专利名称：用于抗hiv之dna免疫的自我复制的载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于抗HIV之DNA免疫的自我复制的重组载体，本发明还涉及含有所述载体的疫苗，制备该载体的方法和含有该载体的宿主细胞，本发明还涉及所述载体用于制备抗HIV之疫苗的用途以及治疗或预防HIV的方法。
背景技术：
脊椎动物(因此也包括人类)与病原体微生物，如细菌，真菌和病毒之间的相互作用由脊椎动物对入侵微生物发动免疫应答的能力来调节。该反应以免疫系统区分自我与非我的能力为基础；在正常情况下，免疫应答耐受生物体自身结构，细胞和抗原性分子，而攻击由入侵微生物表达的外源抗原。当脊椎动物，如人被微生物感染时，免疫应答通过杀死微生物或被微生物感染的细胞或通过在中和性抗体的作用下防止感染扩散而有助于清除感染。其次，更重要的是，一旦对入侵生物体产生了免疫应答，该反应即有一种与生俱来的记忆机制，因此，曾被某种特定微生物感染的个体经常具有免疫力而不会第二次被这种微生物感染。
在正常情况下由感染所致的免疫记忆是以多种方式模拟天然感染的疫苗的基础。理想的疫苗在经免疫的个体中不会导致症状，或只会导致轻微症状，但仍会诱导免疫记忆，在疫苗遭遇有问题的微生物时能够引发强的预防性免疫应答。
抗特定微生物之疫苗的设计取决于处于天然感染状态下的生物体清除该特定生物体并防止以后的感染的机制。关于免疫应答如何能引发其有利的功能，存在几种方法。首先，由B淋巴细胞合成和分泌的抗体能结合微生物并通过补体介导的裂解破坏该微生物；其次，中和性抗体可通过抑制微生物与其靶细胞的结合而防止感染扩散；第三，与补体激活相联系的抗体可破坏被感染的细胞；最后，特异性的细胞毒T淋巴细胞(CTL)可杀死并破坏被微生物感染的细胞。据认为由人免疫缺损病毒(HIV)1型和2型(HIV-1和HIV-2)引发的免疫应答涉及所有这些机制。然而，被HIV感染的个体中的免疫应答的特征通常在于强的抗体反应和较低的效力，甚至缺乏T淋巴细胞反应(Gerstott，J等，Scand.J.Immunol.22(5)463-470，1985；Re，M.C等，临床病理学杂志，42(5)282-283，1989)。这就是为什么尽管有强的抗体-介导的免疫应答，但个体一旦被HIV感染仍会产生慢性感染的原因。
针对病毒感染的预防性免疫应答一般由上文所述的4种免疫应答介导，但已知能杀死病毒感染细胞的CTL反应最为有效，这就是为什么一般所说的活减毒病毒疫苗最有效的原因。实际上，Jenner在200多年前研制出第一个疫苗，可预防小-痘病毒感染的活痘苗病毒就是该原理的一个例子。当用活的减毒的病毒疫苗免疫个体时，宿主细胞被感染，病毒蛋白质得以合成。一些病毒蛋白质分子可用于产生病毒颗粒，而其它病毒蛋白质分子被蛋白酶水解成能结合主要组织相容性(MHC)抗原(对人而言为HLA Ⅰ和Ⅱ类)的小肽并被呈递给感染细胞表面的T淋巴细胞。随后，携有适当T细胞受体(TCR)的T淋巴细胞会识别与HLA结合的外源肽，或者帮助B细胞产生抗体(辅助/诱导型T细胞；Th)，或者破坏感染细胞(细胞毒T淋巴细胞；CTL)。
尽管经过数十年的努力，但仍未研制出有效的抗人免疫缺损病毒(HIV)感染和AIDS的疫苗。最早的努力致力于得到具有抗HIV外膜糖蛋白gp120/gp160之中和抗体的除菌免疫力。然而，对gp160/gp120所作的相Ⅰ/Ⅱ研究表明中和抗体只能抗实验室毒株，而不能中和野生型分离物。
相反，猴免疫缺损病毒(SIV)模型中的减毒病毒实验已获得成功。NEF或REV基因缺失的SIV可用作减毒病毒并能保护经免疫接种的动物免于发病，但不能抗野生型攻击病毒的感染。至于REV-缺陷的病毒，与保护作用仅有的免疫学联系是细胞介导的免疫(CMI)反应，该反应针对的是SIV调节蛋白NEF和TAT。在此实验中有一重要发现，即经免疫的动物甚至能清除野生型攻击病毒所致的感染。最近，据报道被HIV感染的病人有时也能清除明显的感染。在这些动物和/或人研究中，与保护作用仅有的相关联系似乎是细胞介导的抗HIV免疫应答。
