专利名称：：抗菌素敏感性测定的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种测定细菌生长特征，特别是测定其对特定抗菌素或生物抑制剂(biostaticagents)敏感性的方法，以及用于此方法的试剂盒。具有抗菌素抗性的细菌正成为日趋严重的问题。目前用于测定某一菌株抗菌素抗性的方法非常费时间。首先需要分离这种细菌成纯培养物。然后制备这种细菌的“菌苔”，并使之在存在一组抗菌素的情况下生长。环绕特定抗菌素的生长抑制区表明该细菌是敏感性的(以此区域的大小表明敏感性程度)。在存在某种抗菌素的情况下无抑制的生长表明具有抗性。完成此测定过程至少需要二天，这是很不理想的，特别是在临床的情况下，在此对感染个体的最佳治疗方案可能要由这些测定结果来确定。需要有一种测定方法，它能够比较迅速地，例如在几小时之内，评估抗菌素抗性或敏感性。已知用于通过测定腺苷酸激酶来检测微生物的检定法是来自例如国际专利申请号PCT／GB94／00118和PCT／GB94／01513。腺苷酸激酶是所有的活细胞中必不可少的酶，它在存在ADP的情况下催化ATP生成反应，如下所示。在此检定法中，将ADP作为一种试剂加入待测样品中，特别是在存在镁离子的情况下。然后可以检测作为上述腺苷酸激酶反应的结果而产生的ATP，例如可应用荧火虫生物发光法检测。为此，将试剂例如虫荧光素／虫荧光素酶组合物加入此混合物中，通常经过短时间的温育，例如大约5分钟之后检测所产生的发光信号。这种检定法的灵敏度仅仅受腺苷酸激酶的背景水平和所用试剂的纯度所限制。例如，应用大肠杆菌作为模型系统，如在后面图1中所显示的，在5分钟的检定温育之后，测定出来自于少于100个细胞的腺苷酸激酶活性。在用于制作此图的试验中，样品量是200μl。本申请人已发现，腺苷酸激酶可被用作生物量的灵敏标志，并且可将上述检定技术用于多种研究中，将给予有关细菌细胞生长特征的更详细的信息。因此，本发明提供了腺苷酸激酶检定法在体外试验中的用途，所述试验用于测定外部条件对细菌细胞生长特征的影响。腺苷酸激酶检定法，为研究细菌生长和抑制的许多方面提供一种快速而灵敏的方法。可应用本发明研究的外部条件的种类有多种多样。例如，可将腺苷酸激酶检测法应用于为确定特定菌株或混合培养物对特定抗菌素或生物抑制剂敏感性的方法中，或者使这些方法可适合用于筛选药剂的抗菌素或生物抑制剂特性。还已发现，细胞培养物细胞外腺苷酸激酶含量与细胞内和细胞外总含量之比，是细胞培养物生长和健康状况的指示，因此腺苷酸激酶检定法可用于测定这些特征。该试验配置将考虑到如下几点所着手研究的性质；可获得的细菌样品的类型；样品的性质；待测试的任何试剂(如果有的话)，以及特别是它们对细胞是否具有裂解作用。下面将较详细地描述这些试验的各种形式。但是，本发明特别是提供了一种方法，用于确定细菌对待测物的敏感性，该方法包括检测由来自含有所述药剂的培养物细菌裂解所释放的腺苷酸激酶，以及将这些结果与从类似的腺苷酸激酶检定物所获得的结果进行比较，此类似的腺苷酸激酶检定物或者是加入药剂之前的培养物，以及／或者是在不同的时间点来自相同培养物的裂解细菌，和／或是来自不含有此药剂的类似培养物的裂解细菌。