，扩增后72℃进行7分钟的延伸步骤。循环用以下参数进行35轮96℃15秒，70℃30秒，和72℃1分钟。
循环标记在循环标记反应中使用了扩增反应的20微升PCR产物。双脱氧核苷酸三磷酸通过加入100nm Tris-HCl(pH 8.0),50nm MgCl2和1U虾碱性磷酸酶(USB,Cleverland,OH)去磷酸化，然后37℃培养1小时。最后，96℃加热10分钟灭活磷酸酶。
循环标记反应以80微升体积进行，含有各3pmol下表1中的各引物，10pmolddATP,10pmol ddGTP,10pmol ddTTP(Boehringer GmbH,Mannheim,Germany),7pmol荧光素-12-ddCTP(NEN,Boston,Mass.),1.25μl热测序酶反应缓冲液，1.1微升酶稀释缓冲液，0.15微升的32U/微升热测序酶(Amersham Pharmacia plc,Buckinghanshire,England)和25μl磷酸酶处理过的PCR产物。标记用以下参数进行10轮95℃30秒和50℃4分钟。
表1-寡核苷酸探针
1将与这些探针序列互补的引物点样于膜上。
杂交和显色检测取与标记反应所用的引物互补的引物半微升(100pmol/微升)点样至膜条(4x5cm)Hybon(Amersham)上，然后用5000焦耳/cm2紫外光交联。膜条在预杂交溶液中37℃预杂交2小时，该溶液含有0.7xSSC,1xSPEP,5x Denhardts和100μg/ml异源DNA。将循环标记反应的产物加到2ml微量离心管中的0.5ml杂交溶液中(0.7xSSC,1xSPEP,1x Denhardts,10％硫酸葡聚糖和100μg/ml异源DNA),95℃变性5分钟。加入膜条，继续37℃温和翻转培养2小时。膜条用50毫升(1xSSC，和1％SDS)洗涤，然后用50毫升(0.1xSSC和0.1％SDS)洗涤，最后用50毫升(0.10M Tris-HCl[pH7.5]和0.15M NaCl)洗涤两次。每次洗涤在室温下用简单涡流进行。
为了抗体检测，膜条用20ml(0.10M Tris-HCl[pH7.5],0.15M NaCl和0.5％脱脂牛奶)封闭1小时，然后在含有1/1000抗荧光素-HRP偶联物(NEN)的20毫升同一缓冲液中再培养1小时。膜条以简单涡流用50ml(0.10M Tris-HCl[pH 7.5]和0.15M NaCl)洗涤三次。显色反应参照厂商推荐(NEN)用显色检测HRP的RENAISSANCE 4CN Plus反应5分钟。
用Agfa快镜扫描仪600扫描此膜确定相对信号强度，并用Gel-Pro ANALYZER软件(Media Cybemetics,Silver Spring,Md.)分析。
对纯培养物探针标记试验的验证对代表了主要谱系的8种不同蓝细菌菌株进行了探针标记试验。包括了外类绿菌，作为探针特异性的额外对照。将从单种藻培养物中纯化的DNA约5％用通用探针对CC-CD，以50微升PCR反应体积扩增。产物在标记前先在1.5％溴乙锭染色的琼脂糖凝胶上显像，以确证扩增反应。所有样品同样扩增，得到大约600bp的强条带，没有可见的额外条带。
和探针标记试验相关，对于所测试的菌株(除了湖泊假鱼腥蓝细菌NIVA-CYA 276/6)通用探针pUN相对一致的作标记(图5A)。对于外类绿菌该探针也被标记。除了探针pPL2，不同蓝细菌特异性探针根据各菌的系统发育位置，提供了如预料的信号(图5B和C)。pPL2的低特异性可能是由于使用的杂交温度对该探针不是最适的。然而在该测试中存在高信噪比。例如，在铜绿微囊蓝细菌NIVA-CYA143和144之间只有1个碱基对的差异。探针pMI2区分NIVA-CYA143和144时的信噪比为80。
荧光标记双脱氧核苷酸的掺入效率是序列依赖性的。由于探针-目标杂交效率，在探针标记中也有不同。碱基组成和熔点，除了侧接探针区域的序列外，都影响探针杂交。如同对本工作开发的探针相对于通用探针pUN标记所确定的那样，不同的标记效率范围从1.0到5。对各探针而言，效率如下pKO-1.7,pM13-2.2,pM12-1.4,pDK-1.9,pPL1-4.0,pAL-1.6,pAP-3.3,pNOS-4.3，和pPL2-4.9。
选自7个地方的蓝细菌的分布对7个不同地方的水样(从具有中等植物生物量(半自养)的水到高生物量(富养)的水)，检验了样品制备和探针标记方法的通用性。
从各采样地点采集了三个样品。对所有三个样品，同时进行如上所述的细胞浓缩和DNA纯化。从90,9，和1％纯化的材料中扩增核糖体DNA。对于90％的纯化DNA，获得了对Φstensjφvantnet v Oslo,Gjaersjφen和rungen的扩增反应。对于9％的材料，除了来自Langen的样品，所有样品都被扩增，而对于1％材料，获得了对所有样品的扩增反应。
对于各调查地点，计算探针标记的平均信号强度和标准偏差(根据三个收集的样品)。由于不同探针不是被等效标记的，各数据根据获自纯培养物分析的相对标记效率来校正(图6)。该图中的条图显示了样品中确定基因型的大约相对组成。由于在用于相关研究的一些培养物中有异养细菌的未知成分，各有机体量可能被高估。
