一种从柽柳组织中提取总rna 的方法
【专利摘要】一种从柽柳组织中提取总RNA的方法，通过用试剂盒结合添加PVPP粉改进传统提取RNA的方法，使得不易提取的植物材料RNA提取效果和质量提高。主要的技术流程包括试剂盒设备提取前处理，提取RNA的详细过程，以及后期RNA浓度和质量控制检测。用该方法从柽柳组织中提取总RNA浓度高，质量好，没有蛋白质和其它的杂质污染。这项发明为提取荒漠中多盐多酚类的植物的RNA提取提供了参考。
【专利说明】
一种从柽柳组织中提取总RNA的方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种荒漠植物柽柳RNA的提取方法。
【背景技术】
[0002] 提取高质量的RNA是进行Northern分析、RT-PCR、cDNA文库构建、DD-PCR分析 及体外翻译等分子生物学研究的必要前提，是研究基因表达的重要环节;荒漠植物具有很 强的抗逆性，主要是其中含有大量的次生代谢物，如多糖、多酚、单宁等物质，在细胞破碎 后，这些物质将以不同的方式干扰RNA的提取，严重影响所提取RNA的质量和产量；因此 查找出能够抑制或减少次生代谢物的干扰，是实现简单可行的RNA提取方法的主要难题。 [0003] 多枝柽柳(Tamarix ramosissima )属灌木或小乔木，高l_5m;枝条细瘦，红棕色； 叶披针形、长2-5 cm，总状花序密生在当年生枝上，组成顶生大圆锥花序;果实为蒴果三角 状圆锥形;多枝柽柳喜光不耐阴，在遮阴处多生长不良；根系发达，既耐干又耐水湿，抗风能 力强，耐盐碱土，能在含盐量1.2%的盐碱地上正常生长；由于多枝柽柳具有抗严寒、耐高温、 耐干旱、耐盐碱、耐瘠薄、耐风蚀、耐病虫的特性，所以将其作为防风、固沙、改良盐碱地的重 要造林树种；阿勒泰地区的开展绿色通道建设及退耕还林工作中，就把多枝柽柳作为了重 要的造林树种加以推广种植，收到了很好的效果。
[0004] 根据报道，改良的CTAB法可以提取柽柳组织中的总RNA，但是比较繁琐，需要的时 间比较长，而且产量也低;甚至由于反复的操作，容易造成RNA降解和污染；目前RNA提取的 试剂盒种类繁多，但是很难找到适合柽柳组织的商用RNA提取试剂盒;这是由于柽柳组织破 碎后，只要加入裂解溶液，溶液颜色立马变深，说明柽柳多酚、多糖及其他次级代谢物的氧 化非常迅速;而普遍适用的巯基乙醇基本对这一现象起不到明显作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对现有技术存在的上述不足之处，提供一种快速稳定柽柳总 RNA的提取方法。本发明采用Omega公司商用RNA提取试剂盒E.Z.N.A? Plant RNA Kit结合 PVPP粉的方法，开发出了一种针对柽柳的根、茎、叶和花组织，提取RNA的快速稳定的方法； 此种方法得到的RNA量及质量非常高，能够成功地应用于RT-PCR和下一代的高通量的转录 组测序等下游技术。
[0006] 为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案： 一种从柽柳组织中提取总RNA的方法，该方法包括试剂盒设备提取前处理，提取步骤， 质量检测；其中试剂盒设备提取前处理是：提取前将用到的离心管、药勺和研钵用0.1% DEPC的水溶液浸泡12小时，然后用铝泊纸包裹，高压蒸汽灭菌和干燥;提取前用70%酒精喷 雾清洗离心机、试验台、试管架和移液器，然后用无菌纸巾擦干，反复2-3次，确保实验台及 实验所有仪器及设备无污染。
[0007] 其中提取步骤包括： 1)根据E.Z.N.A? Plant RNA Kit (Omega Bio-tek, Doraville, GA, USA)操作手 册要求，在RNA Wash Buffer II中加入48 ml 95%的乙醇，上下颠倒，充分混勾，备用； 2) 在5 ml试管中加入E.Z.N.A? Plant RNA Kit (Omega Bio-tek，Doraville，GA, USA)裂解液RCL 4 ml,再加入4X20 iil的巯基乙醇，盖上盖子，在涡旋振荡器上轻轻振 荡，充分混匀，总体积共达4080yl; 