所测定的药剂可能是已知的抗菌素或生物抑制剂，或者它们可能是以前不知道作为抗菌素的新型化合物或药剂，以致使此检测试验构成筛选程序的一部分。某些药剂如抗菌素，例如β-内酰胺类抗菌素如青霉素象氨苄青霉素和羟氨苄青霉素，会导致培养物中的细菌裂解。但是，在裂解不发生时，在进行这种检测之前使细菌裂解可能是必不可少的。可通过本领域熟知的多种技术实现这种裂解，包括用裂解剂处理以及用物理方法，例如使细菌经受磁场或电场处理，或者超声波处理。导致细菌裂解的药剂包括去污剂和酶例如溶菌素。但是，这些作用是非特异性的，会从存在于样品中的所有生命物质释放出AK。当样品包含纯培养物时，这可能是合适的。但是，当待研究的细菌是混合培养物中的一个成分时，可采用其它的策略。例如可通过如下方法实现对混合样品中靶细胞的特异性测定1)特异性捕获待研究的细胞，以便从受污染的有机体中将它们分离出，随后进行非特异性腺苷酸激酶测定；2)应用一种只裂解靶细胞的方法，这样只测定来自这些细胞的腺苷酸激酶；或者3)应用它们的组合形式。通过应用对所研究的特定细菌特异性的裂解剂，可使腺苷酸激酶仅从靶细菌细胞释放出(上述2)，例如，应用对靶细菌特异性的，并可引起这种细菌裂解的噬菌体。这类噬菌体是可感染细菌的病毒，将导致细胞裂解，释放包括腺苷酸激酶的细胞内成分进入外部培养基中。这种释放过程一般在感染后大约30-60分钟内发生。已发现应用这种方法，一次测定花费40分钟，可检测到少于500个细胞。在纯培养物或混合培养物中，噬菌体可同样出色地感染靶细胞。通过将可从样品中化学提取的腺苷酸激酶含量与用噬菌体感染后规定时间内的释放量相比较，可确定是否存在靶细胞，并可测定待测物对靶细胞生长的作用。为了噬菌体能再生并因此导致裂解，宿主细胞必须处于对数生长期。例如，如果生长受到抑制，则由于存在抑菌剂或抗菌素。噬菌体将不能生长，并不能裂解细胞。如下面所述，可以以此作为基础，用于本发明的另一个实施方案。另一方面，可使混合培养物经受一个预处理步骤，其中，或者使靶细菌细胞富集在培养物中，以及／或者从中将它们分离出。这类步骤是本领域熟知的。例如，应用免疫捕获技术可实现分离作用，在此，对特定细菌具有特异性的抗体或其结合片段，被用于将这些细胞固定化在一种固体的表面，例如微珠，微量滴定板，滤膜或层析柱。磁性微珠可提供特别优选的固体表面。如后面所述，当应用磁分离技术适当地分离这些微珠时，可导致基本上全部分离出靶细菌。已观察到，一般来说应用磁性微珠作固相载体，可达到对少于1000个细胞进行检测，总共检测时间为大约30分钟。也可以用其它材料作固相载体。通过使用选择性生长培养基可获得进一步的特异性。可将它用于富集步骤，以便建立健康生长的培养物，在免疫捕获测定之前，或者在用噬菌体感染之前进行。此外，在噬菌体感染的整个过程中都可使用选择性培养基。这种培养基将使非靶细菌的过分生长降低至最小，这种非靶细菌可能存在，有时大大超过靶细菌。如上面所述，可使本发明适合用于测定细菌对特定抗菌素或抑菌剂的敏感性。抗菌素如青霉素等β-内酰胺类，是通过破坏细胞壁的合成而起作用，从而导致细胞丧失完整性，并在复制过程中裂解。倘若细菌正处于积极地生长过程中，这种作用将比较迅速地发生，大约在暴露于抗菌素之后10-15分钟之内。其它一些抗菌素如氯霉素，不引起细胞裂解，但是以其它方式抑制细胞生长，生物抑制剂也是这样。