专利名称：酚氧化酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型酚氧化酶，具体地说，涉及源自葡萄穗霉属(Stachybotrys)菌株的新型酚氧化酶和生产这些酶的葡萄穗霉属新型菌株。本发明提供了表达葡萄穗霉属酚氧化酶的方法和宿主细胞以及生产表达系统的方法。本发明还涉及修饰有色化合物和在织物洗涤过程中防止染料转移的方法。此外，本发明还涉及用于污点漂白或抗染料转移的加酶洗涤剂组合物。
酚氧化酶通过催化氧化还原反应[即，电子从电子供体(通常是酚类化合物)向分子氧(它起电子受体的作用)的转移，分子氧被还原为H2O]而起作用。虽然能应用各种不同酚类化合物作为电子供体，但酚氧化酶对于作为电子受体的分子氧来说是很专一的。
酚氧化酶应用范围广，包括洗涤剂工业、纸和纸浆工业、纺织工业和食品工业。在洗涤剂工业中，酚氧化酶被用于防止溶液中的染料在洗涤剂洗涤过程中从一件织物转移到另一件织物(这种应用常被称为染料转移的抑制)。
大多数酚氧化酶在酸性pH范围内表现最适pH，但在中性或碱性pHs中无活性。
已知酚氧化酶可由多种真菌生产，包括下属的种曲霉属(Aspergillus)、脉孢菌属(Neurospora)、柄孢壳属(Podospora)、葡萄孢属(Botytis)、侧耳属(Pleurotus)、层孔菌属(Fomes)、射脉菌属(Phlebia)、栓菌属(Trametes)、多孔菌属(Polyporus)、丝核菌属(Rhizoctonia)和香菇属(Lentinus)。然而，仍需要鉴定和分离酚氧化酶以及能自然地生产酚氧化酶的生物体，这些酶给出适用于洗涤剂洗涤方法和组合物中的碱性范围内最适pH。
本发明涉及可得自葡萄穗霉属的新型酚氧化酶，它们尤其在中性或碱性pH时能修饰与具有不同化学结构的染料和有色化合物相关的颜色。基于它们的颜色修饰能力，本发明的酚氧化酶可被用于例如纸浆和纸漂白，用于漂白织物上污点的颜色以及在洗涤剂和织物的应用中防止染料转移。在本发明的一方面，当不存在时所述酚氧化酶能修饰颜色本发明涉及可得自葡萄穗霉属的新型酚氧化酶，它们尤其在中性或碱性pH时能修饰与染料和具有不同化学结构的有色化合物相关的颜色。基于它们的颜色修饰能力，本发明的酚氧化酶可被用于例如纸浆和纸漂白，用于漂白织物上污点的颜色以及在洗涤剂和织物的应用中防止染料转移。在本发明的一方面，当不存在增强剂时所述酚氧化酶能修饰颜色。在本发明的另一方面，当不存在增强剂时所述酚氧化酶能修饰颜色。
在本发明的一个实施方案中，酚氧化酶可得自葡萄穗霉属。在另一个实施方案中，葡萄穗霉属酶选自下组菌株S．parvispora(尤其包括S．parvispora var．hughes MUCL 38996)；S．chartarum的菌株(尤其包括S．chartarum MUCL 38898)；S．parvispora MUCL 9485；S．chartarum MUCL 30782；S．kampalensis MUCL 39090；S．theobromae MUCL 39293；以及S．bisbyi、柱孢葡萄穗霉(S．cylindrospora)、S．dichroa、S．oenanthes和S．nilagerica的菌株。一方面，本发明提供了一种酚氧化酶，它的分子量约为38kD(通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定的)。另一方面，本发明提供了一种酚氧化酶，它的分子量约为30．9kD(通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的)。
当得自S．parvispora或S．chartarum的菌株的部分纯化的酚氧化酶被煮沸并经历SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析时，观测到三种分子量。就得自S．parvispora MUCL 38996的酚氧化酶来说，三种分子量约为70kD、45kD和22．1kD。就得自S．chartarum MUCL 38898的酚氧化酶来说，三种分子量约为58．4kD、46．1kD和19．7kD。本发明包括任何这样的酚氧化酶活性这些分子量中任一种单独固有的或与这些分子量中至少另一个的组合。本发明还包括任何这样的酚氧化酶在煮沸后，它们表现出表观分子量的增大，其中，所述分子量是通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的。
本发明还包括这样的酚氧化酶它们能修饰与染料或有色化合物相关的颜色，并且它们具有至少一个与S．parvispora MUCL 38996自然地生产的酚氧化酶和／或S．chartarum MUCL 38898自然地生产的酚氧化酶相同的抗原组(是通过Quchterlony法测定的，其中，阳性酶表现免疫沉淀线)。在一个实施方案中，免疫沉淀线是1型线。在一个实施方案中，所述酚氧化酶(它具有至少一个与S．parvispora MUCL38996自然地生产的酚氧化酶相同的抗原组)可得自葡萄穗霉属。本发明还包括葡萄穗霉属酚氧化酶突变体，只要该突变体能修饰与染料或有色化合物相关的颜色即可。
在又一个实施方案中，本发明提供了一种编码可得自葡萄穗霉属的酚氧化酶的分离多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含一条核酸序列，它具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％和至少95％与序列1或序列3的同一性，只要该多核苷酸编码能修饰与染料或有色化合物相关的颜色的酚氧化酶即可。本发明还包括这样的多核苷酸序列它们能在中度至高度严格性的条件下与序列1或序列3中所示多核苷酸杂交或者与之互补。本发明还提供了编码序列2中所示氨基酸序列的多核苷酸。在一个优选的实施方案中，所述多核苷酸具有序列1或序列3中所示的核酸序列。本发明还提供了包含本发明的多核苷酸的表达载体和宿主细胞。
本发明另外还涉及生产可得自葡萄穗霉属的酚氧化酶的方法。于是，本发明提供了一种生产所述酶的方法，该方法包括如下步骤获取一种宿主细胞，该宿主细胞包含编码所述可得自葡萄穗霉属的酚氧化酶的多核苷酸，其中，所述酶具有至少65％与序列2中公开的氨基酸序列的同一性；在适合生产所述酚氧化酶的条件下培养所述宿主细胞；以及任选地回收生产的所述酚氧化酶。本发明还提供了一种生产酚氧化酶的方法，该方法包括如下步骤培养重组宿主细胞，该重组宿主细胞的特征在于，它表达编码可得自葡萄穗霉属的酚氧化酶的多核苷酸，其中，所述酶具有至少65％与具有序列2中所示序列的氨基酸的同一性；以及任选地回收所述酚氧化酶。在一个实施方案中，所述多核苷酸存在于复制型质粒上；而在另一个实施方案中，所述多核苷酸被整合入宿主基因组。
在一个实施方案中，所述多核苷酸包含序列1中所示序列。在另一个实施方案中，所述多核苷酸包含序列3中所示序列。在进一步的实施方案中，所述多核苷酸能在中度至高度严格性的条件下与序列1或序列3杂交或者与序列1或序列3互补。
本发明还提供了一种生产重组宿主细胞(它包含编码本发明的酚氧化酶的多核苷酸)的方法，该方法包括如下步骤将一种多核苷酸(它编码可得自葡萄穗霉属并且具有至少65％与序列2中公开的氨基酸序列的同一性的酚氧化酶)导入宿主细胞；以及任选地在适合生产所述酚氧化酶的条件下培养所述宿主细胞。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含序列1中所示的序列。在另一个实施方案中，所述多核苷酸包含序列3中所示的序列。在进一步的实施方案中，所述多核苷酸能在中度至高度严格性的条件下与序列1或序列3杂交或者与序列1或序列3互补。
在本发明的一方面，重组宿主细胞包含编码酚氧化酶的多核苷酸，所述重组宿主细胞包括丝状真菌、酵母和细菌。在一个实施方案中，所述宿主细胞是包括曲霉属的种、木霉属的种(Trichoderma species)和毛霉属的种(Mucor species)的丝状真菌。在一个优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞包括A．niger var．awamori和T．reseei。
在本发明的另一个实施方案中，所述宿主细胞是酵母，它包括酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和Yarrowia的种。在又一个实施方案中，酵母属的种是酿酒酵母(S．cerevisiae)。在又一个实施方案中，宿主细胞是革兰氏阳性菌(例如芽孢杆菌属的种(Bacillus species))，或是革兰氏阴性菌(例如埃希氏菌属的种(Esterichia species))。本发明还包括纯化得自这类宿主细胞的酚氧化酶的方法。
本文还提供了包含氨基酸的洗涤剂组合物，所述氨基酸的序列与具有序列2中公开的氨基酸序列的酚氧化酶有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性，只要该酶能修饰与染料或有色化合物相关的颜色即可。在一个优选的实施方案中，所述氨基酸具有序列2中所示的序列。在另一个优选的实施方案中，所述酚氧化酶被包含序列1中所示序列的多核苷酸编码。在又一个实施方案中，所述酚氧化酶被包含序列3中所示序列的多核苷酸编码。在进一步的实施方案中，所述多核苷酸能在中度至高度严格性的条件下与序列1或序列3杂交或者与序列1或序列3互补。
本发明还包括修饰与织物上的污点中存在的染料或有色化合物相关的颜色的方法，该方法包括如下步骤将织物与包含一种氨基酸序列的组合物接触，所述氨基酸序列具有与具有序列2中公开的氨基酸序列的酚氧化酶至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性，只要该酶能修饰与染料或有色化合物相关的颜色即可。在该方法的一个实施方案中，所述氨基酸具有序列2中所示序列。在该方法的一方面，最适pH在5．0和11．0之间，在另一方面，最适pH在7和10．5之间，在又一方面，最适pH在8．0和10之间。在该方法的又一方面，最适温度在20和60℃之间，在另一方面，则在20和40℃之间。本发明还提供了防止洗涤剂和织物应用中的染料转移的方法。