3) 然后用1000移液器移取步骤2)中700yl裂解液RCL与巯基乙醇的混合溶液，加入 1.5 ml或2 ml经液氮预冷过的自备离心管中，放置预冷过的试管架上备用； 4) 称PVPP粉，PVPP粉的量为柽柳组织样品重量的2%，分别放入四个完全预冷并装有液 氮的研钵中； 5 )在装有PVPP的研钵中，分别放入新鲜的或者液氮冷冻的柽柳根、茎、叶、花组织进行 充分研磨；把研磨后的柽柳根、茎、叶、花组织粉末，（不低于70 mg，不超过100mg)分别放入 步骤3)盛有700 yl裂解液RCL与巯基乙醇的混合溶液1.5ml或2ml的4个自备离心管 中，盖上盖子，在涡旋振荡器上充分振荡2~5分钟，然后放入50°C水浴锅水浴，水浴期间取 出振荡几次，充分混勾； 6) 将步骤5)中装有样品和裂解液的4个离心管取出水浴，放入eppendorf离心机中，以 14000 rpm转速离心2分钟，取出离心管，放置在试管架上； 7) 用1000 ul的移液器移取步骤6)离心管中的上清液600 yl到新的1.5ml或2ml离 心管中；然后用移液器枪加入300 ul的95%的乙醇，枪头不出离心管，吸入排除反复5-10 次，至完全混匀； 8) 将HiBincf RNA Mini柱置放在2 ml收集管上，转移步骤7)离心管中所有溶液到 HiBind? RNA Mini 柱上，然后 10000 rpm离心 1 分钟； 9) 弃掉收集管中的废液，重新在HiBind? RNA Mini柱上加入400 ul RWC Wash Buffer，10000 rpm离心 30秒； 10) 弃掉收集管中的废液，用移液器取步骤1)配置好的RWC Wash Buffer II 400 yl， 加到HiBind? RNA Mini 柱上，10000 rpm离心30秒； 11) 分别加入预先配置的DNasel 80 ul(70 ul DNase酶，10 ul共320 ul)，放置15 分钟;然后用10000 rpm离心30秒;倒掉收集管中的废液，再10000 rpm离心20秒，甩掉管 壁的残液； 12) 把HiBind? RNA Mini柱放置在新的1.5 ml的收集管上，打开HiBind? RNA Mini 柱盖子2分钟； 13) 在HiBind? RNA Mini柱中央，加入30-50 ul DEPC水后，盖上盖子，静置3分钟；用 14000 rpm离心2分钟;得到的RNA放-80°C存储。
[0008] 其中步骤4)中，2%柽柳组织样品重量的PVPP粉必须研磨怪柳之前加入； 其中步骤5)所述新鲜柽柳或者液氮冷冻的柽柳根、茎、叶或花组织放入盛有液氮的研 钵中； 其中步骤6)所述取出离心管时避免强烈震荡； 其中步骤7)所述上清液避免杂质，随后加入的乙醇与上清液的体积比为1:2; 其中步骤11)所述DNase I需要现用现配； 其中步骤13)所述DEPC水的温度范围40-50 °C，体积为30-50 ul。
[0009] 该方法从柽柳组织中提取的总RNA，需要质量检测，其中包括以下方法： 1) Nanodrop检测RNA质量，要求在260 nm处有完美的RNA峰型，260/230值在1.0-2.0之间，260/280 值在 1.8-2.2之间； 2) 用Agileng Technologies 2100 Bioanalyzer 的RNA integrity number(RIN)软 件评估的多枝柽柳（了311^1^1^11108188；[11^)根莖叶花组织总1?财质量，要求1?11'1值大于7， rRNA Ratio大于1.5; 3) 琼脂糖电泳检测RNA质量，要求电泳分离出条带清晰可见的5S和18S和28S条带。
【附图说明】
[0010] 图1柽柳根、茎、叶、花组织Nanodrop检测RNA质量峰图； 图2_a:多枝怪柳(Tamarix ramosissima)Bioanalyzer检测根组织rRNA峰图； 图2_b:多枝怪柳(Tamarix ramosissima)Bioanalyzer检测莖组织rRNA峰图； 图2_c:多枝怪柳(Tamarix ramosissima)Bioanalyzer检测叶组织rRNA峰图； 图2_d:多枝怪柳(Tamarix ramosissima)Bioanalyzer检测花组织rRNA峰图 图3:多枝柽柳(Tamarix ramos i ss ima)根、莖、叶、花组织RNA琼脂糖电泳图 其中 1为根组织； 2为茎组织； 3为叶组织； 4为花组织； M为DNA marker