对使用中的任何一种特定药剂的作用模式一般都已了解。可使本发明适合用于测定细菌对这些药剂中任何一种的敏感性。本发明的具体实施方案包括一种方法，用于确定细菌对裂解性抗菌素的敏感性，该方法包括如下步骤(ⅰ)从其它种微生物中分离出所述细菌，例如应用免疫捕获步骤；(ⅱ)测定该细菌培养物中细胞外腺苷酸激酶含量；(ⅲ)对此培养物加入裂解性抗菌素，并温育一段足以使抗菌素能挥其裂解作用的时间，以及(ⅳ)测定此培养物细胞外腺苷酸激酶的含量，以便确定是否已发生裂解作用。在此测试中，敏感的细菌在加入此抗菌素后将很快被它裂解，一般在大约15分钟之内。因此，加入抗菌素后培养物中游离腺苷酸激酶的含量将显著地增加，因为细菌细胞裂开了，释放出细胞内腺苷酸激酶。腺苷酸激酶水平的最佳测定是在临加入抗菌素之前进行，然后在加入抗菌剂之后至少15分钟再测定一次。抗性菌培养物中游离腺苷酸激酶的含量基本上保持恒定。因此，只有在正常状况下才能测定出低水平的细胞外腺苷酸激酶含量，并且如前面所解释的，对于健康生长的细胞此水平保持大致稳定。应用这种方法，在大约40分钟的时间内，可达到评价抗菌素敏感性的目的。如上面所述，此方法中所使用的细菌培养物可包括一种有助于该细菌的选择性生长培养基，因为这将使由于污染而引起的任何假阳性结果减少到最小。另一方面，本发明的另一个实施方案提供了一种方法，用于测定细菌对非裂解性抗菌素或生物抑制剂的敏感性，该方法包括(ⅰ)从其它种微生物中分离出所述细菌，例如应用免疫捕获技术，(ⅱ)在有所述非裂解性抗菌素或生物抑制剂，以及任选地一种有助于该细菌的选择性生长培养基存在的情况下，孵育该细菌培养物，(ⅲ)通过在间隔的时间内取出样品，裂解这些样品中的细菌，并测定这些样品中的腺苷酸激酶，确定在孵育期间培养物中总腺苷酸激酶含量是增加还是减少。在这种情况下，如果细菌对此抗菌素是敏感的，那么在化学裂解一段时间，例如大约1小时之后，可得到的腺苷酸激酶含量将大致地保持恒定。这是因为在有抗菌素存在下细菌不能生长。但是，在抗性细菌的情况下，它们将继续生长，并且使腺苷酸激酶的水平随着时间持续地增加。因此，应用上述方法的步骤Ⅰ，可快速地确定纯培养物对任何一种特定抗菌素，不论是裂解性的或是非裂解性的抗菌素的敏感性。本发明的其它实施方案不需要使用分离的细菌或纯培养细菌。特别是本发明进一步提供了一种方法，用于测定细菌对抗菌素或生物抑制剂的敏感性，此方法包括(a)孵育该细菌培养物的第一样品，在该抗菌素存在下孵育第二样品，在有将特异性地裂解此靶细菌的噬菌体存在下孵育第三样品，以及在有该噬菌体和该抗菌素存在下孵育第四样品；(b)在培养之后，测定第一至第四每个样品中的腺苷酸激酶含量，以及(c)根据腺苷酸激酶的测定结果以及此抗菌素或生物抑制剂的作用模式，确定此细菌的敏感性或抗性。因为，为了对抗菌素的作用敏感，细菌必须处于主动生长状态，所以，可将选择性培养基用于起始富集步骤。这可包括大约1小时的孵育。此后如果需要，可借助于免疫捕获法将靶细胞浓缩，进入新鲜的选择性培养基中。应用腺苷酸激酶测定，与噬菌体介导的裂解相结合，可确定加入的抗菌素对靶细胞的作用。为了使噬菌体繁殖，宿主细胞必须处于对数生长期。如果生长受到抑制，例如由于存在抗菌素，那么噬菌体将不能复制，并因此不能导致宿主细胞裂解。