作为探针标记试验的进一步验证，用显微镜检查了样品。在此，根据形态学和细胞学特征，按照Skulberg等提供的标准确定了每个地点的优势菌种[Skulberg,O.M.Carmichael,W.W.,Codd,G.A.和Skulberg R.(1993)海鲜和饮用水中的藻类毒素，145-164页，Falconer I.R.编辑，London Academic Press Ltd]。遗传学和显微镜分析确定样品中的有机体类群之间通常有良好的相关性。然而，遗传学分析中使用的16S rDNA基因对于菌种水平的辨别其序列变化不足。另外，我们不能用探针标记试验区别形态学定义的鱼腥蓝细菌属和蓝束丝蓝细菌。理由是，用于辨别的两个位置和菌种命名不符。这可能是由于对于各位置已有几种独立的取代，也可能是由于在两种探针之间16S rDNA中发生了重组，或菌种定义不是系统发育相关的。另一方面，分级探针pNOS似乎对念珠蓝细菌组有特异性-包含鱼腥蓝细菌和蓝束丝蓝细菌。
浮游发菌特异性探针pPL1对Gjaersjφen湖样品的探针标记试验提供了相对强的信号，而用显微镜检查该湖水未检测到该有机体。这种差异可用以下事实解释显微镜分析的样品是在分析前通过2微米浮游生物网浓缩的，而对于遗传学分析该样品是直接分析的。另外，蓝细菌在该湖中可能不是平均分布的，这也可解释探针标记和显微镜检查之间的差别。
权利要求
1．一种检测核酸分子中目标核苷酸序列的方法，其特征在于，该方法包括a将一寡核苷酸探针和所述核酸分子结合；b在存在所述目标核苷酸序列时，选择性标记结合的寡核苷酸探针；c将标记的寡核苷酸和互补序列杂交；以及d随后检测所述标记。
2．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸探针通过掺入标记的核苷酸而被标记。
3．如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述标记的核苷酸是标记的双脱氧核苷酸。
4．如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，选择性标记在存在一个或多个标记的核苷酸和一个或多个未标记的核苷酸时发生。
5．如权利要求4所述的方法，其特征在于，选择性标记在存在一个标记的核苷酸和三个未标记的核苷酸时发生。
6．如前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，寡核苷酸探针被设计成在3′末端与非目标核苷酸序列有一个或多个错配。
7．如前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，连续进行多个标记步骤。
8．如前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，与标记的寡核苷酸互补的序列固定于固相载体上。
9．如权利要求8所述的方法，其特征在于，固相载体是膜条或核酸芯片。
10．如前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述步骤a到d通过扩增含有目标序列的核酸分子进行。
11．如权利要求10所述的方法，其特征在于，含有目标序列的核酸分子与竞争性核酸分子共同扩增。
12．如权利要求11所述的方法，其特征在于，竞争性核酸分子含有和竞争性寡核苷酸探针互补的识别序列。
13．如权利要求12所述的方法，其特征在于，竞争性寡核苷酸探针在和竞争性分子杂交后被选择性标记。
14．如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将标记的竞争性寡核苷酸与互补序列杂交，并随后检测该标记。
15．如前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，存在于单一样品中的多种不同目标核苷酸序列同时或基本同时被检测。
16．如权利要求15所述的方法，其特征在于，和寡核苷酸探针互补的序列固定在固相载体分散的、预定的位置上。
17．一种测定目标核苷酸序列量或含有目标核苷酸序列的细胞数目的方法，其特征在于，所述方法包括权利要求1到16中任一项所述的检测方法。
18．一种检测样品中存在细菌的方法，其特征在于，所述方法包括权利要求1到16任一项所述的方法。
19．如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述细菌是蓝细菌。
20．用于实施前面任一项权利要求所述方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括a一种寡核苷酸探针，其能够和含有目标核苷酸序列的目标核酸分子结合，亦即，针对该核酸分子中的目标区域；b选择性标记寡核苷酸探针的工具；以及c和寡核苷酸探针互补的核苷酸序列，优选固定于固相载体上。
全文摘要
本发明涉及一种检测核酸分子中目标核苷酸序列的方法,该方法包括:(a)将一寡核苷酸探针和所述核酸分子结合;(b)在存在所述目标核苷酸序列时,选择性标记结合的寡核苷酸探针;(c)将标记的寡核苷酸和互补序列杂交;以及(d)随后检测该标记;这些方法适合于对微生物群体进行定性和定量测试。
文档编号C12Q1/68GK1308685SQ9980487
公开日2001年8月15日 申请日期1999年4月1日 优先权日1998年4月1日
发明者K·鲁迪, K·S·雅各布森 申请人:简珀恩特联合股份有限公司