用蛋白质免疫一般得不到这种类型的免疫应答。对HIV而言，活的减毒疫苗可以有效地预防感染，但有几个原因使得它们在理论上是危险的。最近描述的方法基因免疫(同义词核酸免疫，DNA免疫)具有活减毒疫苗的几个优点但不具有所述疫苗潜在的有害的副作用。一旦该DNA载体被转染至宿主细胞，以携有一个或几个病毒蛋白质基因的真核表达载体形式存在的DNA疫苗即可诱导病毒蛋白质的合成。靶细胞中合成的病毒蛋白质可被蛋白酶加工；所形成的肽与MHC/HLA分子结合并呈递在转染细胞的表面。这会导致CTL-介导的免疫学记忆，当个体随后被野生型强毒病毒感染时，能在感染后立即有效地杀死被病毒感染的细胞从而防止感染。直接肌内或真皮内注射包含于真核表达质粒中的cDNA可以诱导免疫应答(Wolff等，科学2461465-1468，1990)。通过这种方式表达外源抗原主要导致辅助性T-细胞亚型1(TH1)型免疫应答和强的细胞毒T-淋巴细胞(CTL)反应，有时也会导致高滴度的抗体反应(Wang，B等，PNAS 904156-4160，1993；Wang等，Ann.NY Acad.Sci 772186-197，1995；Haynes等，AIDS Res.Hum.Retroviruses 10(2)43-45，1994)。另外，据报道使用甲型流感病毒的病毒核蛋白抗原可产生抗原-特异性的CTL和保护作用(Ulmer等，科学，259，1745-1749，1993)。另外，使用DNA免疫已获得抗小鼠支原体感染的保护作用(Barry等，自然377(6550)632-635，1995；Lai等，DNA细胞生物学，14(7)643-651，1995)和抗兔模型中的人乳头瘤病毒感染的保护作用(Donnelly等，传染病杂志，173(2)314-320，1996)。也可使用DNA免疫诱导由细胞毒淋巴细胞介导的抗肿瘤免疫力(Bohm等，癌症免疫学和免疫理论，44(4)230-238，1997)。
相对于活的减毒病毒疫苗而言，DNA免疫有几个优点。由于没有形成感染性病毒，导入宿主生物体的病毒基因仅在最初被感染的那些细胞中停留，未产生病毒感染的症状。在HIV问题上，通过突变野生型强毒病毒可逆转活的减毒病毒主要的理论上有害的后果。另外，仅可使用那些已知能有效诱导预防性免疫应答的病毒基因或其部分进行DNA免疫。
对有效的CTL反应而言，重要的是细胞毒T细胞可在形成结构蛋白之前和释放成熟的病毒颗粒之前破坏感染细胞。因此，针对病毒周期之早期蛋白质的免疫应答是有利的。HIV的复制由其自身的调节基因和蛋白质调节。HIV基因组编码3个非结构性调节蛋白(NEF，TAT，REV)，它们是体内病毒复制所必需的。REV可将基因组RNA转运至胞质中，TAT上调病毒转录，NEF提供静息细胞中的复制。用SIV进行的实验表明缺乏上述调节基因之一种功能的病毒因病毒不能充分复制而不能诱导疾病。在病毒感染周期的前几个小时，这3种蛋白质瞬时少量地进行表达(Ranki等，Arch.Virol.139365-378，1994)。只有一小部分被HIV感染的个体对这些蛋白质显示出体液和/或细胞反应，该反应与有利的临床病程有关。
已深入研究了抗NEF，TAT和REV的CTL反应。NEF-特异性的CTL和Th(T辅助细胞)反应与有利的临床预后有关。至于REV缺损的SIV-疫苗，抗NEF和TAT的免疫应答是保护性的。已鉴定了TAT和REV蛋白中的Th和CTL表位，它们由被HIV-1感染的个体识别并显示出临床相关性(Blazevic等，AIDS杂志，6881-890，1993；Blazevic等，AIDS Res.Hum.Retroviruses 111335-1341，1995)。总之，这些结果表明为了获得针对疾病的保护作用，可能需将病毒的中度复制(减毒生长)与针对调节蛋白的特异性免疫应答相结合，所述调节蛋白参与支持病毒复制。