应用腺苷酸激酶检测法与噬菌体相结合，可在3小时内确定细菌的抗菌素敏感性。为了在暴露于抗菌素或者受噬菌体感染之前确立健康的生长细胞需要更多的时间。取决于有关抗菌素的作用模式，有可能获得二种类型的测试结果。所得到的结果被概括在图4中，在此“-”表示仅与细胞外腺苷酸激酶检测一致的结果，“+”表示与无生长的原有样品中细胞内和细胞外腺苷酸激酶检测一致的中度阳性结果，以及“++”表示对高水平腺苷酸激酶的检测，与生长中的培养物的裂解相一致。如从图4可明了，如果已了解药剂的作用模式(裂解性或非裂解性的)，应用此测试系列所得结果的式样，使之可以简便地区分敏感性细菌和抗性细菌。如在下面给出的实施例中将要更详细阐述的，由于各种药剂与细菌相互作用的结果，产生了不同的作用。已发现，细胞培养物细胞外腺苷酸激酶含量与细胞内和细胞外总含量之比，是细胞培养物生长和健康状况的指示。因此，还有本发明的另一实施方案提供了一种方法，用于确定细菌培养物的生长周期，该方法包括(a)使该细菌培养物的第一样品经受裂解剂处理，导致裂解其中的细菌细胞，(b)检测此第一样品中的，以及还有该培养物未暴露于裂解剂的第二样品中的腺苷酸激酶；以及(c)比较从第一和第二培养物得到的结果，并评估培养物的生长阶段。健康的对数生长期培养物具有比较低的细胞外腺苷酸激酶水平(大约总腺苷酸激酶的1％)，并且在整个对数生长期细胞外腺苷酸激酶的比例保持相对恒定，当培养物接近静止期时，此比例增加。静止期培养物在其培养基内可能具有多达1／3总含量的腺苷酸激酶。因此，应用腺苷酸激酶可快速确定细胞的健康状况，以及它们的数量。可将此方法用于例如证实某一特定细胞培养物是否生长良好，例如当要求细菌最佳生长时，如在发酵中或其它要求细菌增殖的过程中。另一方面，在筛选抗菌素或抑菌化合物时，还有必要证实细胞正处于强壮地生长状态，这样，可避免由于在此测试中使用了衰弱的培养物或静止期培养物而导致的假阳性结果。而且，还可将它用于确定环境因素如温度或培养基，对任何一种特定培养物的生长有什么作用。每种情况下，都可通过取出培养物样品，并且按照例如在国际专利申请号PCT／GB94／00118和PCT／GB94／01513中所述的进行腺苷酸激酶检测，从而评定腺苷酸激酶含量。本发明还提供了用于实施本发明方法的检测试剂盒。此检测试剂盒将包含可使此特定的检测法能被实施的一些适合的组成成分。例如，用于抗菌素敏感性试验的试剂盒，包含一系列例如处于冷冻干燥状态或其它贮存状态的抗菌素。它还可能包含用于从样品中提取腺苷酸激酶的试剂如去污剂或其它化学裂解剂，以及检测腺苷酸激酶所必需的试剂如虫荧光素／虫荧光素酶等。此外，为了用于当待测定的是混合细菌培养物的状况，此试剂盒还可能包含适合的噬菌体，也是处于贮存状态如冷冻干燥的噬菌体。另外，此试剂盒还可能包含适合的选择性生长培养基。可在适合的反应容器如多孔池培养板内提供这些试剂。下面将借助于实施例，参照所附的示意图对本发明作详细地描述，其中图1是一个曲线图，显示测定大肠杆菌细胞腺苷酸激酶活性的实验结果；图2显示对于纯培养物中的和在有3．