本文还提供了洗涤剂组合物，该组合物包含单独的或者与增强剂和其它洗涤剂组分(包括蛋白酶、淀粉酶和／或纤维素酶)组合的、本发明的葡萄穗霉属酚氧化酶。
可被用于本发明的洗涤剂组合物中的增强剂包括但不限于吩噻嗪-10-丙酸(PPT)、10-甲基吩噻嗪(MPT)、吩噁嗪-10-丙酸(PPO)、10-甲基吩噁嗪(MPO)、10-乙基吩噻嗪-4-羧酸(EPC)乙酰丁香酮、丁香醛、丁香酸甲酯、2，2 ′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯(ABTS)和4-羟基-4-联苯基-羧酸或其衍生物。
图1阐述了Stachybotrys parvispora酚氧化酶氧化各种生色团的pH分布图。
图2阐述了在Stachybotrys parvispora酚氧化酶和疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)胆红素氧化酶之间比较直接蓝1漂白的pH分布图。
图3阐释了通过SDS聚丙烯酰胺凝胶测定的Stachybotrys charta-rum酚氧化酶的分子量。泳道1代表未煮过的样品，泳道2代表煮过的样品。
图4A-4B是Stachybotrys chartarum酚氧化酶(被称为St．ch．)与疣孢漆斑菌胆红素氧化酶(被称为biliru oxidas)和LEPTOTHRIXDISCOPHORA锰氧化蛋白(被称为mpf-A)的片段的氨基酸序列对比。
图5A-5B阐释了可得自Stachybotrys chartarum的酚氧化酶的核酸序列(序列1)和氨基酸序列(序列2)。
图6A-6B阐释了可得自Stachybotrys chartarum的酚氧化酶的基因组序列(序列3)。
图7是葡萄穗霉属酚氧化酶序列2(底线)和胆红素氧化酶(序列4)的氨基酸序列对比。
图8提供了被用于在曲霉属中表达葡萄穗霉属酚氧化酶的载体pGAPT的示意图。碱基1～1134包含黑曲霉葡糖淀粉酶基因启动子。碱基1227～1485和碱基3079～3100包含黑曲霉葡糖淀粉酶终止子。从1486到3078插入构巢曲霉(Aspergillus nidulans)pyrG基因作为真菌转化的标记。质粒的其余部分包含大肠埃希氏菌(E．coli)中繁殖的pUC18序列。编码序列1的葡萄穗霉属酚氧化酶的核酸被克隆入BglⅡ和XbaⅠ限制位点。
图9A-9B示出实施例17中描述的、PCR产生的葡萄穗霉属片段的核酸序列(在曲霉属中表达的)。
定义本文应用的术语“酚氧化酶”表示那些催化氧化还原反应并对作为电子受体的分子氧和过氧化氢来说是特异性的酶。当本发明的葡萄穗霉属酚氧化酶被煮沸后经历SDS凝胶电泳分析时，观测到三种分子量的物质。本文应用的术语“酶”包括这样的任何分子量物质它独自地或与至少一种其它分子量物质组合地能修饰与染料或有色化合物相关的颜色。
本文应用的术语“葡萄穗霉属”表示这样的任何葡萄穗霉属的种它生产能修饰与染料或有色化合物相关的颜色的酚氧化酶。本发明包括葡萄穗霉属的天然分离物的衍生物(包括子代和突变株)，只要该衍生物可生产能修饰与染料或有色化合物相关的颜色的酚氧化酶即可。在一个优选的实施方案中，所述酚氧化酶可得自葡萄穗霉属并通过实施例4和5公开的方法纯化。
本文应用的涉及酚氧化酶的术语“可得自”表示与源自所述特定的微生物菌株或由所述特定的微生物菌株天然生产的那些酶等效的酚氧化酶。例如，“可得自葡萄穗霉属的酚氧化酶”表示那些由葡萄穗霉属天然生产的酚氧化酶。本发明包括与葡萄穗霉属的种生产的那些酶相同的酚氧化酶，但它们是应用基因工程技术通过用编码所述酚氧化酶的核酸转化的非葡萄穗霉属生物生产的。“等效的”表示所述酚氧化酶具有至少一个与可得自S．parvispora MUCL 38996和／或S．chartarum MUCL 38898的酚氧化酶相同的抗原组(是通过Quchterlony法测定的，其中，阳性酶表现免疫沉淀线)。“等效的”也可表示所述酚氧化酶被一种多核苷酸编码，该多核苷酸能在中度至最大严格性的条件下与具有序列1或序列3中所示序列的多核苷酸杂交。“等效的”表示所述酚氧化酶包括至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％与具有序列2中所公开氨基酸序列的酚氧化酶的同一性。核酸水平的同一性百分数是应用FastA程序测定的，而氨基酸水平的同一性百分数则是应用TFastA得到的，这二者都是应用Pearson和Lipman的方法(美国国家科学院院报(PNAS USA)，1988，852444-2448)。“同一性”也可通过Jotun Hein方法(1990，酶学中的方法(Method in Enzymology)，183626-645)用DNAstar(DNASTAR，Inc．Maidson，WI 53715)的MegAlign程序测定，其中，间隙补偿(gap penalty)=11，间隙长度补偿(gap length penalty)=3，并且，成对序列对比参数Ktuple=2。本发明还包括本发明的酚氧化酶的突变体、变体和衍生物，只要所述突变的、变异的或衍生的酚氧化酶能保留天然酚氧化酶的至少一个特征活性即可。
本文应用的术语“有色化合物”是指对织物加色的物质或者导致污点的可视外观的物质。按“纤维和纺织技术辞典(Dictionary ofFiberand Textile Technology)”(Hoechst Celanese Corporation(1990)POBox 32414，Charlotte NC 28232)中的定义，染料是一类通过化学反应、吸附或分散被掺入纤维的有色化合物。染料的实例包括直接蓝染料、酸性蓝染料、直接红染料、活性蓝和活性黑染料。常用的织物染料目录见于“染料索引(Colour Index) ”，第3版，Vol．1-8。导致污点的可视外观的物质实例有多酚、类胡萝卜素、花色素苷、单宁、美拉德反应产物等。
本文应用的术语“修饰与染料或有色化合物相关的颜色”或者“修饰有色化合物”表示通过氧化改变了染料或化合物，于是，或者颜色看来被修饰了(即，颜色在直观上被减退了、减弱了、褪色了、漂白了或除去了)，或者颜色未受影响但化合物被修饰了以致染料再沉积作用受抑制。本发明包括通过任何方法修饰颜色，包括例如通过任何方法从织物上的污点完全除去有色化合物，以及减小颜色强度或者改变化合物的颜色。
“抗染料转移”或“抗染料再沉积”效果可能是酚氧化化合物的颜色修饰活性的作用(即，可溶性染料或有色组分被氧化或者被漂白了，所以不能作为染料再沉积在织物上)，或者是不存在颜色修饰时基底修饰的作用(以致染料或有色组分变成水溶性的而被冲洗掉)。单独地或与增强剂一起应用的酚氧化化合物在洗涤液中将可溶的或分散的染料或者有色化合物氧化成无色物质的能力可防止染料再沉积作用。
本文应用的术语“突变体和变体”，当涉及酚氧化酶时，是指通过改变其天然氨基酸序列和／或结构(例如通过改变结构基因的DNA核苷酸序列和／或通过直接取代和／或改变酚氧化酶的氨基酸序列和／或结构)而获得的酚氧化酶。本文应用的术语酚氧化酶“衍生物”是指全长天然的或变异的酚氧化酶氨基酸序列的一部分或片段，它保留天然酚氧化酶的至少一种活性。本文应用的术语“突变体和变体”，当涉及微生物菌株时，是指从某形式的天然分离物改变了的细胞，例如，改变了例如编码酚氧化酶的结构基因的DNA核苷酸序列；改变天然分离物以便增强酚氧化酶生产；或者影响酚氧化酶表达的其它改变。
术语“增强剂”或“介体”是指能与酚氧化酶一起修饰与染料或有色化合物相关的颜色的任意化合物，或者指增大酚氧化酶的氧化活性的化合物。该增强剂一般是有机化合物。酚氧化酶本发明的酚氧化酶通过催化氧化还原反应[即，电子从电子供体(通常是酚类化合物)向分子氧或过氧化氢(它起电子受体的作用)的转移，分子氧或过氧化氢被还原为水]而起作用。这类酶的实例有漆酶(EC 1．10．3．2)、胆红素氧化酶(EC 1．3．3．5)、酚氧化酶(EC 1．14．18．1)、儿茶酚氧化酶(EC 1．10．3．1)。
本发明包括葡萄穗霉属酚氧化酶，该酶能修饰与染料或有色化合物相关的颜色，并且具有至少一个与S．parvispora MUCL 38996天然产生的酚氧化酶和／或S．chartarum MUCL 38898天然产生的酚氧化酶相同的抗原组。一种测定共同抗原决定簇的存在的方法是应用免疫双扩散实验(Quchterlony法)，按Clausen，J．(1988)在“鉴定和估测大分子的免疫化学法”，Immunochemical Technique forthe Identificationand Estimation of Macromolecules)(第3版)Burdon，R．H．和P．H．vanKnippenberg编辑，第281页(附录11，显微技术)中叙述的方案和给定的条件；并且按Clausen在上文第6章，p143-146中描述的方案和给定的条件整理实验结果。测定共同抗原决定簇的存在的另一种方法是通过蛋白质印迹(“分子生物学中的现代方法”(Current Protocols inMolecular Biology)，Vol．2，John Wiley&Sons，Inc．第10．8部分免疫印迹法和免疫检测)。
可得自S．parvispora MUCL 38996并按实施例4和5生产的酚氧化酶具有约38千道尔顿(kD′s)的表观分子量(按SDS-PAGE分析法测定的)和低于2．8的表观等电点(如实施例6确定的)。可得自S．chartarum MUCL 38898并按实施例4和5的方法生产的酚氧化酶具有约30．9千道尔顿的表观分子量(按SDS-PAGE分析法测定的)。
本发明包括葡萄穗霉属酚氧化酶，它们包含至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％与具有序列2中所公开氨基酸序列的酚氧化酶的同一性。编码酚氧化酶的核酸本发明包括编码可得自葡萄穗霉属的种的酚氧化酶的多核苷酸，该多核苷酸包含至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％和至少95％与序列1或序列3中公开的多核苷酸序列的同一性，只要由该多核苷酸编码的酶能修饰与染料或有色化合物相关的颜色即可。在一个优选的实施方案中，酚氧化酶具有序列1所示的或序列3所示的多核苷酸序列或者能与序列1或序列3杂交或者与之互补。技术人员应懂得，由于遗传密码的简并性，有多种多核苷酸能编码序列2中公开的酚氧化酶。本发明包括所有这样的多核苷酸。