【具体实施方式】 下面结合附图，用本发明实施例来进一步说明本发明的实施方式，但并不以此来限定 本发明。 实施例
[0011 ]提取柽柳根、茎、叶及花组织种内总RNA方法概述： 发明的内容包括所需试剂盒设备，提取前专有处理过程，提取操作步骤和所提的RNA质 量检测四部分。具体实施方案如下： 一、 所需试剂和设备 0.1% DEPC水、无水乙醇、液氮、巯基乙醇、E.Z.N.A? Plant RNA Kit试剂盒； 离心管、试管架、药勺、研钵、灭菌锅、铝泊纸、无菌纸巾、1000 ul移液器、200 ul移液 器、100 ul移液器、50 ul移液器、1000 ul带过滤器的枪头、200 ul带过滤器的枪头、100 ul 带过滤器的枪头、50 ul带过滤器的枪头； 二、 提取前专有处理过程 提取前将用到的离心管、药勺和研钵用0.1% DEPC的水溶液浸泡12小时，然后用铝泊 纸包裹在高压蒸汽灭菌和干燥。提取前用70%酒精喷雾清洗离心机、试验台、试管架、移液 器，然后用无菌纸巾擦干;反复2-3次，确保实验台及实验所有仪器及设备无污染； 三、 提取步骤包括： 1)根据E.Z.N.A? Plant RNA Kit (Omega Bio-tek, Doraville, GA, USA)操作手 册要求，在RNA Wash Buffer II中加入48 ml 95%的乙醇，上下颠倒，充分混勾，备用； 2) 在5ml试管中加入E.Z.N.A? Plant RNA Kit (Omega Bio-tek，Doraville, GA, USA)裂解液RCL 4 ml,再加入4X20 iil的巯基乙醇，盖上盖子，在涡旋振荡器上轻轻振 荡，充分混匀，总体积共达4080 yl; 3) 然后用1000移液器移取步骤2)中700 yl裂解液RCL与巯基乙醇的混合溶液，加 入1.5 ml或2 ml经液氮预冷过的自备离心管中，放置预冷过的试管架上备用； 4) 称PVPP粉，PVPP粉的量为柽柳组织样品重量的2%，分别放入四个完全预冷并装有液 氮的研钵中； 5 )在装有PVPP的研钵中，分别放入新鲜的或者液氮冷冻的柽柳根、茎、叶、花组织进行 充分研磨;把研磨后的柽柳根、茎、叶、花组织粉末，（不低于70 mg，不超过100 mg)分别放入 步骤3)盛有700 yl裂解液RCL与巯基乙醇的混合溶液1.5ml或2ml的4个自备离心管 中，盖上盖子，在涡旋振荡器上充分振荡2~5分钟，然后放入50°C水浴锅水浴，水浴期间取 出振荡几次，充分混勾； 6) 将步骤5)中装有样品和裂解液的4个离心管取出水浴，放入eppendorf离心机中，以 14000 rpm转速离心2分钟，取出离心管，放置在试管架上； 7) 用1000 ul的移液器移取步骤6)离心管中的上清液600 yl到新的1. 5ml或2ml 离心管中；然后用移液器枪加入300 ul的95%的乙醇，枪头不出离心管，吸入排除反复5-10次，至完全混匀； 8) 将HiBincf RNA Mini柱置放在2 ml收集管上，转移步骤7)离心管中所有溶液到 HiBind? RNA Mini 柱上，然后 10000 rpm离心 1 分钟； 9) 弃掉收集管中的废液，重新在HiBind? RNA Mini柱上加入400 ul RWC Wash Buffer，10000 rpm离心 30秒； 10) 弃掉收集管中的废液，用移液器取步骤1)配置好的RWC Wash Buffer II 400 yl， 加到HiBind? RNA Mini 柱上，10000 rpm离心30秒； 11) 分别加入预先配置的DNasel 80 ul(70 ul DNase酶，10 ul共320 ul)，放置15 分钟;然后用10000 rpm离心30秒;倒掉收集管中的废液，再10000 rpm离心20秒，甩掉管 壁的残液； 12) 把HiBind? RNA