5×105枯草芽胞杆菌黑色变种营养细胞存在下的鼠伤寒沙门氏菌，磁性微珠免疫捕获检测法的结果；在此■表示来自被微珠捕获细胞的腺苷酸激酶活性，□表示来自样品中残留细胞的腺苷酸激酶活性(即左边图线来自未捕获的沙门氏菌细胞，右边的图线来自这些细胞加非特异性细胞)；图3是一个曲线图，显示研究来自大肠杆菌细胞培养物，噬菌体介导的腺苷酸激酶释放的时间进程的实验结果；图4是用本发明的一个实施方案可得到的抗菌素测试结果的概括示意图；图5是显示一块测试板的示意图，用于测试细菌样品的抗菌素抗性；图6显示噬菌体10359和50mg／l氨苄青霉素对氨苄青霉素敏感的和抗性的大肠杆菌10243培养物的作用，其中○表示以氨苄青霉素和噬菌体10359对敏感性大肠杆菌10243的作用结果，表示不用裂解剂的结果，以及□表示以氨苄青霉素和噬菌体对抗性大肠杆菌10243的作用结果；图7显示氯霉素(34mg／l)和噬菌体10359对大肠杆菌10243培养物的作用，其中○表示仅用噬菌体，表示用噬菌体10359和氯霉素，□表示仅用氯霉素，以及◇表示不用噬菌体或氯霉素。例如在一个实施方案中，将细菌细胞样分为第一样品和第二样品。在有镁离子存在下将细菌细胞第一样品与含有ADP和去污剂的溶液混合。这样可以从存在于样品中的所有细胞中提取出腺苷酸激酶，因此导致发生ATP生成反应。使此反应进行所需的时间，如5分钟，然后加入生物发光试剂，并用发光仪测定所产生的光。按此方式进行的检测可测定样品中腺苷酸激酶的总量，包括其细胞外和细胞内腺苷酸激酶。使第二样品经受类似的检测，但是，不存在去污剂，使之只能测定细胞外腺苷酸激酶。结果被显示在图2中。图线显示，大约70％的靶细胞可被选择性地从悬液中取出，并显示，此过程基本上不受污染材料(BG细胞)存在的影响。从这些结果表明，应用此方法可检测少于500个细胞。这些结果表明，不论对细胞的抗菌素抗性状态和对照，都确证这种测试法已正确地发挥了功能。表1敏感性细菌<tablesid="table1"num="001"><table>(1)无抗菌素，无噬菌体只有低水平的细胞外腺苷酸激酶(无裂解作用)(2)抗菌素，无噬菌体由于抗菌素通过裂解释放的腺苷酸激酶。(3)无抗菌素，加噬菌体通过由噬菌体引起的裂解而释放的腺苷酸激酶。(4)抗菌素加噬菌体通过由于抗菌素和噬菌体的裂解作用释放的腺苷酸激酶。水平比(3)低，因为细胞生长减弱和噬菌体复制受抑制。</table></tables>抗性细菌<tablesid="table2"num="002"><table>(1)无抗菌素，无噬菌体只有低水平细胞外腺苷酸激酶(无裂解作用)(2)抗菌素，无噬菌体只有低水平细胞外腺苷酸激酶(无裂解作用)。同(1)。(3)无抗菌素，加噬菌体通过由噬菌体引起的裂解作用释放的腺苷酸激酶。(4)抗菌素加噬菌体通过由于噬菌体的裂解作用释放的腺苷酸激酶。同(3)</table></tables>实施例5抗菌素敏感性测定-非裂解性抗菌素或生物抑制剂。应用类似的方法，也可以快速地确定细菌对于不引起细胞裂解的，但是可用其它方式抑制细胞生长的抗菌素(以及可抑制细菌细胞生长的其它化学药品如生物抑制剂)的敏感性。可按照测定对引起裂解的抗菌素敏感性的同样方法，进行混合培养物中细菌对非裂解性抗菌素的敏感性测定。但是因为，为了使噬菌体能够感染，细菌必须处于积极地生长状态。所以，对抗菌素的敏感性将表现为在受处理的样品中缺乏噬菌体介导的裂解作用。