编码酚氧化酶的核酸可通过本领域已知的标准方法从例如克隆化DNA(例如，DNA“文库”)获得，通过化学合成，通过cDNA克隆，通过PCR，或者通过基因组DNA或其片段的克隆，从所需的细胞(例如葡萄穗霉属的种)纯化[例如，参见Sambrook等，1989，“分子克隆，实验指南”(Molecular Cloning，A laboratory Manual)，第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；Glover，D．M．(编辑)，1985，“DNA克隆一种实用的方法”(DNACloningA Practical Approach)，MRL Press，Ltd．，Oxford，U．K．，Vol．Ⅰ，Ⅱ]而获得。得自基因组DNA的核酸序列除了含编码区以外还可能含调节区。不管来源怎样，编码本发明的酚氧化酶的分离核酸在分子上都应被克隆入用于基因增殖的合适载体。
在得自基因组DNA的基因的分子克隆时，产生DNA片段，它们中的一些将编码所需的基因。可应用各种限制酶在特定的位点处切割DNA。也可应用DNA酶在锰存在下分割DNA，或者可通过物理法(例如，通过超声处理)剪切DNA。然后，可通过标准方法按尺寸分离线型DNA片段，所述标准方法包括但不限于琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳、PCR和柱色谱法。
一旦产生核酸片段，就可按数种方法完成对编码酚氧化酶的特定DNA片段的鉴定。例如，本发明酚氧化酶的编码基因或其特定RNA或者其片段(例如探针或引物)可被分离和标记，然后被用于杂交分析而检测产生的基因。(Benton，W．和Davis，R．，1977，科学(Science)196180；Grunstein，M．和Hogness，D．，1975，美国国家科学院院报(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)723961)。那些享有与探针大致的序列相似性的DNA片段将在严格条件下杂交。
本发明包括可得自葡萄穗霉属的种的酚氧化酶，它们是这样被鉴定的通过核酸杂交技术，应用序列1或序列3为探针或引物并且筛选基因组或cDNA源的核酸。编码可得自葡萄穗霉属的种的酚氧化酶并且具有与序列1或序列3至少65％同一性的核酸可应用探针、序列1或序列3的部分或片段通过DNA-DNA或DNA-RNA杂交或扩增而检测。因此，本发明提供了一种检测编码本发明酚氧化酶的核酸的方法，该方法包括将序列1或序列3的部分或全部核酸序列与基因组或cDNA源的葡萄穗霉属核酸杂交。
本发明还包括能与序列1中公开的核苷酸序列在中度至最高严格性条件下杂交的多核苷酸序列。杂交条件基于核酸结合复合体的解链温度(Tm)，如Berger和Kimmel(1987，“分子克隆技术指南，酶学中的方法”(Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods inEnzymology)，Vol 152，Academic Press，Scan Diego CA)的启示，该文献并入本文作参考，并且参照下文解释的、定义的“严格性”。
“最大严格性”一般出现在约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)；“高度严格性”在Tm以下约5℃～10℃；“中度严格性”在Tm以下约10℃～20℃；“低严格性”在Tm以下约20℃～25℃。本领域技术人员应懂得，“最大严格性杂交”可被用于鉴定或检测相同的多核苷酸序列，而“中度或低严格性杂交”则可被用于鉴定或检测多核苷酸序列同源物。
本文应用的术语“杂交”应包括“核酸链与互补链通过碱基配对连接的方法”(Coombs J(1994)，生物技术词典(Dictionary ofBiotechnology)，Stockton Press，New York NY)。
在聚合酶链反应(PCR)技术中进行的扩增方法被描述于Dieffenbach CW和GS Dveksler(1995，“PCR引物，实验手册”(PCRPrimer，a Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Press，PlainviewNY)。含有至少约10个核苷酸和得自序列1或序列3的大约60个核苷酸(优选约12～30个核苷酸，更优选约25个核苷酸)的核酸序列可被用作探针或PCR引物。
一种从cDNA或基因组文库分离本发明的核酸构建物的优选方法是应用聚合酶链反应(PCR)，它应用在具有序列2中所示氨基酸序列的蛋白质的氨基酸序列基础上制备的简并寡核苷酸探针。例如，可应用美国专利No．4，683，202中描述的方法进行该PCR。表达系统本发明提供了用于在宿主微生物(例如真菌、酵母和细菌)中生产可得自葡萄穗霉属的种的酚氧化酶的宿主细胞、表达方法和系统。一旦获得了编码本发明的酚氧化酶的核酸，即可应用本领域熟知的技术构建含该核酸的重组宿主细胞。分子生物技术被公开于Sambrook等，“分子生物学克隆实验指南”(Molecular Biology CloningAlaboratory Manual)，第2版(1989)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York，NY(1989)。获得这种核酸它编码可得自葡萄穗霉属的种的酚氧化酶并且具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％和至少95％与序列1或序列2的核酸的同一性，或者能在中度至高度严格性的条件下与序列1或序列3杂交或者与之互补；再应用合适的载体将该核酸转化入宿主细胞。适合在真菌、酵母和细菌中克隆、转化和表达的各种载体以及转化和表达盒是本领域技术人员已知的。
通常，所述载体或盒包含指导核酸的转录和翻译的序列、选择性标记以及使得能自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包括携带转录起始控制区的基因的5′区和控制转录终止的DNA片段的3′区。这些控制区可得自与宿主同源或异源的基因，只要选定的控制区能在宿主细胞中起作用即可。
适用于驱动宿主细胞中酚氧化酶的表达的起始控制区或启动子是本领域技术人员已知的。实际上，能驱动这些酚氧化酶的任何启动子都适合本发明。通过起始密码子将编码酚氧化酶的核酸与选定的表达控制区可操纵地连接而有效表达氧化酶或还原酶。一旦构建了合适的盒，就应用它们来转化宿主细胞。
普通转化方法讲授于“分子生物学中的现代方法”(Vol．1，Ausubel等编辑，John Wiley & Sons，Inc．，1987，第9章)，它们包括磷酸钙法、应用PEG转化和电穿孔。至于曲霉属和木霉属，可应用PEG和钙介导的原生质体转化(Finkelstein，“DB 1992转化”，参见丝状真菌的生物工程，技术和产品(Biotechnology of FilamentousFungi．Technology and Products)(Finkelstein & Bill编辑)113-156)。原生质体的电穿孔被公开于Finkelestein，“DB 1992转化”，参见丝状真菌的生物工程，技术和产品(Finkelstein & Bill编辑)113-156。对分生孢子的微粒轰击(microprojection bombardment)被描述于Fungaro等(1995)，“通过对完整的分生孢子微粒轰击而转化构巢曲霉”，FEMS微生物学通讯(FEMS Microbiology Letters)125293-298。农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化被公开于Groot等(1998)，“根癌农杆菌介导的丝状真菌的转化”，自然生物技术(NatureBiotechnology)，16839-842。至于酵母属的转化，乙酸锂介导的转化和PEG和钙介导的原生质体转化以及电穿孔技术都是本领域技术人员已知的。
包含本发明的酚氧化酶的编码序列并表达蛋白质的宿主细胞可通过本领域技术人员已知的各种方法鉴定。这些方法包括但不限于DNA-DNA或DNA-RNA杂交和蛋白质生物测定或免疫测定技术，它们包括用于检测和／或量化核酸或蛋白质的基于膜的、基于溶液的或基于碎片的技术。
如本文描述的那样，编码可得自Stachybotrys chartarum(MUCL38898)的酚氧化酶的基因组序列(序列3)是在A．niger var．awamori和Trichoderma reesei中被分离和表达的。可得自Stachybotryschartarum(MUCL 38898)的cDNA(序列3)是在酿酒酵母中被分离和表达的。酚氧化酶活性本发明的酚氧化酶能应用多种不同的酚类化合物作为电子供体，但对作为电子受体的分子氧或过氧化氢是很专一的。
根据特定的底物和反应条件(例如温度、增强剂的存在与否等)，每种酚氧化酶氧化反应都应具有最适pH。例如，按实施例4所述那样生产的Stachybotrys parvispora酚氧化酶具有约5．0～约7．0的最适pH(通过在20℃下以ABTS为底物保温2分钟而测定的)；约6．0～约7．5的最适pH(通过在20℃下以syringaldizin为底物保温2分钟而测定的)；以及约7．0～约9．0的最适pH(通过在20℃下以2，6-二甲氧基苯酚为底物保温2分钟而测定的)，并且它能氧化guiacol。