Mini柱放置在新的1.5 ml的收集管上，打开HiBind? RNA Mini 柱盖子2分钟； 13) 在HiBind? RNA Mini柱中央，加入30-50 ul DEPC水后，盖上盖子，静置3分钟；用 14000 rpm离心2分钟;得到的RNA放-80°C存储； 四、RNA质量检测包括： 1) Nanodrop检测RNA质量，要求在260 nm处有完美的RNA峰型，260/230值在1.0-2.0之间，260/280 值在 1.8-2.2之间； 2) 用Agileng Technologies 2100 Bioanalyzer 的RNA integrity number(RIN)软 件评估的多枝柽柳(Tamarix ramosissima)根、莖、叶、花组织总RNA质量，要求RIN值大于7， rRNA Ratio大于1.5; 3) 琼脂糖电泳检测RNA质量，要求电泳分离出条带清晰可见的5S、28S和18S三条带； 4.1 Nanodrop 检测 RNA 质量 取1 ul上述方法提取的多枝柽柳(Tamarix ramosissima )根、莖、叶、花组织的RNA 在NanoDrop 2000仪器上检测，检测设定为RNA，结果显示260/230的值大于1.5,说明 RNA中的多糖杂质含量很低;260/280的值大于1.8,位于1.8 - 2.2之间，说明RNA中的 蛋白质杂质含量很低(如附图1所示）； 4.2 Bioanalyzer RIN值及rRNA Ratio检测 以Agilent Bioanalyzer进行毛细管电泳（capillary electrophoresis)，并以软件的 RIN(RNA Integrity Number)分数评估，10为RNA完整性最好，0为最差；检测结果在7.4和 7.6之间（参见表l)，5S、18S及28SrRNA峰非常尖锐，说明RNA完整性很好(如附图2-a、2-b、 2-c、2-d所不）； 表1 用Agileng Technologies 2100 Bioanalyzer 的RNA integrity number(RIN) 软件评估的多枝柽柳(Tamarix ramosissima )根莖叶花组织总RNA质量； 表1总RNA质量评估
4.3琼脂糖电泳检测RNA质量 取5 0 0 n g上述方法提取的多枝柽柳的R N A在1 %的琼脂糖胶电泳分离，电泳电压为 105V/cm，电泳时间为15 111；[11。661-^(1染色，13;[01^(1凝胶成像仪检测和照相。检测结果说明 本方法提取的RNA琼脂糖胶电泳检测具有5S、18S和28S三个条带，条带清晰可见，说明所提 取的RNA质量高(如附图3所示）。
[0012] 综合NanoDrop 2000仪、Agilent Bioanalyzer和琼脂糖电泳检测结果说明：本方 法提取柽柳根、茎、叶及花组织的RNA质量高，产量高，无蛋白质的污染。
【主权项】
1. 一种从柽柳组织中提取总RNA的方法，该方法包括试剂盒设备提取前处理，提取步 骤，质量检测;其特征在于： 所述试剂盒设备提取前处理:将离心管、药勺和研钵用0.1% DEPC的水溶液浸泡12小 时，然后用铝泊纸包裹，高压蒸汽灭菌和干燥;用70%酒精喷雾清洗离心机、试验台、试管架 和移液器，然后用无菌纸巾擦干，反复2-3次，确保实验台及实验所有仪器及设备无污染； 所述提取步骤包括： 1) 在RNA Wash Buffer II中加入48 ml 95%的乙醇，上下颠倒，充分混勾，备用； 2) 在5ml试管中加入E.Z.N.A? Plant RNA Kit (Omega Bio-tek, Doraville, GA， USA)裂解液RCL 4 ml，再加入4X20 μL的β-巯基乙醇，盖上盖子，在涡旋振荡器上轻轻振 荡，充分混匀，总体积共达4080 μL; 3) 用1000移液器移取步骤2)中700 μL裂解液RCL与β-巯基乙醇的混合溶液，加入 1.5 ml或2 ml经液氮预冷过的自备离心管中，放置预冷过的试管架上备用； 4) 称交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)粉，PVPP粉的量为柽柳组织样品重量的2%，分别放入 