DNA免疫可使用几个真核表达载体，但它们的效力各不相同。调节给定表达载体诱导免疫应答之效力的一些参数是未知的，但高水平表达抗原蛋白显然是有利的。导入细胞的载体表达外源抗原性病毒蛋白质的时限可能也很重要。最后，在某种程度上诱导细胞损伤的表达载体可能也是有利的，因为已知组织损伤会通过几种生物活性分子，如细胞因子，淋巴因子和趋化因子扩大免疫应答，所述分子是由表达抗原性蛋白质的细胞分泌的。这可能是在某种程度上导致组织和细胞损伤的活的减毒病毒也能有效诱导免疫力的另一个原因，因此，在此方面模拟活的减毒疫苗的DNA载体也是有利的。
在HIV-1感染中，非特异性因子，如细胞因子和淋巴因子可能也可调节病毒复制和免疫应答。Clerici和Shearer(今日免疫学14(3)107-111，1993)和其他人已阐明辅助细胞Th1/Th2平衡的作用，该作用由特异于两种辅助T细胞群体的淋巴因子的产生来表现。最近，将CD8细胞产生的能抑制被HIV-1感染的CD4细胞产生病毒的适当因子鉴定为RANTES，MIPI-α和MIPI-β(Cocchi等，科学270(5243)1811-1815，1995)。在HIV-1感染中，其产生的量增加或减少的细胞因子可调节病毒转录。
使用编码HIV调节蛋白NEF的基因进行的DNA免疫研究阐明了T细胞增殖反应(Hinkula等，疫苗15(8)874-878，1997和Hinkula等，J.Virol.Jul，71(7)5528-5539，1997)。然而，它是具有与有利的临床病程相关的积极效果的CTL反应。
因此，本发明的一个主要目的是提供编码HIV调节蛋白的DNA免疫疫苗，在感染周期的早期，新的成熟的感染性病毒颗粒释放之前，该疫苗能引发抗HIV-感染细胞的CTL反应。
本发明的另一个目的是提供疫苗，该疫苗还能引发抗HIV的体液反应。
本发明的另一个目的是提供可安全使用的HIV疫苗，因为该疫苗不会将受体暴露于HIV的结构基因或蛋白质。
本发明的另一个目的是提供自我复制的载体，该载体可导致HIV调节蛋白长期高水平的表达并在某种程度上破坏细胞，其会进一步刺激免疫应答。
本发明的另一个目的是提供能表达HIV调节蛋白的自我复制的重组载体，该载体在包括哺乳动物细胞的转染细胞中能长期稳定地维持并保持高拷贝数。
本发明的另一个目的是提供含有所述载体的宿主细胞。
本发明的另一个目的是提供制备上述自我复制的载体的方法。
本发明还提供了治疗或预防HIV的方法。
本发明的另一个目的是所述载体制备抗HIV之DNA免疫疫苗的用途。
发明简述本发明的目的是通过下列方法实现的，即将编码HIV调节蛋白NEF，REV或TAT或其免疫活性片段的异源核苷酸序列掺入载体中，所述载体含有乳头瘤病毒E1基因和E2基因，乳头瘤病毒基本的(minimal)复制起点和乳头瘤病毒微型染色体维持元件。
换句话说，本发明涉及自我复制的重组载体，该载体含有基本上由下列组分组成的乳头瘤病毒核苷酸序列(ⅰ)乳头瘤E1基因和E2基因，(ⅱ)乳头瘤病毒基本的复制起点，(ⅲ)乳头瘤病毒微型染色体维持元件和编码HIV调节蛋白NEF，REV或TAT或其免疫活性片段的异源核苷酸序列。
本发明还提供了含有所述载体，用于抗HIV的DNA免疫的疫苗；所述载体用于制备HIV疫苗的用途；治疗或预防HIV的方法，所述方法包括给有此需要的人施用有效量的自我复制的载体并在所述人体中表达NEF，REV或TAT蛋白或其免疫活性片段。
本发明还提供了制备自我复制的重组载体的方法，所述方法包括A)将编码HIV调节蛋白NEF，REV或TAT或其免疫活性片段的异源核苷酸序列插入载体中，该载体含有基本上由下列组分组成的乳头瘤病毒核苷酸序列(ⅰ)乳头瘤病毒E1基因和E2基因，
(ⅱ)乳头瘤病毒基本的复制起点，(ⅲ)乳头瘤病毒微型染色体维持元件和B)用所得的自我复制的重组载体转化宿主细胞，C)培养宿主细胞，和D)回收所述载体。
本发明还提供了含有所述载体的宿主细胞。
附图简述
图1A显示了穿梭载体pUE83。
图1B显示了穿梭载体pNP177。
图2显示了本发明的pBNtkREV质粒。