得自Stachybotrys chartarum MUCL 38898的、按实施例4和5所述那样生产并且具有序列2中所示氨基酸序列的酚氧化酶在20和40℃下都具有约8．0的最适pH(通过以DMP为底物和在总量为17．2μg的酶存在下保温而测定的)以及约5．0～7．0的最适pH(通过以ABTS为底物和在总量为1．7μg的酶存在下保温而测定的)。多酚氧化酶的应用如下文描述的那样，可得自葡萄穗霉属的酚氧化酶能氧化各种具有不同化学结构的染料或有色化合物(应用氧或过氧化氢为电子受体)。因此，本发明的酚氧化酶被用于需要修饰与染料或有色化合物相关的颜色的用途，例如漂白，除去织物上的食品污点和抗染料再沉积；织物；以及纸和纸浆应用。酚氧化酶的一个特别重要的特性是它们在约20～40℃下、在宽范围pHs(包括从中性到碱性pHs的宽范围)中表达高水平的酶活性。特别是它们在约7．0～约10．5的pH范围内和约20～35℃的温度下表达高水平的酶活性的能力。有色化合物在本发明中，有多种有色化合物可以成为被本发明的酚氧化酶氧化的靶。例如，在洗涤剂应用中，可作为污点在织物上出现的有色物质能成为靶。下文描述可能在污点中出现的数种或数类有色物质。卟啉衍生的结构通常与金属配位的卟啉结构构成一类出现在污点中的有色物质。实例有血迹中的血红素或正铁血红素，作为植物(例如草或菠菜)中的绿色物质的叶绿素。不含金属的物质的另一个实例是胆红素(血红素的黄色分解产物)。单宁，多酚单宁是某些类多酚的聚合形式。这样的多酚有儿茶精类、leuan-tocyanins等(P．Ribéreau-Gayon，植物酚类(Plant Phenolics)，Oliver &Boyd编辑，Edinburgh，1972，pp．169-198)。这些物质能与简单的酚(例如棓酸)结合。这些多酚物质出现在茶污、酒污、香蕉污、桃污等中，并且众所周知是难于除去的。类胡萝卜素类胡萝卜素是出现在番茄(番茄红素，红色)、芒果(胡萝卜素，橙黄色)中的有色物质(G．E．Bartley等，植物细胞(The Plant Cell)(1995)，Vol 7，1027-1038)。它们出现在也是众所周知难于除去的食物污点(番茄)中，尤其在彩色织物上，当未考虑到应用化学漂白剂时。花色素苷这些物质是出现在水果和花中有强烈色彩的分子(P．Ribéreau-Gayon，植物酚类，Oliver&Boyd编辑，Edinburgh，1972，pp．135-169)。与污点相关的典型实例是浆果，但还有酒。花色素苷在苷化型式方面具有高度的多样性。美拉德反应产物在蛋白质／肽结构存在下加热碳水化合物分子的混合物时，一般产生黄色／棕色物质。这些物质出现在例如烹调油中且难于从织物上除去。
为了防止洗涤过程中染料从一件彩色织物转移到其它织物，需要专门漂白洗涤液中的染料分子。有多种织物染料是氧化过程所需的靶例如，硫染料、瓮染料、直接染料、活性染料和偶氮染料。增强剂本发明的酚氧化酶能在有或没有增强剂时(根据化合物的特性而定)起修饰与染料或有色化合物相关的颜色的作用。如果一种化合物能作为酚氧化酶的直接底物，该酚氧化酶就能在没有增强剂时修饰与染料或有色化合物相关的颜色，不过，增强剂仍可能是最佳酚氧化酶活性所优选的。至于其它不能作为酚氧化酶的直接底物或者不能为酚氧化酶所直接接近的有色化合物，需要增强剂而实现最佳酚氧化酶活性和修饰颜色。
增强剂被描述于例如下列专利中1995年1月12日公开的WO 95／01426；1996年3月7日公开的WO 96／06930；以及1997年3月27日公开的WO 97／11217。增强剂包括但不限于吩噻嗪-10-丙酸(PPT)、10-甲基吩噻嗪(MPT)、吩噁嗪-10-丙酸(PPO)、10-甲基吩噁嗪(MPO)、10-乙基吩噻嗪-4-羧酸(EPC)乙酰丁香酮、丁香醛、丁香酸甲酯、2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯(ABTS)和4-羟基-4-联苯基-羧酸或其衍生物。培养物本发明包括葡萄穗霉属菌株和天然分离物，以及这些菌株和分离物的衍生物，例如S．parvispora的菌株(尤其包括S．parvisporavar．hughes MUCL 38996)；S．chartarum的菌株(尤其包括Stachybotryschartarum MUCL 38898)；S．parvispora MUCL 9485；S．chartarumMUCL 30782；S．kamoalensis MUCL 39090；S．theobromae MUCL39293；以及生产本发明的酚氧化酶的S．bisbyi、柱孢葡萄穗霉、S．dichroa、S．oenanthes和S．nilagerica的菌株。
本发明提供了葡萄穗霉属的新型菌株的大致生物纯的培养物，尤其是S．parvispora MUCL 38996和S．chartarum MUCL 38898菌株的大致生物纯的培养物(可从它们纯化酚氧化酶)。纯化本发明的酚氧化酶可这样生产在需氧条件下，在包含可同化的碳和氮与其它必需营养物的营养培养基中培养生产酚氧化酶的葡萄穗霉属菌株(例如S．parvispora MUCL 38996，S．chartarum MUCL38898)。所述培养基可按本技术中熟知的原理构成。
在培养过程中，生产酚氧化酶的菌株胞外分泌酚氧化酶。这就使得有可能通过例如从培养液分离细胞质(例如通过过滤或离心)而实现酚氧化酶的分离和纯化(回收)。形成的无细胞培养液可被直接应用，或者如果需要的话，可以先浓缩(例如通过蒸发或超滤)。如果需要的话，然后可从无细胞的培养液分离酚氧化酶并通过常规方法(例如通过柱色谱法)纯化至所需的程度或者甚至结晶。
本发明的酚氧化酶可被这样从培养液(酶被胞外分泌入该培养液)分离和纯化浓缩宿主培养物的上清夜，接着进行硫酸铵分级分离和凝胶渗透色谱处理。
本发明的酚氧化酶可根据它们的预期用途配制和利用。在这方面，如果被用于洗涤剂组合物，可应用美国专利证书No．4，689，297中描述的操作方法将酚氧化酶作为包衣固体直接从发酵液配制。此外，如果需要的话，可用合适的载体将酚氧化酶以液体形式配制。如果需要的话，该酚氧化酶还可被固定化。
本发明还包括包含本发明的葡萄穗霉属酚氧化酶的表达载体和重组宿主细胞，随后从该重组宿主细胞纯化酚氧化酶。洗涤剂组合物本发明的葡萄穗霉属酚氧化酶可被用于洗涤剂组合物或清洁组合物。这样的组合物除了含酚氧化酶之外还可以包含常规洗涤剂组分(例如表面活性剂、助洗剂)以及其它酶(例如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶或过氧化物酶)。其它组分包括增强剂、稳定剂、杀细菌剂、荧光增白剂和香料。该洗涤剂组合物可呈任意合适的物理形式，例如粉末、水性或非水液体、糊或凝胶。洗涤剂组合物的实例给出于1995年1月12日公开的WO 95／01426和1996年3月7日公开的WO96／06930中。
已这样描述了本发明的酚氧化酶之后，现在给出如下实施例是为了阐述但既不意味着又不能被认为是限制性的。除非另外说明，本文以百分数表达的稀释度、量等都是以每体积重量百分数(w／v)给出的百分数。本文应用的以％(v／v)表达的稀释度、量等都表示每体积体积的百分数。本文所指的温度以摄氏度(C)给出。实施例1Stachybotrys parvispora var．hughes菌株的分离和鉴定Stachybotrys parvispora var．hughes的一个新菌株是从琼脂营养培养基上的土壤样品分离的，并通过它生产具有氧化酶活性的酶的能力选定。
在25℃的玉米粉琼脂(DIFCO)上个别地培养该新菌株达三周。
S．parvispora的这一新菌株是通过其在25℃的玉米粉琼脂上于三周内小于4cm的缓慢生长、其分生孢子的形成和形成的分生孢子的形态特征而被鉴定的。
在25℃的玉米粉琼脂上生长三天后，显微镜观察表明S．parvispora的这一新菌株的细胞呈5．25×3．75～4．5mm尺寸的分生孢子形式，它们变得粗糙不平，聚集成深橄榄灰色胶质状小滴，它们是从聚簇在轮生体中的9～11×3．5～4．5mm瓶梗产生的。分生孢子梗呈长达200mm的光滑壁状(见Jong，S．C．和E．E．Davis，Mycotaxon3409-485．)。
将这样鉴定的S．parvispora的这一新菌株按布达佩斯条约的规定保藏在比利时微生物协调保藏中心，Mycoth_que de I′Universit_Catholique de Louvain(MUCL)，Place Croix du Sud 3，Louvain-La-Neuve，Belgium B-1348，1995年12月5日，被给予登记号MUCL 38996。实施例2Stachybotrys chartarum菌株的分离和鉴定Stachybotrys chartarum的一个新菌株(以前称为Stachybotrysatra var．corda)是从琼脂营养培养基上的土壤样品分离的，并通过它生产具有氧化酶活性的酶的能力选定。
在25℃的玉米粉琼脂(DIFCO)上个别地培养该新菌株达三周。
S．chartarum这一新菌株是通过其在25℃的玉米粉琼脂上于三周内大于4cm的迅速生长、其分生孢子的形成和形成的分生孢子的形态特征而被鉴定的。
在25℃的玉米粉琼脂上生长三天后，显微镜观察表明S．chartarum的这一新菌株的细胞呈8～11×5～10mm尺寸的分生孢子形式，它们变得粗糙不平，聚集成深橄榄灰色胶质状小滴，它们是从聚簇在轮生体中的10～13×4～6mm瓶梗产生的。分生孢子梗呈长达1000mm的光滑壁状(见Jong，S．C．和E．E．Davis，Mycotaxon 3409-485)。
将这样鉴定的S．chartarum的这一新菌株按布达佩斯条约的规定保藏在比利时微生物协调保藏中心，Mycoth_que de I′Universit_Catholique de Louvain(MUCL)，Place Croix du Sud 3，Louvaiu-La-Neuve，Belgium B-1348，1995年12月5日，被给予登记号MUCL 38898。实施例3接种用的分生孢子储备悬浮液的制备在PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)平板(DIFCO)上分离按上述实施例1中所述那样获得的Stachybotrys parvispora MUCL 38996。
将一个菌落悬浮于5ml含大约30颗无菌玻璃珠(直径为5mm)的0．9％(w／v)NaCl中。在涡动混合机(BENDER&HOBEIN AG)中充分搅拌该悬浮液直至获得菌丝体的完全均化物(全速搅拌约15～20分钟)。然后，将该匀浆的数份稀释液(在10-5～10-7的范围内)置于相应的无菌PDA平板上，在30℃下保温约5周使之形成分生孢子(呈深棕色)。
然后，用5ml0．9％(w／v)NaCl分散三块各含大约50个分离的形成孢子的菌落(通过它们的深棕色证实)的平板，并用玻璃棒摩擦使分生孢子悬浮。汇集形成的悬浮液，应用Miracloth(CALBIOCHEM)膜过滤以便除去残余的菌丝体。结果是分生孢子储备悬浮液。