四个完全预冷并装有液氮的研钵中； 5) 在装有PVPP的研钵中，分别放入新鲜的或者液氮冷冻的柽柳根、茎、叶、花组织进行 充分研磨；把研磨后的柽柳根、茎、叶、花组织粉末，分别放入步骤3)盛有700 μL裂解液 RCL与β-巯基乙醇的混合溶液1.5 ml或2 ml的4个自备离心管中，盖上盖子，在涡旋振荡 器上充分振荡2~5分钟，然后放入50°C水浴锅水浴，水浴期间取出振荡几次，充分混匀;所 述研磨后的柽柳根、茎、叶、花组织粉末不能低于70 mg，而且不能超过100 mg; 6) 将步骤5)中装有样品和裂解液的4个离心管取出水浴，放入eppendorf离心机中，以 14000 rpm转速离心2分钟，取出离心管，放置在试管架上； 7) 用1000 ul的移液器移取步骤6)离心管中的上清液600 μL到新的1.5 ml或2 ml 离心管中；然后用移液器枪加入300 ul的95%的乙醇，枪头不出离心管，吸入排除反复5-10次，至完全混匀； 8) 将HiBincT RNA Mini柱置放在2 ml收集管上，转移步骤7)离心管中所有溶液到 HiBind? RNA Mini 柱上，然后 10000 rpm离心 1 分钟； 9) 弃掉收集管中的废液，重新在HiBincT RNA Mini柱上加入400 ul RWC Wash Buffer，10000 rpm离心 30秒； 10) 弃掉收集管中的废液，用移液器取步骤1)配置好的RWC Wash Buffer II 400 μL， 加到HiBind? RNA Mini 柱上，10000 rpm离心30秒； 11) 分别加入预先配置的DNasel 80 ul(70 ul DNase酶，10 ul共320 ul)，放置15 分钟;然后用10000 rpm离心30秒;倒掉收集管中的废液，再10000 rpm离心20秒，甩掉管 壁的残液； 12) 把HiBincT RNA Mini柱放置在新的1.5 ml的收集管上，打开HiBincT RNA Mini 柱盖子2分钟； 13) 在HiBincT RNA Mini柱中央，加入30-50 ul DEPC水后，盖上盖子，静置3分钟；用 14000 rpm离心2分钟;得到的RNA放-80°C存储； 所述质量检测： l)Nanodrop检测RNA质量，取1 ul提取的多枝怪柳（Tamarix ramosissima )根、莖、 叶、花组织的RNA在NanoDrop 2000仪器上检测，检测设定为RNA，结果显示260/230的 值大于1.5; 260/280的值大于1.8; 2. Bioanalyzer RIN值及rRNA Ratio检测，以Agilent Bioanalyzer进行毛细管电泳 (capillary electrophoresis)，并以软件的RIN(RNA Integrity Number)分数评估，检测 结果在7.4和7.6之间，5S、18S及28S rRNA峰非常尖锐，RNA完整性好； 3) 琼脂糖电泳检测RNA质量，取500 ng提取的多枝柽柳的RNA在1%的琼脂糖胶电泳分 离，电泳电压为105 V/cm，电泳时间为15 min ;Gel-red染色，BioRad凝胶成像仪检测和照 相;提取的RNA琼脂糖胶电泳检测具有5S、18S和28S三个条带，条带清晰可见。2. 根据权利要求1所述的从柽柳组织中提取总RNA的方法，其中步骤4)中，2%柽柳组织 样品重量的PVPP粉在研磨怪柳之前加入。3. 根据权利要求1所述的从柽柳组织中提取总RNA的方法，其中步骤7)所述上清液避免 杂质，随后加入的乙醇与上清液的体积比为1:2。4. 根据权利要求1所述的从柽柳组织中提取总RNA的方法，其中步骤13)所述DEPC水的 温度范围40-50 °C，体积为30-50 ul。
【文档编号】C12N15/10GK105821032SQ201610217611
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月11日
【发明人】燕霞, 马小飞, 钱朝菊, 尹成亮, 殷恒霞, 石勇
【申请人】中国科学院寒区旱区环境与工程研究所