图3显示了本发明的pBNsrαTAT质粒。
图4显示了本发明的pBNsrαNEF质粒。
图5显示了被pBNsrαNEF转染的COS-7细胞中的NEF表达。转染后72小时采集Western印迹样品并用ECL进行肉眼观察。
图6阐明了Western印迹检测到的经pBNsrαNEF免疫的小鼠血清中的抗NEF抗体。最后一次免疫后2周取样品1-4，最后一次免疫后4周取样品5-8。
图7显示了经pBNsrαNEF载体免疫的小鼠中的CTL反应。图7A显示了CTL反应，由最后一次免疫后2周4只受试小鼠的靶细胞特异性裂解的百分比表示。图7B显示了最后一次免疫后4周的值，特异性裂解＞4％被认为是阳性的。
图8显示了经pBN-Nef免疫的3只小鼠中免疫球蛋白亚类的分布。
发明详述根据本发明，将异源HIV核苷酸序列插入载体中，所述载体含有乳头瘤病毒E1基因和E2基因，乳头瘤病毒基本的复制起点(MO)和乳头瘤病毒微型染色体维持元件(MME)。下文中将含有E1/E2/MO/MME的载体称为pBN，WO97/24451(列入本文作为参考)中详细描述了该载体。所述专利公开基于下列发现，即乳头瘤病毒由MO本身开始的DNA复制不足以稳定地长期持续，但需要另一个病毒序列MME，当载体还含有乳头瘤病毒的E1和E2基因时能得到最佳结果。
本文所用“乳头瘤病毒”指的是乳头瘤病毒家族中的任何成员。优选本发明中使用的乳头瘤病毒是牛乳头瘤病毒(BPV)或人乳头瘤病毒(HPV)。
“E1”和“E2”是乳头瘤病毒的调节蛋白，它们经由MO复制并且是复制所必需的。
“基本复制起点”(MO)是乳头瘤病毒的DNA合成起始所最小的基本序列。
“微型染色体维持元件”(MME)指的是乳头瘤病毒基因组中能与乳头瘤病毒复制所必需的病毒或人蛋白质结合的区域。MME是宿主中稳定的附加型维持乳头瘤病毒MO所必需的。优选MME含有多个转录激活蛋白E2结合的位点。
本申请中所用的“自我复制的载体”指的是能在真核宿主细胞中自主复制的载体质粒。
“异源”指的是外源，例如，就本发明的载体而言，异源核苷酸序列指的是非乳头瘤病毒序列。
“免疫活性片段”指的是能引发受体中免疫应答的片段。
“基本上由……组成的乳头瘤病毒核苷酸序列”指的是含有乳头瘤病毒核苷酸序列的载体，所述序列对载体的长期维持和复制来说是必需的和足够的。例如，这意味着已从本发明所用的pBN载体中缺失了不必要的序列，如所有由乳头瘤-编码的致癌序列。
除了E1和E2基因，MO，MME和NEF，REV或TAT基因以外，本发明的载体还含有编码蛋白质所用的启动子以及其它调节序列，聚腺苷酸化序列和内含子。优选载体还包括细菌宿主细胞的复制起点和一个或多个选择标记的基因以在细菌宿主细胞中制备载体DNA。
pBN载体的必要特征是它们不是宿主细胞特异性的载体。这是因为E1和E2蛋白的表达受非天然，即异源启动子的控制。所述启动子在广泛的哺乳动物细胞或组织中具有功能，或是细胞或组织特异性的启动子。
在本发明的载体中，优选E1基因受sr-α启动子或胸苷激酶启动子(tk)的控制，优选E2基因受LTR gag启动子的控制。NEF，REV或TAT基因可受CMV启动子或RSV LTR启动子的控制。载体还可含有SV40早期启动子以诱导抗生素选择(新霉素或卡那霉素)基因的表达。
本发明载体中的宿主细胞复制起点优选为pUC ORI，所用选择标记为例如卡那霉素和/或新霉素，优选内含子为β-珠蛋白IVS。
在TK启动子基的质粒中发现的octseq是八聚体蛋白质的非编码序列，它在质粒中不具有功能，但却是产生适当限制性位点以制备最终质粒所必需的。
插入pBN中的NEF，REV或TAT基因可得自几个商购来源，如AIDSReagent Project MHC repositary的质粒pKP59。所述基因是众所周知的，并已被完整地测序(Wain-Hobson等，细胞，409-17，1985)。当然，也可以插入仅编码所述HIV蛋白之免疫活性片段的序列。