然后，通过将稀释液[于0．9％(w／v)NaCl中]固定在PDA平板上测定形成的悬浮液的效价(按每ml的菌落形成单位(cfu)测定的)。形成的分生孢子储备悬浮液的效价在106～107cfu／ml的范围内。实施例4酚氧化酶的生产得自Stachybotrys parvispora的酶的生产这样预备一个盛葡萄糖和马铃薯提取物的二十升发酵罐将4．5千克去皮并切成小片的马铃薯在15升水(milli-Q级)中煮30分钟，通过亲水棉滤网(STELLA)过滤形成的悬浮液，收集所得滤液，然后在收集的滤液中补加300克葡萄糖。再将该补加了葡萄糖的滤液置于发酵罐中，在120℃下灭菌30分钟。该已灭菌的补加滤液的pH为5．8。
然后，用15ml按上述实施例3获得的分生孢子储备悬浮液接种该二十升发酵罐，在37℃下进行发酵达144小时。
在4．5升／分钟的恒定空气流中和100RPM(每分钟的转数)(直径13cm)的恒速搅拌下未控制pH进行发酵。
然后，从发酵罐中抽取大约50ml培养(发酵)液样品，在12，000g下离心5分钟。再分离上清液与粒状沉淀。
然后，应用如下基于ABTS[2，2′-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯)]被氧氧化的标准检定方法测定上清液中酚氧化酶活性的存在制备了体积为1ml的最终反应物，它含三[三(羟甲基)氨基甲烷]／HCl 200mM(pH7．0)、0．9mM ABTS(得自SIGMA的二铵盐)和适当量待检定的制剂(在该实施例中，它是下述用水稀释的上清液)。检定反应是通过添加待检定的制剂(在该实施例中，它是上清液稀释液)形成最终1ml反应物体积而开始的。然后，继续测定由ABTS的氧化产生的蓝绿色，即通过用分光光度计(得自Pharmacia的Ultraspec Plus)在二分钟期间记录420nm处的光密度(OD)。然后从曲线的线性部分计算1分钟期间每分钟光密度的增大速率(△OD／分钟)。
接受该标准检定的(酶)制剂的合适量是通过用水稀释而调节的，用水稀释以便在检定期间获得0．2～1．0范围内的△OD／分钟。
本文应用的“一个标准ABTS酶单位”(下文称为“一个酶单位”或“EU”)被定义为在这些具体条件下每分钟导致增加一个OD420的酶量。
按这种方式，测得培养物上清液的酶活性为30EU／ml。
Stachybotrys chartarum酚氧化酶生产Stachybotrys chartarum在PDA平板(Difco)上生长约5～10天。一部分平板培养物(约3／4×3／4英寸)被用于接种500ml摇瓶中的100mlPDB(马铃薯葡萄糖肉汤)。在26～28℃、150rpm下将该瓶保温3～5天直至达到良好的生长。
然后将该肉汤培养物接种入一个2．8L摇瓶的1L PDB中。在26～28℃、150rpm下将该瓶保温2～4天直至达到良好的生长。
预备一个含生产培养基的10L发酵罐，所述培养基含以克／升为单位的下列组分葡萄糖15；卵磷脂1．51；t-乌头酸1．73；KH2PO43；MgSO4·7H2O0．8；CaCl2·2H2O0．1；酒石酸铵1．2；大豆蛋白胨5；Staley7359；苄醇1；吐温20 1；氨三乙酸0．15；MnSO4·7H2O0．05；NaCl0．1；FeSO4·7H2O0．01；CoSO40．01；CaCl2·2H2O0．01；ZnSO4·7H2O0．01；CuSO40．001；ALK(SO4)2·12H2O0．001；H3BO30．001；NaMoO4·2H2O0．001。然后用1L肉汤培养物接种该发酵罐，在28℃、5．0升／分钟的恒定空气流中和120RPM的恒速搅拌下进行发酵达60小时。pH保持在6．0。
应用如下基于ABTS[2，2′-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯)]被氧氧化的检定方法测定上清液中酚氧化酶活性的存在。将ABTS(SIGMA，0．2ml，4．5mM H2O)和NaOAc(1．5ml，120mM于H2O中，pH5．0)在杯中混合。反应是通过添加适当量待测定的制剂(在该实施例中，它是上清液稀释液)形成最终1．8ml溶液而开始的。然后，应用分光光度计，通过记录420nm处的光密度(OD)测定在总的14秒期间每2秒由ABTS的氧化产生的颜色。在该实施例中，“一个ABTS单位”)“一个酶单位”或“EACU”)被定义为每分钟／2在420nm处测定的OD变化(未稀释样品)。按这种方式，测得培养物上清液的酚氧化酶活性为3．5 EACU／ml。实施例5酶的纯化然后，从发酵罐抽出残余的、按上面实施例4所述获得的Stachybotrys parvispora培养液，在4，500g下离心15分钟。Stachybotrys chartarum按类似方式纯化。
接着，将形成的上清液与粒状沉淀分离，通过应用装有YMIO膜(10kD截断值)的Amicon超滤装置进行超滤而浓缩至0．6升。
往浓缩液中添加1．4升丙酮并与之混合。再在20～25℃下将形成的混合物保温2小时。
保温后，在10，000g下将混合物离心30分钟，分离形成的粒状沉淀和上清液。再将粒状沉淀重悬浮于最终体积为800ml的水中。
然后，将形成的悬浮液按如下方法进行硫酸铵分级分离处理将结晶硫酸铵(JANSSEN)加到悬浮液中至40％饱和，在4℃和缓慢磁力搅拌下将混合物保温16小时。再在10，000g下将混合物离心30分钟，将上清液与粒状沉淀分离供进一步使用。然后将硫酸铵(JANSSEN)加到上清液中至80％饱和，在4℃和缓慢磁力搅拌下将混合物保温16小时。再在10，000g下将悬浮液离心30分钟，将形成的粒状沉淀与上清液分离。再将粒状沉淀重悬浮于15ml的水中，通过应用CENTRIPREP 3000(AMICON)的超滤处理而浓缩至6ml。
然后，应用如上实施例4中所述那样(不同的是待检定的制剂是重悬浮的浓缩液而不是上清液稀释液)基于ABTS被氧氧化的标准检定方法测定上清液中酚氧化酶的活性。这样测定的酚氧化酶活性是5200EU／ml。
再通过凝胶渗透色谱法进一步纯化该酶。在这方面，用含50mMKH2PO4／K2HPO4(pH=7．0)的缓冲液平衡含850ml SEPHACRYL S400HIGH RESOLUTION(PHARMACIA)的柱，再充填上述余下的6ml悬浮液，用含50mM KH2PO4／K2HPO4(pH=7．0)的缓冲液以1ml／分钟的流速洗脱。于是获得有关的各级分。
汇集含最高酚氧化酶活性的相关级分，提供60ml含纯化的酚氧化酶的悬浮液。
然后，应用如上实施例4中所述那样基于ABTS被氧氧化的标准检定方法测定悬浮液中酚氧化酶的活性。这样测定的酶活性是390EU／ml。
再将该制剂用于进一步表征所述酶，下文将详细描述。实施例6S．parvispora酚氧化酶的等电点的测定然后，从上述实施例5中所述获得的纯化后的酶测定由S．parvi-spora MUCL 38996生产的酶的等电点(pl)。
是通过在聚丙烯酰胺凝胶中等电聚焦进行测定的，即应用Pharmacia DryIEF凝胶，该凝胶已被2ml ampholine溶液再水化了(1体积Pharmacia 8～10．5％(w／v)ampholine被加到15体积去离子水中)，按供应商推荐的方案。
如上实施例5中所述获得的纯化后的酶经历如the PHARMACIATechnical File IEF No 100所述那样的等电聚焦凝胶(得自PHARMACIA的IEF3-9)处理。
在该等电聚焦中应用下列PHARMACIA参比标记胃蛋白酶原(2．8)，淀粉葡糖苷酶(3．5)，甲基红(3．75)，葡糖氧化酶(4．15)，大豆胰蛋白酶抑制剂(4．55)，b-乳球蛋白A(5．2)，牛碳酸酐酶B(5．85)和人碳酸酐酶B(6．55)。
按the PHARMACIA Technical File IEF No 100所述那样制备待经历等电聚焦的样品。
等电聚焦后，用考马斯蓝按the Separation Technique File No．101(公开18-1018-20，Pharmacia LKB Biotechnology)详述的方案将凝胶染色。
应用该技术，测得从S．parvispora MUCL 38996分泌的酚氧化酶的表观等电点低于2．8。实施例7S．parvispora和S．chartarum酚氧化酶的最造pH的测定配制了十三个各自含50mM Tris、50 mM柠檬酸和50mMNa2HPO4的100ml缓冲液样品。
然后，适当用HCl或NaOH调节这十三个缓冲液样品至下文表1A中所示的各自的phs，使得缓冲液样品具有下文表1A中所示的相应各pH值。
接着，从这十三个缓冲液样品各取三个0．9ml的样品。按这种方式，提供了这十三个样品每一个的三组(第一组、第二组和第三组)，使得每组都具有一个与十三个pH缓冲液样品中的一个相应的样品。
然后，按下列方法将相关的底物加到相应的混合物中0．9mMABTS被加到第一组十三个混合物中；50／μM DMP(2，6-二甲氧基苯酚)(FLUKA)被加到第二组十三个混合物中；以及1mMsyringaldizin(SIGMA)被加到第三组十三个混合物中。
通过添加2 EU按上述实施例5中所述获得的纯化后的S．parvispora MUCL 38996酚氧化酶而引起各个反应。
每个待检定的样品最终体积是1ml。
对三十九个样品(已调节到下文表1A中所示的pH值)中每个样品的检定是按如上面实施例4中给出的方案在大约20℃下进行的(保温时间为2分钟)。
在2分钟期间记录下列波长处的光密度(得自Phmarmacia的Ultraspec Plus)关于第一组样品(含ABTS)为420 nm，关于第二组样品(含DMP)为468 nm，关于第三组样品(含丁香醛连氮)则为526 nm。
按实施例4中的详细描述，从曲线上线性部分计算一分钟期间的光密度增大速率(DOD／分钟)。
将检定结果总结于下表1A中。
表1AS．parvispora酶的活性(△OD／分钟／ml)
按类似方式，获得S．chartarum酚氧化酶的pH分布。应用5mMDMP代替50μM DMP。在总的0．9 ml检定中每次ABTS检定应用的酶量是1．7μg。在总的0．9 ml检定中每次DMP检定应用的酶量是17．2μg。结果给出于表1B中。
表1B测定Stachybotrys Charatum酶活性(△OD／分钟／ml)的最适pH