观察到的结果总结于表2中。表2敏感性细菌<tablesid="table3"num="003"><table>(1)无抗菌素，无噬菌体只有低水平的细胞外腺苷酸激酶(无裂解作用)(2)抗菌素，无噬菌体只有低水平的细胞外腺苷酸激酶(无裂解作用)。通过对生长的抑制作用，甚至可能比(1)更低。(3)无抗菌素，加噬菌体通过噬菌体引起的裂解作用而释放的腺苷酸激酶。(4)抗菌素加噬菌体只有低水平的细胞外腺苷酸激酶，(无裂解作用)。通过对生长的抑制作用，甚至可能比(1)更低。</table></tables>抗性细菌<tablesid="table4"num="004"><table>(1)无抗菌素，无噬菌体只有低水平的细胞外腺苷酸激酶(无裂解作用)(2)抗菌素，无噬菌体只有低水平的细胞外腺苷酸激酶(无裂解作用)。同(1)。(3)无抗菌素，加噬菌体通过噬菌体引起的裂解作用而释放的腺苷酸激酶。(4)抗菌素加噬菌体通过由于噬菌体的裂解作用释放的腺苷酸激酶。同(3)。</table></tables>实施例6用于测定抗菌素抗性的检测试剂盒适当的检测试剂盒包括一个样品容器，它一般可能是如在图5中所示的形成许多孔池的塑料培养板。每个孔池可能容纳的液体总体积大约是0．5ml。这种培养板适合预先制备，以致特定的孔池内可包含有冷冻干燥的(或其它方式保存的)适当的抗菌素和／或噬菌体制剂，以及任选地还有选择性生长培养基。在如图5中所示的培养板中，每排设计了4个孔池，以便用于检测对特定抗菌素的抗性，因此，应用这种培养板，可同时测定3个抗菌素。检测中，对每个孔池加入大约0．2ml体积待测样品，此样品适当地可以是纯培养物，通过免疫捕获而富集的制剂，来自选择性培养基的样品，或者是纯样品。在例如37℃孵育1小时之后，可加入测定腺苷酸激酶活性的试剂。这种试剂可以是在有腺苷酸激酶存在时产生比色信号的试剂，或者更优选地是产生生物发光信号的试剂。特别是应加入ADP和镁离子源，随之在5分钟之后加入虫荧光素和虫荧光素酶，光发射可通过转移至试管内，用试管发光计测定而每次检测一个孔池，或者优选地，在培养板发光计中对培养板作自动检测，或用CCD摄像系统整个地成象。测定了裂解性抗菌素(氨苄青霉素)和非裂解性抗菌素(氯霉素)对大肠杆菌培养物生长的影响。为了诱发抗性而不改变噬菌体宿主的特异性，将编码氨苄青霉素抗性的质粒(PUC18)导入大肠杆菌10243的纯培养物中。为了证实携带此质粒没有改变它的生长速度或者对噬菌体10359的感染作用，还对此抗性株进行了测定，已观测到其生长和感染与敏感株相同。在有大肠杆菌噬菌体10359和裂解性抗菌素(氨苄青霉素)或非裂解性抗菌素(氯霉素)存在时，对从敏感性(未转化的)细菌和抗性细菌释放的腺苷酸激酶进行了比较。对于大肠杆菌10243抗性菌株和敏感性菌株的对数生长期培养物，在T0用105噬菌体10359感染，在T5加入50μg／ml氨苄青霉素。对于敏感性菌珠，在T10可见由于氨苄青霉素引起的细胞裂解，在T20更显著，完全掩盖了由于噬菌体引起的裂解作用。抗性菌株不受此抗菌素的影响，但是20分钟后显示出由于噬菌体感染引起的裂解作用，尽管这种裂解作用直到T40才成为显著。这些结果显示在图6中。