首先将NEF，REV或TAT基因或其片段插入适当的穿梭载体。这些载体可包括或不包括MO区域。实施例中阐明了两个穿梭载体不包括MO的pNp177和包括MO的pUE83。不过也可以使用其它穿梭载体。优选在大肠杆菌中增殖穿梭载体和所得的本发明载体。图2，3和4中示出了本发明所得载体pBN-NEF，pBN-REV或pBN-TAT的例子。本发明的载体是稳定的并以多拷贝数进行自我复制。通过转染真核宿主细胞，载体(质粒)将增殖并产生100-1000倍量的新质粒，每个新质粒都能表达所需的HIV蛋白。
本发明中要求保护的宿主细胞可以是被载体转染的真核细胞，也可以是被载体转化的原核细胞。真核细胞优选为哺乳动物细胞，原核细胞优选为细菌细胞，尤其是大肠杆菌。
在转染的COS-7细胞和被所述质粒免疫的小鼠中检测本发明所得质粒载体的HIV NEF，REV和TAT表达。在COS-7细胞中阐明了HIV蛋白的高表达，经免疫的小鼠中显示出显著的体液和细胞介导(CTL)的免疫应答。在猴中也阐明了显著的CTL反应。这些结果表明本发明的载体可潜在地用作有效的HIV疫苗。
还阐明编码不同HIV调节蛋白的pBN-载体混合物对几种调节基因产生了免疫应答。因此，本发明包括含有编码不同HIV调节蛋白或其免疫活性片段之载体的混合物的疫苗，以及所述混合物在制备疫苗和治疗或预防HIV中的用途。疫苗可含有编码所有3种不同的调节蛋白之载体的混合物。本发明的疫苗还可含有其它基因或基因片段，如HIV结构基因。
下列实施例将进一步阐明本发明。实施例详细描述了本发明的一些实施方案，但不应将其理解为对本发明的限制，本发明是由所附权利要求书限定的。
于37℃用XbaⅠ和XhoⅠ(New England BioLabs，USA)将扩增基因和pUE83穿梭载体(图1)消化过夜以得到相容的末端。在1.5％琼脂糖凝胶上分析经消化的DNA片段，使用Band Prep试剂盒(PharmaciaBiotech，瑞典)进一步纯化之。16℃保温过夜以用T4 DNA连接酶(NewEngland BioLabs，USA)将各个基因分别连接至载体中。用连接产物转化One Shot试剂盒(Invitrogen，荷兰)中的感受态大肠杆菌细胞，将经转化的细胞铺于含有卡那霉素的LB平板上进行选择。从生长的克隆中制备少量质粒DNA，通过用XhoⅠ和XbaⅠ消化来分析克隆基因的存在。使用上述引物，由少量制备的质粒DNA制品进行PCR也可证实克隆基因的存在。大量培养含有正确基因的克隆，使用Megaprep柱(Qiagen，德国)纯化质粒。第2阶段用HindⅢ(New England BioLabs，USA)消化穿梭载体中含有BPVori，RSV LTR启动子，REV-或TAT-基因和b-珠蛋白IVS poly(A)的DNA片段，使用1％琼脂糖凝胶和Band Prep试剂盒纯化之，连接至经HindⅢ消化和脱磷酸化(碱性磷酸酶，CIP，Promega，USA)的pBNsrα或pBNtk中，转化细胞，按第一阶段中所述证实克隆基因的存在并纯化质粒。
所得质粒被称为pBNtkREV和pBNsrαTAT，并示于图2和3。
首先用XhoⅠ消化图1B所示的穿梭载体pNP177，然后用Klenow酶和dNTP混合物处理，最后用XbaⅠ消化。还用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)处理载体。
14℃，使用T4连接酶将合有NEF基因的片段与经裂解的pNP177载体连接过夜。使用One Shot感受态大肠杆菌试剂盒(Invitrogen)进行转化。使用限制性酶消化和电泳鉴定阳性克隆。在大肠杆菌中进一步扩增质粒DNA，用Qiagen柱进行大规模纯化。所得的最终质粒被称为pNP177cHIVNEF。第2阶段穿梭载体pNP177被设计成仅具有其间可克隆插入物的两个HindⅢ位点，因此，质粒的HindⅢ消化物给出可进一步克隆的片段。将pNP177cHIVNEF的HindⅢ片段克隆至pBNsrα，用HindⅢ消化载体并用CIP进行处理。按与第一阶段相同的方法进行带分离，连接和转化，通过限制性分析证实正确方向的插入物，最终的质粒被称为pBNsrαNEF，并如图4所示。