DMP=2，6-二甲氧基苯酚在20℃和40℃下进行检定重复如上关于Stachybotrys parvispora的方案，不同的是将全部缓冲液样品调节到pH 7．0，应用的底物是5 mM的s-联二茴香胺(s-dianizidine)(SIGMA)、3，4-二甲氧基苯酚(FLUKA)、3，4-二甲氧基苯胺(FLUKA)、3-甲氧基苯酚(FLUKA)和藜芦基醇(veratrylic alcohol)(SIGMA)。
除藜芦基醇之外，从这些其它底物的每一种都定性观察了颜色形成。实施例8与胆红素氧化酶比较DBI漂白的pH分布配制了含50 mM Tris、50 mM柠檬酸和50 mM Na2HPO4的14个反应混合物(1ml最终体积)，用HCl或NaOH将所述反应混合物的两个调节到下表2中所示的相应pHs，并往其中添加底物、得自(SIGMA)的直接蓝No．1(本文称为DBI，也称为Chicago Sky Blue 6B)，添加的量是获得1．0(620nm)的初始光密度(OD)所需的量。
通过往各反应混合物中添加4．5 EU按如上实施例5中所述那样获得的S．parvispora MUCL 38996的酚氧化酶或疣孢漆斑菌的胆红素氧化酶(购自SIGMA)而引发各反应。
每个待检定的样品最终体积是1ml。
对每个样品的检定是按如上实施例4中给出的方案在大约20℃下进行的(保温时间为2分钟)。
在2分钟期间记录波长为620nm处的光密度(得自Pharmacia的Ultraspec Plus)。从曲线的线性部分计算光密度的减小速率(-△OD／min)。
将检定结果总结于下表2中。
表2
quiacol的氧化配制了含200tmM Tris／HCl(pH7．0)和作为底物的5mMquiacol(2-甲氧基苯酚)(MERCK)的反应混合物(1ml最终体积)。
通过添加5 EU按如上实施例5中所述那样获得的S．parvisporaMUCL 38996的酚氧化酶或通过添加5 EU疣孢漆斑菌的胆红素氧化酶(购自SIGMA)而引发反应。
每个待检定的样品最终体积是1ml。
对每个样品的检定是按如上实施例4中给出的方案在大约20℃下进行的(保温时间为2分钟)。
在2分钟期间记录波长为440nm处的光密度(得自PHARMACIA的Ultraspec Plus)。从曲线的线性部分计算光密度的增大速率(△OD／min)。
就Stachybotrys parvispora MUCL 38996的酚氧化酶来说，记录了OD的增大(0．05 △OD／min)。但是，关于疣孢漆斑菌的胆红素氧化酶未检测到活性。实施例9各种染料的漂白研究了S．parvispora MUCL 38996的酚氧化酶对一些染料的底物特异性。反应混合物(1ml最终体积)含200mM Tris／HCl(pH7．0)和下文表3中列出的各种染料，通过用水稀释调节染料的浓度，以致测定的光密度为1．0(在下文表3中列出的波长处)。活性和染料名称按“染料指南”。
通过添加按如上实施例5中所述那样获得的S．parvispora MUCL38996的酚氧化酶而引发漂白。通过用水稀释调节酚氧化酶的量以便测得OD(在表3中列出的波长处)的减小在0．05～0．25-△OD／分钟的范围内，从而获得线性曲线。
每个待检定的样品最终体积是1ml。
对每个样品的检定是按如上实施例4中给出的方案在大约20℃下进行的(保温时间为2分钟)。
在2分钟期间记录表3中所示波长处的光密度(得自Pharmacia的Ultraspec Plus)。从曲线的线性部分计算光密度的减小速率(-△OD／min)，再乘以酶稀释度以便以-△OD／分钟／ml为单位表达按实施例5中所述那样获得的酶溶液的最终漂白速率。
将结果总结于下表3中。
在一个单独的实验中，测定了装有一个Clark电极(得自Gilson的oxygraph K-IC)的磁力搅拌池中每种染料的氧消耗速率。所述oxygraph池含有最终体积为2 ml的200 mM Tris／HCl(pH 7．0)、5 mM的每种染料以及100 ml(39 EU)按实施例5中所述那样获得的S．parvispora MUCL 38996的酚氧化酶。通过添加酶而引发反应。在5分钟期间记录溶解的氧浓度。从它们的线性部分测定曲线的斜率。
还将该实验的结果总结于下表3中。
表3
N．D．表示未测定这些结果表明，应用氧作为电子受体，并且在没有介体的情况下，葡萄穗霉属酚氧化酶能氧化和漂白呈不同化学结构的各种染料。
有两种染料(活性黑5和直接蓝71)被葡萄穗霉属酚氧化酶氧化了，但未能观察到漂白反应。然而，抗染料转移实验(见如下实施例12)表明，确实能防止活性黑5的转移。因此，即使该染料未直接被酚氧化酶漂白，但似乎以抑制转移的方式修饰了。
表3中总结的结果还表明，花色素苷类的天然染料(例如锦葵色素苷)可被酚氧化酶有效地漂白，这阐明它除去含这类染料的污点(例如果酒等)的效能。实施例10免疫性能用水将按如上实施例5中所述那样获得的纯化后的S．parvisporaMUCL 38996酚氧化酶稀释两次，将0．5ml该溶液与0．5ml完全弗氏佐剂混合，按“抗体”(Antibodies)(1988)，Cold Spring HarborLaboratory，Harlow和Lane编辑，第105页描述的那样经皮下注入兔中。再重复该免疫操作三次(共计给予四次)，每次注射间间隔时间为2周。
第四次注射两周后，按如上的“抗体”(1988)第119页描述的那样收集抗血清。
然后，按Clausen，J．(1988)在“鉴定和估测大分子的免疫化学法”(修订第3版)Burdon，R．H．和P．H．van Knippenberg编辑，第281页(附录11，显微技术)中叙述的方案和给定的条件进行免疫双扩散试验(Quchterlony技术)。
按Clausen(上文)(附录10，§10．1显微技术)描述的技术制作了四块显微镜载片(25mm×75mm×1mm)，每片被覆盖2．5ml熔融扩散培养基，该培养基包含1．7％(w／v)琼脂(从Difco no 0145-17-0粒化的琼脂)和0．9％(w／v)NaCl。应用配有吸取器的模板(如Clausen在上文附录10，§10．1．1．1中所述那样)在每块载片的琼脂中造成五个孔。在载片中造成的五个孔(一个位于中央，另四个围绕该中央孔)各具有3mm的直径，孔与孔之间的距离(中心到中心)是8mm。
在麦芽提取平板(Malt Extracted Plates)(得自DIFCO的ME)上分离S．chartarum MUCL 38898(按上文实施例2中所述获得的)。再将它的一个菌落悬浮于5ml含大约30颗无菌玻璃珠(直径为5mm)的0．9％(w／v)NaCl中。用涡动混合机充分搅拌该悬浮液直至达到菌丝体的完全均化。将30克TSB(得自BECTON DICKINSON的胰胨豆胨培养液)粉末溶于1升水并通过在120℃下加热30分钟进行灭菌。然后，各取500ml量的无菌培养基加到两个聚丙烯摇瓶(体积为2升)中。再各用1ml所述菌丝体悬浮液样品接种摇瓶，在37℃和不断搅拌(100RPM，1英寸偏心距)下操作96小时。
发酵后，将各摇瓶中的培养基在10000g下离心15分钟。然后，移出形成的上清液，各自通过丙酮沉淀(1体积上清液／3体积丙酮)浓缩20倍。再在4℃和磁力搅拌下将混合物保温45分钟。再次将形成的悬浮液在10000g下离心15分钟，从中取出形成的粒状沉淀。接着将取出的粒状沉淀重悬浮于50ml水(Milli-Q级)中。对ABTS测得0．5UABTS的酚氧化酶活性。然后，将形成的酶溶液用于免疫试验。
应用作为稀释剂的0．9％(w／v)NaCl以及0．6 EU下列酶样品S．parvispora MUCL 38996酚氧化酶(按如上实施例5中所述那样获得的)、S．chartarum MUCL 38898酚氧化酶(按下述那样获得的)和疣孢漆斑菌的胆红素氧化酶(SIGMA)，配制了分别为2×(具有1体积酶和1体积稀释剂)、4×(具有1体积酶样品和3体积稀释剂)和8×(具有1体积酶样品和7体积稀释剂)的稀释液。
然后，将各为10ml恒定体积的待测试样品(稀释液)注入相应的四个环绕孔(如下所述)，并将针对得自S．parvispora MUCL 38996的酚氧化酶活性而产生的抗血清注入中央孔(如下所述)。在应用狭缝灯于黑背景上检察之前，在37℃下将所述载片保温18小时。这样制作的四个载片含下列样品
样品1是S．parvispora酶的未稀释样。
样品2是S．parvispora酶的2×稀释样。
样品3是S．parvispora酶的4×稀释样。
样品4是S．parvispora酶的8×稀释样。
样品5是S．chartarum酶的未稀释样。
样品6是S．chartarum酶的2×稀释样。
样品7是S．chartarum酶的4×稀释样。
样品8是S．chartarum酶的8×稀释样。
样品9是疣孢漆斑菌胆红素氧化酶的未稀释样。
样品10是疣孢漆斑菌胆红素氧化酶的2×稀释样。
样品11是疣孢漆斑菌胆红素氧化酶的4×稀释样。
样品12是疣孢漆斑菌胆红素氧化酶的8×稀释样。
样品13是S．parvispora酚氧化酶的未稀释样和疣孢漆斑菌胆红素氧化酶的未稀释样的1／1(v／v)混合物。
然后，按Clausen在上文第6章，p143-146中叙述的方案和给定的条件对从该试验得出的沉淀反应结果进行分析。
载片A(它含S．parvispora酚氧化酶的各种稀释液)的结果显示了被称为I型的这类清晰沉淀弧线(或免疫沉淀线)，它已被鉴定为典型的完全同一性(参见Clausen，上文，第144～146页，§6．1．2．1)。这正是预期的，因为抗血清是针对S．parvispora酚氧化酶引发的。
载片B(它涉及应用该实施例中详细描述的同样方案和相同条件、采用等量(EU)的Stachybotrys chartarum MUCL no 38898酚氧化酶进行相同的试验)的结果显示了被称为Ⅰ型的这类清晰沉淀弧线，它已被鉴定为典型的完全同一性(参见Clausen，上文，第144～146页，§6．1．2．1)。
载片C(它涉及应用该实施例中详细描述的同样方案和相同条件、采用等量(EU)的疣孢漆斑菌胆红素氧化酶进行相同的试验)的结果显示未观察到沉淀弧线，它已被鉴定为典型的不存在同一性(参见Clausen，上文，第144～146页，§6．1．2．1)。所以，疣孢漆斑菌胆红素氧化酶和S．parvispora酚氧化酶既不是全部地(又不是部分地)在免疫化学上相同。