此结果表明，在有氨苄青霉素和噬菌体存在的情况下，仅40分钟的孵育之后，就可以测定大肠杆菌10243培养物对氨苄青霉素的敏感性。将大肠杆菌10243对数生长期培养物，在有噬菌体10359和／或氯霉素(34μg／ml)存在下温育80分钟，并如前所述检测腺苷酸激酶。结果显示在图7中。已证明，与仅用氯霉素相比较，当培养物同噬菌体和氯霉素共温育会有较强的细胞裂解作用。虽然氯霉素不是裂解性抗菌素，但是在整个温育过程中都显示细胞裂解作用，可能是由于细胞死亡引起的。在含有此抗菌素的培养物中，噬菌体介导的裂解作用相当弱，因为细菌处于不良生长状态，因此妨碍了噬菌体完成其复制循环。按照用氨苄青霉素抗性突变株所获得的结果，可以预期，氯霉素抗性突变株不论存在和不存在此抗菌素的情况下，都具有相同的表现。因此，60分钟温育之后，背景发光增加的程度将指示培养物对氯霉素是否敏感。权利要求1．腺苷酸激酶检定法在体外试验中的用途，所述试验用于测定外部条件对细菌细胞生长特征的影响。2．权利要求1的用途，其中的试验是用于测定细菌对抗菌素或生物抑制剂的敏感性。3．权利要求1的用途，其中的试验是为了测定细菌的生长阶段。4．一种用于确定细菌对药剂敏感性的方法，该方法包括检测由来自含有所述药剂的培养物细菌裂解所释放的腺苷酸激酶，以及将这些结果与从类似的腺苷酸激酶检定物所获得的结果进行比较，此类似的腺苷酸激酶检定物或者是加入药剂之前的培养物，以及／或者是在不同的时间点来自相同培养物的裂解细菌，和／或是来自不含有此药剂的类似培养物的裂解细菌。5．权利要求4的方法，其中可用化学裂解剂裂解细菌。6．权利要求4的方法，其中的裂解剂对特定细菌是特异性的。7．权利要求6的方法，其中的裂解剂是一种可感染并裂解特定细菌属，种或株的噬菌体。8．权利要求4的方法，其中可用酶裂解细菌。9．权利要求8的方法，其中的酶是溶菌素。10．权利要求3-9中任何之一的方法，其中使细菌首先经受一个分离步骤，以便基本上除去培养物中的其它的任何非靶标细菌。11．权利要求10的方法，其中是应用免疫捕获法进行分离。12．权利要求11的方法，其中的细菌被浓缩在一种固体表面，对此靶细菌特异性的抗体或其结合片段被固定化在固体表面。13．权利要求4-12中任何之一的方法，其中的培养物另外还含有对此细菌具有选择性促进作用的生长培养基。14．权利要求4用于确定细菌对裂解性抗菌素敏感性的方法，该方法包括如下步骤(ⅰ)从其它种微生物中分离出所述细菌；(ⅱ)测定该细菌培养物中细胞外腺苷酸激酶含量，(ⅲ)对此培养物加入裂解性抗菌素，并温育一段足以使抗菌素能发挥其裂解作用的时间，以及(ⅳ)测定此培养物细胞外腺苷酸激酶含量，以便确定是否已发生裂解作用。15．权利要求14的方法，其中在步骤(ⅰ)，是用免疫捕获技术分离出该细菌。16．权利要求14或15的方法，其中的细菌培养物包含对此细菌具有促进作用的选择性生长培养基。17．权利要求4用于确定细菌对非裂解性抗菌素或生物抑制剂敏感性的方法，该方法包括(ⅰ)从其它种微生物中分离出所述细菌，(ⅱ)在有所述非裂解性抗菌素或生物抑制剂存在下，温育该细菌培养物，(ⅲ)通过在间隔的时间内取出样品，裂解这些样品中的细菌，并测定这些样品中的腺苷酸激酶，确定在温育期间培养物中总腺苷酸激酶含量是增加还是减少。18．权利要求17的方法，其中是用化学裂解剂裂解该细菌。