转染至COS-7细胞之后72小时，通过检测裂解细胞的Western印迹，发现载体产生了强的瞬时的HIV调节蛋白表达。用pBNsrαNEF得到的结果示于图5。在转染细胞的长期培养物中，经自我复制的pBN载体转染的细胞中的NEF表达持续了7周。
还使用NEF-转染细胞制备cytospin制品，用苏木精染色该细胞，按Ovod等，文献同上所述，在免疫组化中先使用抗NEF的单克隆抗体，再使用生物素化的抗小鼠第二抗体。cytospin载玻片显示出在大量细胞中观察到作为阳性染色的表达，因为颗粒体占据了细胞质。表达NEF的部分细胞显示出细胞破坏的形态学迹象，表明细胞编程性死亡。尽管细胞的状况越来越差，但表达水平仍然较高。
在第1，2，3，10，11和12天，按照厂商说明使用上述基因枪在8只小鼠的腹部皮肤上进行接种。每只小鼠共施用6微克pBN-NEF，最后一次接种后2周处死两组中的4只小鼠，最后一次接种后4周处死其余4只小鼠。取出血清样品进行Western印迹，收集脾细胞进行CTL试验。被pBN-NEF-载体免疫的所有8只小鼠在第2周和第4周显示出抗体反应(图6)，Western印迹中的反应强度各不相同。4C．检测经免疫小鼠体内的细胞毒T细胞活性4C1．刺激效应细胞免疫后2周(16只小鼠)和4周(16只小鼠)，无菌取出经免疫小鼠的脾脏。用Hanks液破碎脾脏，用纱布过滤，除去红细胞。然后将细胞以5×106/ml的浓度悬浮于RPMI 1640培养基中，所述培养基含有10％胎牛血清(FCS；GibcoBRL)，1％谷氨酰胺，100U青霉素/ml，100(克链霉素/ml和5×10-5M 2-巯基乙醇。在含有5ml培养基的25ml细胞培养瓶中，将反应细胞(5×106)与4×106个抗原呈递细胞(APC；见下文)共培养5天。第1天，在细胞中加入10U/ml重组白细胞介素-2(rIL-2)(Hiserodt J等，免疫学杂志，Jul，135(1)53-59，1985；Lagranderie M等，病毒学杂志，Mar，71(3)2303-2309，1997；Tsuji T等，免疫学，Jan，90(1)1-6，1997；Vahising H.L等，免疫学方法杂志17511-22，1994；Varkila K等，Acta Path.Microbiol.Immunol.Scand.Sect.C 95141-148，1987)。4C2．抗原呈递细胞用经修饰可表达HIV-1 LAI NEF基因(MVA-HIVNEF)的痘苗病毒Ankara(MVA)感染同系的P815肥大细胞瘤(H-2d)细胞。MVA是高度减毒的复制缺损的痘苗病毒，它可用作表达异源基因的有效载体，其在生物学上的安全性水平非常高(Sutter G等，病毒学杂志，Jul，68(7)4109-4116，1994；Sutter等，疫苗，12(11)1032-1039，1994；Drexler Ⅰ等，普通病毒学杂志，79347-352，1998；Sutter G等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910847-10851，1992)。在24孔板中，以5为感染复数(MOI)进行MVA-HIVNEF感染(1×106个细胞/孔)。37℃进行病毒吸附1小时之后，将细胞于37℃保温15小时(Carmichael A等，病毒学杂志，708468-8476，1996)。转染后，用含有10％FCS的PBS(磷酸盐缓冲盐水)将细胞洗涤2次，再以5×106个细胞/ml的浓度将细胞悬浮于上述洗涤溶液中。然后以5000rad的γ-射线照射细胞，用培养基洗涤细胞再加入效应细胞。4C3．