载片D(它涉及应用该实施例中详细描述的同样方案和相同条件、但采用如上所示的酚氧化酶或胆红素氧化酶以及采用上述量(EU)的酚氧化酶和胆红素氧化酶进行相同的试验)的结果显示在含S．parvispora酚氧化酶和疣孢漆斑菌胆红素氧化酶的孔(孔4)中观察到沉淀弧线(此外，还在孔1和孔2但不是孔3中观察到沉淀弧线)，于是证实，在载片3中之间未观察到沉淀弧线不是由于除了酚氧化酶之外的某种物质的抑制作用的结果。因此，该载片及其结果证实了，疣孢漆斑菌胆红素氧化酶和S．parvispora酚氧化酶既不是全部地(又不是部分地)在免疫化学上相同。实施例11染料转移的防止通过在白色试验布条(white pick-up swatch)的存在下洗涤彩色布条评估所述酶体系防止染料转移的潜能。该实验是在25ml浸有二条5×5cm的布条的pH9碳酸盐缓冲液中进行的。酶的用量以ABTS(2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)为单位。一个ABTS单位被定义为当存在2mM ABTS(于20mM pH9的Tris缓冲液中)时，418nm处的光密度增大1OD／min的酶量。在0单位(u)、0．5u、1u和2u／ml的洗涤液存在下进行实验。作为所述酶活性的增强剂添加吩噻嗪-10-丙酸酯。以0μM、50μM、100μM和250μM的浓度添加该增强剂。在洗涤液中将所述织物搅拌30分钟。随后，将它们在滚筒内甩于，应用Minolta光谱仪测定反射光谱。将由此获得的数据转化成CIELABL*a*b*彩色空间参数。在该彩色空间中L*表示亮度，a*和b*是色度坐标。
在未添加酶漂白体系的对比布条和存在酶和／或吩噻嗪-10-丙酸酯时洗涤过的布条之间的色差被表示为△E，从下式计算Δ&Egr;=ΔL2+Δa2+Δb2]]>通过如上方法获得的白度(△L)和色差(△E)被给出于下表中。 实施例12番茄污点的漂白通过在Stacchybotrys chartarum酚氧化酶(它可通过实施例4和5中公开的方法获得)和增强剂存在下洗涤被番茄酱沾污的棉布条来评估本发明的酚氧化酶漂白污点的能力。该实验是在15ml pH9的硼酸盐缓冲液和pH7的磷酸盐缓冲液中进行的。酶的用量以ABTS(2，2，-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)为单位。一个ABTS单位被定义为当存在2 mM ABTS(于20 mM pH9的Tris缓冲液中)时，418nm处的光密度增大1 OD／min的酶量。实验是在2．8单位／ml洗涤液的存在下进行的。
作为酶活性的增强剂添加了吩噻嗪-10-丙酸酯。被添加的该增强剂浓度为250μM。在30℃下将试验布条洗涤30分钟。洗涤后，象实施例11中那样测定污点的残余颜色。在下表中给出洗涤前和洗涤后污点之间的色差测定结果。
从△E值可见，在所述酶制剂的存在下，改善了番茄污点的漂白。实施例13Stachybotrys chartarum酚氧化酶的氨基酸序列分析将按实施例4中公开的那样制备的Stachybotrys chartarum酚氧化酶进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和分离。用脲和碘乙酰胺处理分离的级分并通过酶endoLysC消化。通过HPLC(反相单孔C18柱，CH3CN梯度)分离从endoLysC消化生成的片段并收集在多滴度板(multititerplate)中。通过用于质量测定的MALDI分析这些级分并通过Edman降解法测序。测得如下氨基酸序列并以氨基末端至羧基末端取向表示N′DYYFPNYQSARLLXYHDHA C′N′RGQVMPYESAGLK C′图4A-4B是Stachybotrys chartarum酚氧化酶片段与疣孢漆斑菌胆红素氧化酶和LEPTOTHRIX DISCOPHORA锰氧化蛋白的氨基酸序列对比。实施例14克隆基因组核酸基于所述肽序列设计了两个简并引物。引物1包含如下序列TATTACTTTCCNAAYTAYCA，其中，N表示所有四种核苷酸(A、T、C和G)的混合物，Y只表示T和C的混合物。引物2包含如下序列TCGTATGGCATNACCTGNCC。
为了分离编码酚氧化酶的基因组DNA，将从Stachybotryschartarum(MUCL#38898)分离的DNA用作PCR的模板。用Tris-EDTA缓冲液将该DNA稀释100倍至88ng／ul的最终浓度。将十微升已稀释的DNA加到含下列组分的反应混合物中0．2mM每种核苷酸(A、G、C和T)，1×反应缓冲液，0．296微克引物1和0．311微克引物2，共计100微升反应物。在100℃下加热该混合物5分钟后，将2．5单位Taq DNA聚合酶加到反应混合物中。在95℃下进行PCR反应达1分钟，将所述引物在45℃下对模板退火达1分钟，再在68℃下进行延伸达1分钟。重复该循环30次而获得凝胶-可见PCR片段。通过琼脂糖凝胶检测的该PCR片段含大约1千碱基的片段，再将它克隆入质粒载体pCR-Ⅱ(Invitrogen)。该1kb插入片段接着经历核酸测序。序列信息揭示，它是编码Stachybotrys chartarum的基因，因为推断的肽序列与前面公开的通过Edman降解法测序的肽序列匹配。然后，分离并测序该包含5′基因和3′基因的PCR片段。图6提供了包括启动子序列和终止子序列的葡萄穗霉属氧化酶的全长基因组序列(序列3)。实施例15克隆编码葡萄穗霉属酚氧化酶的cDNA使Stachybotrys chartarum菌株(MUCL 38898)在漆酶生产培养基中生长，从菌丝体提取RNA并用作cDNA分离的模板。总的cDNA是通过逆转录酶合成的，即，应用4．3微克RNA于含如下组分的20微升反应物中合成0．34微克寡dT18引物，各为0．5mM的四种核苷酸(A、G、C和T)，20单位的RNA抑制物以及100单位逆转录酶。然后，通过PCR分两步克隆编码葡萄穗霉属酚氧化酶的cDNA。首先，应用如下两种引物克隆5′cDNA作为一个678 bp片段GTCAATATGCTGTTCAAG和CTCGCCATAGCCACTAGG。其次，应用如下两种引物克隆3′cDNA作为一个1301 bp片段CTTTCGATGGTTGGGTG和GTTCTAGACTACTCCTCGATTCCAAGATC。1791 bp的cDNA序列如图5中所示。实施例16Stachvbotrys chartarum酚氧化酶基因组DNA和cDNA的比较cDNA和基因组DNA的比较揭示了，在基因组DNA中存在五个内含子。该蛋白质翻译起始位点(ATG)处于核苷酸#1044～#1046，而翻译终止位点则处于核苷酸#3093～#3095。从cDNA和基因组DNA翻译的蛋白质序列包含594个氨基酸。Stachvbotrys chartarum酚氧化酶与其它氧化酶的比较蛋白质序列(序列2)被用作问题而检索GCG(Genetics ComputerGroup Universitv Research Park，Madison Wisconsin)DNA和蛋白质数据库。它表明，葡萄穗霉属氧化酶在蛋白质序列水平享有60％与胆红素氧化酶的同一性。图7示出了这两种蛋白质的序列对比。实施例17葡萄穗霉属酚氧化酶在A．niger var．awamori中的表达通过PCR分离了含编码葡萄穗霉属酚氧化酶的核酸的DNA片段，所述核酸的两侧具有两种新引入的限制酶位点(BgI Ⅱ和Xba Ⅰ)(图9)。先将该PCR片段克隆入质粒载体pCR-Ⅱ并进行核酸测序而核实基因序列。再将该DNA片段克隆入载体(pGAPT，见图8)的BgI Ⅱ～Xba Ⅰ位点。用于表达葡萄穗霉属酚氧化酶的载体含黑曲霉葡糖淀粉酶基因启动子(碱基1～1134)和终止子(碱基1227～1485)、多克隆位点(碱基1135～1227)、作为真菌转化的选择标记的构巢曲霉pyrG基因(碱基1486～3078)和适于在大肠埃希氏菌(E．coli)中增殖的puc18质粒主链。然后，通过标准PEG法将被称为pGAPT-gDO104的表达质粒转化入曲霉属(菌株dgr246p2，应用微生物生物工程(Appl．Micro．Biotechol．)1993，39738～743)。在不含尿苷的平板上选择转化体。在CSA平板上生长四十个转化体，再转入盛有CSL特种培养基和麦芽糖的摇瓶。CSA平板含NaH2PHO4*H2O1g／l；MgSO41g／l；麦芽糖50g／l；葡萄糖2g／l；Promosoy10g／l；Mazu1ml／l以及Bacto Agar15g／l。CSL培养基被描述于Dunn-Coleman等，1991，生物／工程(Bio／Technology)9976～981。CSL特种培养基是省去了葡萄糖和果糖的CSL培养基。在第3、6和10天进行ABTS检定。也是先在CSL中生长转化体，再在生长1天后转移到Clofine-特种培养基中。生长6天后，检定这些样品的ABTS活性(＞0．2单位)。将五个最好的转化体进行孢子纯化，在Clofine培养基中生长8天后再次测试ABTS活性(＞5单位／ml)。图10示出SDS-蛋白质聚丙烯酰胺凝胶，它指示重组葡萄穗霉属氧化酶在(在CSL特种培养基中6天培养生长的)A．niger var．awamori生长物中的表达水平。实施例18酚氧化酶在Trichoderma reesei中的表达按如下方法构建了用于转化Trichoderma reesei的表达质粒。包含编码葡萄穗霉属酚氧化酶的基因的、图9所示BgIII～Xbal片段的末端被T4 DNA聚合酶变成平端后被插入木霉属表达载体(pTrex)的Pmel限制位点，pTrex是pTEX的修饰译本，参见PCT公开No．WO96／23928关于pTEX载体制备的完整描述(将该讨论并入本文作参考)，它包含适于基因表达的CBHI启动子和终止子以及作为转化体的选择标记的木霉属pyr4基因。从凝胶分离只含CBH1启动子、葡萄穗霉属酚氧化基因、CBH1终止子和选择标记pyr4的线型DNA片段并用于转化缺失了四个主要的纤维素酶基因的Trichoderma reesei的尿苷营养缺陷体菌株(见美国专利No．5，472，864)。在不含尿苷的木霉属小型平板上分离稳定转化体。使该转化体在28℃～30℃的摇瓶内50ml Proflo培养基上生长7天，通过ABTS(＞0．2单位／ml)和SDS-PAGE蛋白质凝胶检定酚氧化酶的表达。Proflo培养基包含(g／l)Proflo 22．5；乳糖30．0；(NH4)2SO46．5；KH2PO42．0；MgSO4·7H2O 0．3；CaCl20．2；CaCO30．72；痕量金属储备溶液1．0ml／l以及10％吐温80 2．0ml／l。应用的痕量金属储备溶液包含(g／l)FeSO4·7H2O 5．0；MnSO4·H2O 1．6；ZnSO4·7H2O 1．4；CoCl2·6H2O)2．8。实施例19葡萄穗霉属酚氧化酶在酿酒酵母中的表达酚氧化酶的cDNA(序列1)的BgIII～Xbal片段被克隆入酵母表达载体yES2．0(Invitrogen)，它包含控制该酚氧化基因的表达的酵母Gal 1启动子和Cyc 1终止子，以及作为选择标记的酵母URA3基因。表达质粒被转化入酵母菌株(Invitrogen Sc2菌株)。在不含尿苷的酵母小型平板上选择转化体。四个随机选择的转化体显示了平板检定中的活性(在含1 mM ABTS的酵母小型平板中形成彩色晕圈)，而对比质粒载体却未显示任何彩色晕圈的形成。