19．权利要求17或18的方法，其中在步骤(ⅰ)，是用免疫捕获技术分离出该细菌。20．权利要求17-19中任何之一的方法，其中的细菌培养物包含促进该细菌的选择性生长培养基。21．一种用于确定细菌对抗菌素或生物抑制剂敏感性的方法，该方法包括(a)温育该细菌培养物的第一样品，在该抗菌素存在下温育第二样品，在有将特异性地裂解此靶细菌的噬菌体存在下温育第三样品，以及在有该噬菌体和该抗菌素存在下温育第四样品；(b)在培养之后，测定第一至第四每个样品中的腺苷酸激酶含量，以及(c)根据腺苷酸激酶的测定结果以及此抗菌素或生物抑制剂的作用模式，确定此细菌的敏感性或抗性。22．权利要求21的方法，其中是将在步骤(c)中获得的结果与在本文图4中给出的结果相比较，以便确定该细菌对此抗菌素或生物抑制剂是抗性的还是敏感性的。23．权利要求21或22的方法，其中在步骤(a)之前借助了免疫捕获法使培养物中该细菌的浓度增加了。24．权利要求21-23中任何之一的方法，其中所述的样品另外还包含一种选择性生长培养基，它可在存在其它种微生物的情况下促进所述细菌生长。25．一种确定细菌培养物生长周期的方法，该方法包括(a)使所述细菌培养物的第一样品经受裂解剂处理，导致裂解其中的细菌细胞，(b)检测此第一样品中腺苷酸激酶，(c)检测还没有暴露于裂解剂的该培养物第二样品中的腺苷酸激酶，以及(d)比较从第一和第二培养物得到的结果，并评估培养物的生长阶段。26．权利要求25的方法，其中在步骤(c)中，结果显示在第二样品中腺苷酸激酶水平大约为在第一样品中所发现的腺苷酸激酶水平的1％时，指示是健康的对数生长期培养物，而超过1％的水平指示正在进入静止期。27．权利要求25或26的方法，其中的裂解剂包括去污剂，或者特异性感染和裂解靶细菌细胞的噬菌体。28．一种用于测定细菌对抗菌素敏感性的检测试剂盒，该试剂盒包括一种或几种抗菌素，以及一种或几种测定腺苷酸激酶所必需的试剂。29．权利要求28的检测试剂盒，其中所述的测定腺苷酸激酶所必需的试剂包括ADP，镁离子源，虫荧光素和虫荧光素酶。30．权利要求28或29的检测试剂盒，其中的抗菌素是冷冻干燥的。31．权利要求28-30中任何之一的检测试剂盒，它另外还包含一种裂解剂。32．权利要求31的检测试剂盒，其中的裂解剂包括化学药剂。33．权利要求31的检测试剂盒，其中的裂解剂包括对特定的靶细菌细胞具有特异性的噬菌体。34．权利要求28-33中任何之一的检测试剂盒，它另外还包括一种多孔池的培养板。35．权利要求1的用途，基本上如前面根据实施例所描述的。36．权利要求4的方法，基本上如前面根据实施例所描述的。37．一种检测试剂盒，基本上如前面根据实施例6所描述的。全文摘要腺苷酸激酶检定法在体外试验中的用途,所述试验用于测定外部条件对细菌细胞生长特征的影响。这种检测特别包括测定细菌对抗菌素或生物抑制剂的敏感性,以及测定评估细菌的生长阶段和健康状况。还描述了实现这些检测的方法和实施它们的试剂盒,并对它们要求专利保护。文档编号C12Q1/18GK1294634SQ99804269公开日2001年5月9日申请日期1999年1月12日优先权日1998年1月21日发明者M·J·穆菲,R·L·普赖斯,D·J·斯奎雷尔申请人:英国国防部