细胞毒性试验通过51Cr-释放试验(Hiserodt J等，免疫学杂志，Jul，135(1)53-59，1985；Lagranderie M等，病毒学杂志，Mar，71(3)2303-2309，1997；Varkila K等，Acta Path.Microbiol.Immunol.Scand.Sect.C 95141-148，1987；van Baalen C等，AIDS7781-786，1993)检测CTL活性。简单地说，按上文所述，使用与抗原呈递细胞相同的方法用MVA-HIVNEF感染2×106个P-815细胞。感染后用无血清培养基洗涤细胞1次。然后将靶细胞悬浮于200微升无血清培养基中，37℃加入100μCi51Cr(Amersham)/1×106个细胞达1小时。然后用培养基洗涤靶细胞4次，悬浮于培养基中使浓度为5×104个细胞/ml。用培养基将经刺激的效应细胞洗涤1次，再加入靶细胞中。以100微升(5×103个细胞)/孔的量将靶细胞铺于U-底96孔板中，以效应细胞靶细胞的比例为50，25和12.5加入3份各为100微升的效应细胞。为了自发地释放，将靶细胞铺于6个含有100微升培养基的孔中，为了最大程度地释放，将靶细胞铺于6个含有2.5％Triton-X-100的孔中。将培养板稍作旋转，37℃保温4小时，用γ-计数器计数上清液。靶细胞特异性裂解的百分比被计算为(检测的51Cr释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)×100。特异性裂解的百分比≥6％即被认为是阳性。
在经pBNsrαNEF免疫的8只小鼠中有6只显示出CTC活性的例子示于图7。4D．经免疫小鼠的体液免疫应答为了检测经免疫的小鼠血清中抗HIV-1 NEF抗体的存在，在PAGE上电泳NEF蛋白，转移至硝酸纤维素滤膜上，按上文所述测定抗体反应性。
结果概述转染和免疫试验的结果概述于表1。通过免疫印迹(WB)评估经免疫小鼠的体液免疫应答，通过细胞毒T淋巴细胞(CTL)试验检测其细胞介导的免疫力。如表中所述，被NEF表达载体免疫的所有8只小鼠都显示出体液和细胞介导的免疫应答。表1．通过免疫印迹(Western印迹，WB)或免疫组化阐明被所述载体转染的COS-7细胞中HIV-1 NEF，TAT和REV蛋白的表达，并阐明经其中一个载体pBNsrαNEF免疫的小鼠中对体液和细胞介导的免疫应答的诱导作用转染 免疫WB 免疫组化 WB CTLpBNsrαTATND++6/86/8pBNtkREV +++7/87/8pBNsrαNEF++ND6/86/8在此研究中，我们阐明按上述使用自我复制的表达载体对小鼠进行DNA免疫可诱导明显可测的CTL反应。另外，还获得了体液免疫应答。从上述结果看，我们可以认为pBN-NEF，pBN-REV和pBN-TAT质粒在体内的确表达NEF，REV和TAT，而表达量足以诱导预防或治疗HIV所需的体液和细胞-介导的免疫应答。
免疫方案如下所述在2周内，用24微克实施例2中所述的pBN-Nef免疫4只Balb/c小鼠达6次，因此，DNA的总量为144微克，用Western印迹分析血清中的抗体。4只小鼠中有3只具有抗HIV-1 Nef的抗体，按下述在ELISA试验中测定这些抗体的亚类用移液管将抗原转移至Nunc Maxi Sorb培养板中，4℃保温过夜；所用抗原是溶于PBS中的HIV-1 Nef蛋白(NIH，AIDS Research andReference Program)(50ng/孔)。与1％BSA(Sigma)保温过夜以封闭培养板，然后于室温下与小鼠血清(用封闭溶液稀释100倍)保温4小时，用PBS-0.1％吐温20将培养板洗涤3次，再用PBS将培养板洗涤2次。将用封闭溶液稀释1000倍的过氧化物酶缀合的抗小鼠IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3和IgM(Calbiochem)用作第二抗体，室温下保温培养板2小时。按先前的描述进行洗涤步骤之后，加入底物ABTS(Sigma)和过氧化氢(溶于柠檬酸盐缓冲液)达10分钟，用ELISA-读数仪在405nm处进行光度测定，结果示于图8。用IgG2a第二抗体在3只小鼠中检测到最高反应(405nm处的吸收值分别为0.117，0.262，0.743)，用IgG1抗体检测到的反应要低得多(A(405)0.004，0.020，0.038)。这表明这些小鼠经肌内免疫后的反应类型纯粹是导致细胞介导的免疫应答的Th1型。