权利要求
1．一种可得自葡萄穗霉属的纯化酚氧化酶。
2．能修饰与染料或有色化合物相关的颜色的、权利要求1的酚氧化酶。
3．权利要求1的酚氧化酶，其中，所述酶在煮沸后呈现表观分子量的增大，这是按SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的。
4．权利要求1的酚氧化酶，其中，葡萄穗霉属包括S．parvispora、S．chartarum、S．kampalensis、S．theobromae、S．bisbyi、柱孢葡萄穗霉、S．dichroa、S．oenanthes和S．nilagerica。
5．权利要求1的酚氧化酶，其中，葡萄穗霉属是Stachybotryschartarum或Stachybotrys parvispora。
6．权利要求5的酚氧化酶，其中，Stachybotrys parvispora具有MUCL登记号38996。
7．权利要求5的酚氧化酶，其中，Stachybotrys chartarum具有MUCL登记号38898。
8．权利要求1的酚氧化酶，它具有至少一个与可得自Stachybotrys parvispora MUCL登记号38996相同的抗原决定簇，这是通过Quchterlony技术的免疫沉淀线测定的。
9．权利要求1的酚氧化酶，它具有至少一个与可得自Stachybotrys chartarum MUCL登记号38898相同的抗原决定簇，这是通过Quchterlony技术的免疫沉淀线测定的。
10．权利要求1的酚氧化酶，它具有38kD的表观非变性分子量，这是通过SDS-PAGE测定的。
11．权利要求1的酚氧化酶，它具有30．9kD的表观非变性分子量，这是通过SDS-PAGE测定的。
12．权利要求1的酚氧化酶，其进一步的特征在于，它具有从5．0到7．0的最适pH，这是通过在20℃下与作为底物的ABTS保温2分钟而测定的，所述pH范围含端点。
13．权利要求1的酚氧化酶，其进一步的特征在于，它具有从6．0到7．5的最适pH，这是通过在20℃下与作为底物的syringaldizin保温2分钟而测定的，所述pH范围含端点。
14．权利要求1的酚氧化酶，其进一步的特征在于，它具有从7．0到9．0的最适pH，这是通过在20℃下与作为底物的2，6-二甲氧基苯酚保温2分钟而测定的，所述pH范围含端点。
15．一种可从葡萄穗霉属获得的并且具有至少65％与具有序列2中所公开氨基酸序列的酚氧化酶的同一性的酚氧化酶。
16．权利要求15的酚氧化酶，它具有序列2中公开的氨基酸序列。
17．权利要求15的酚氧化酶，其中，所述葡萄穗霉属包括S．parvi-spora、S．chartarum、S．kampalensis、S．theobromae、S．bisbyi、柱孢葡萄穗霉、S．dichroa、S．oenanthes和S．nilagerica。
18．一种编码权利要求15的酚氧化酶的分离多核苷酸。
19．一种编码具有序列2中所示序列的氨基酸的分离多核苷酸。
20．权利要求18的分离多核苷酸，它具有至少65％与具有序列1或序列3中所公开序列的核酸的同一性，或者它能与具有序列1或序列3中所公开序列的核酸在中度到高度严格性的条件下杂交，或者它与具有序列1或序列3中所示序列的核酸互补。
21．具有序列1或序列3中所公开的核酸序列的权利要求20的分离多核苷酸。
22．一种表达载体，它包含权利要求18、19、20或21的多核苷酸。
23．一种宿主细胞，它包含权利要求22的表达载体。
24．权利要求23的宿主细胞，它是一种丝状真菌。
25．权利要求24的宿主细胞，其中，所述丝状真菌包括曲霉属的种、木霉属的种和毛霉属的种。
26．权利要求23的宿主细胞，它是一种酵母。
27．权利要求26的宿主细胞，其中，所述酵母包括酵母属、毕赤酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属和Yarrowia的种。
28．权利要求23的宿主细胞，其中，所述宿主是一种细菌。
29．权利要求28的宿主细胞，其中，所述细菌包括芽孢杆菌属和埃希氏菌属的种。
30．一种在重组宿主细胞中生产可得自葡萄穗霉属的酚氧化酶的方法，它包括如下步骤(a)获得一种重组宿主细胞，该细胞包含一种编码所述可得自葡萄穗霉属的酚氧化酶的多核苷酸，其中，所述酶具有至少65％与序列2中所公开氨基酸序列的同一性；(b)在适合生产所述酚氧化酶的条件下培养所述宿主细胞；以及(c)任选地回收生产的所述酚氧化酶。
31．一种生产酚氧化酶的方法，所述方法包括如下步骤在合适的条件下培养一种重组宿主细胞，所述宿主细胞的特征在于表达一种编码可得自葡萄穗霉属的酚氧化酶的多核苷酸，其中，所述酶具有至少65％与具有序列2中所示序列的氨基酸的同一性，以及任选地回收所述酚氧化酶。
32．权利要求30或31的方法，其中，所述酚氧化酶可得自包括下列种的葡萄穗霉属S．parvispora、S．chartarum、S．kampalensis、S．theobromae、S．bisbyi、柱孢葡萄穗霉、S．dichroa、S．oenanthes和S．nilagerica。
33．权利要求30或31的方法，其中，所述酚氧化酶可得自S．char-tarum并具有序列2中所公开的氨基酸序列。
34．权利要求30或31的方法，其中，所述多核苷酸包括具有序列1或序列3中所示序列的核酸，或者能与具有序列1或序列2中所示序列的核酸在中度到高度严格性的条件下杂交，或者与具有序列1或序列3中所示序列的核酸互补。
35．权利要求30或31的方法，其中，所述宿主细胞包括丝状真菌、酵母和细菌。
36．权利要求35的方法，其中，所述酵母包括酵母属、毕赤酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属和Yarrowia的种。
37．权利要求35的方法，其中，所述丝状真菌包括曲霉属的种、木霉属的种和毛霉属的种。
38．权利要求36的方法，其中，所述酵母属是酿酒酵母。
39．权利要求37的方法，其中，所述丝状真菌是Aspergillus．nigervar．awamori。
40．权利要求39的方法，其中，所述木霉属的种是Trichodermareseei。
41．一种生产宿主细胞的方法，该宿主细胞包含编码可得自葡萄穗霉属的酚氧化酶的多核苷酸，所述酶具有至少65％与具有序列2中所公开序列的氨基酸的同一性，所述方法包括如下步骤(a)将编码所述酚氧化酶的多核苷酸引入宿主细胞；以及(b)任选地在适合生产所述酚氧化酶的条件下培养所述宿主细胞。
42．权利要求41的方法，其中，所述宿主细胞包括丝状真菌、酵母和细菌。
43．权利要求42的方法，其中，所述丝状真菌包括曲霉属的种、木霉属的种和毛霉属的种。
44．权利要求43的方法，其中，所述曲霉属的种是Aspergillusniger var．awamori。
45．权利要求43的方法，其中，所述木霉属的种是Trichodermareseei。
46．权利要求42的方法，其中，所述酵母是酵母属的种。
47．权利要求46的方法，其中，所述酵母属的种是酿酒酵母。
48．权利要求41的方法，其中，所述多核苷酸具有至少65％与具有序列1或序列3中所示序列的核酸的同一性，或者能与具有序列1或序列3中所示序列的核酸在中度到高度严格性的条件下杂交，或者与具有序列1或序列3中所示序列的核酸互补。
49．权利要求41的方法，其中，所述多核苷酸具有序列1或序列3中所示的核酸序列。
50．一种重组宿主细胞，它包含一种多核苷酸，该多核苷酸具有至少65％与具有序列1或序列3中所示序列的核酸的同一性，或者它能与具有序列1或序列3中所示序列的核酸在中度到高度严格性的条件下杂交，或者它与具有序列1或序列3中所示序列的核酸互补。
51．权利要求50的宿主细胞，其中，所述多核苷酸存在于一种复制型质粒上。
52．权利要求50的宿主细胞，其中，所述多核苷酸被整合入该宿主细胞基因组。
53．权利要求50的重组宿主细胞，它包括丝状真菌、酵母和细菌。
54．菌株Stachybotrys parvispora MUCL 38996的大致纯的培养物。
55．菌株Stachybotrys chartarum MUCL 38898的大致纯的培养物。
56．一种酶组合物，它包含权利要求1的酚氧化酶。
57．权利要求56的酶组合物，其中，所述酚氧化酶具有至少65％与具有序列2中所公开氨基酸序列的酚氧化酶的同一性。
58．权利要求56的酶组合物，其中，所述酚氧化酶具有序列2中公开的氨基酸序列。
全文摘要
本文公开了可得自葡萄穗霉属的种的酚氧化酶,它们适用于修饰与染料和有色化合物相关的颜色,以及适用于抗染料转移的应用中。本文还公开了生物纯的葡萄穗霉属菌株(在本文被称为Stachybotrys parvispora MUCL 38996和Stachybotrys chartarum MUCL 38898,它们能自然地生产所述新型酚氧化酶)培养物。本文公开了葡萄稳霉属酚氧化酶的氨基酸和核酸序列以及包含该核酸的表达载体和宿主细胞。本文公开了生产所述酚氧化酶的方法以及构建表达宿主的方法。本文公开了包含可得自葡萄穗霉属的种的酚氧化酶的酶组合物。
文档编号C12N1/19GK1294629SQ99804323
公开日2001年5月9日 申请日期1999年3月23日 优先权日1998年3月24日
发明者A·阿莫瑞, 王华明, P·德哈斯, A·兰布莱奇茨－隆瓦克斯, 王智 申请人:金克克国际有限公司