结果表明在实际操作中，所有小鼠都具有强的针对重组Nef的IgG2a型反应，而其它IgG亚类的抗体非常少。该结果进一步证实了pBNNef构建体能引发Th1型反应，随后是强的细胞介导的免疫应答，该反应在病毒感染周期的早期能破坏HIV-感染细胞。
3只猴中有1只具有显著的针对表达HIV-1 Nef和Tat的自身B细胞的CTL反应。结果表明表达HIV调节蛋白的pBN构建体不仅可免疫小鼠，也可免疫灵长类动物，经免疫的动物将会产生细胞介导的T细胞反应，其特征在于能在病毒感染周期的早期破坏HIV-感染细胞的细胞毒T淋巴细胞的存在。另外，结果表明构建体可作为混合物同时施用，混合物中一个构建体的存在不会干扰另一个构建体产生的免疫应答。
权利要求
1．自我复制的重组载体，该载体含有基本上由下列组分组成的乳头瘤病毒核苷酸序列(ⅰ)乳头瘤E1基因和E2基因，(ⅱ)乳头瘤病毒基本的复制起点，(ⅲ)乳头瘤病毒微型染色体维持元件和编码HIV调节蛋白NEF，REV或TAT或其免疫活性片段的异源核苷酸序列。
2．权利要求1的自我复制的载体，其中乳头瘤病毒是牛乳头瘤病毒(BPV)。
3．权利要求1或2的自我复制的载体，其中异源核苷酸序列编码HIV-1 NEF蛋白。
4．上述权利要求之任一项的自我复制的载体，其中E1受sr-α启动子或胸苷激酶启动子的控制。
5．权利要求4的自我复制的载体，其为图2，3或4所示的pBNtkREV，pBNsrαTAT或pBNsrα NEF。
6．用于抗HIV之DNA免疫的疫苗，其含有权利要求1-5中任一项的自我复制的载体。
7．权利要求6的疫苗，其含有编码不同HIV调节蛋白或其免疫活性片段之载体的混合物。
8．制备权利要求1-5中任一项的自我复制的重组载体的方法，所述方法包括A)将编码HIV调节蛋白NEF，REV或TAT或其免疫活性片段的异源核苷酸序列插入载体中，该载体含有基本上由下列组分组成的乳头瘤病毒核苷酸序列(ⅰ)乳头瘤E1基因和E2基因，(ⅱ)乳头瘤病毒基本的复制起点，(ⅲ)乳头瘤病毒微型染色体维持元件，和B)用所得的自我复制的重组载体转化宿主细胞，C)培养宿主细胞，和D)回收所述载体。
9．权利要求8的方法，其中宿主细胞是大肠杆菌细胞。
10．权利要求9的制备抗HIV之DNA免疫疫苗的用途。
11．权利要求9的制备疫苗的用途，所述疫苗含有编码不同HIV调节蛋白或其免疫活性片段之载体的混合物。
12．治疗或预防HIV的方法，所述方法包括给有此需要的人施用有效量的权利要求1-5中任一项的自我复制的载体并在所述人体中表达NEF，REV或TAT蛋白或其免疫活性片段。
13．权利要求12的方法，所述方法包括施用编码不同HIV调节蛋白或其免疫活性片段之载体的混合物。
14．含有权利要求1-5中任一项的自我复制的载体的宿主细胞。
15．权利要求14的宿主细胞，其为细菌细胞或哺乳动物细胞。
全文摘要
将编码HIV调节蛋白NEF,REV或TAT或其免疫活性片段的核苷酸序列插入载体中,所述载体含有对长期维持而言为必需的和充足的乳头瘤病毒核苷酸序列,所得载体为自我复制的并具有高拷贝数。它们长期大量地表达HIV基因。载体引发了体液和细胞介导的免疫应答,因此是潜在的抗HIV DNA免疫疫苗。本发明涉及所述载体和疫苗以及制备该载体的方法。本发明还涉及含有该载体的宿主细胞,该载体用于制备疫苗的用途和预防或治疗HIV的方法。
文档编号C12N15/48GK1295623SQ99804629
公开日2001年5月16日 申请日期1999年2月26日 优先权日1998年2月27日
发明者M·塔蒂恩, P·彼得森, K·克罗, P·A·兰克 申请人:免疫技术芬兰有限公司