一种二氯甲烷法提取dna的原理的制作方法
【专利摘要】本发明属于DNA提取技术领域且公开了一种有机二氯甲烷法提取DNA的原理，核DNA的提取原理是：以低渗法裂解细胞，之后通过离心收集细胞核，核内DNA通过加入SDS、Triton、Tween20等去垢剂或加热煮沸法将细胞膜、核膜破坏，使DNA从细胞核内释放，再加入蛋白酶K，水解膜蛋白和核蛋白，使DNA游离在溶液中，随后以不同的方法去除杂质，收集DNA，抽提DNA中最为经典的为有机法。传统的有机提取法(即经典的饱和酚－氯仿法)：利用有机的蛋白质变性剂酚、氯仿(三氯甲烷)交替抽提，使蛋白质变性，有效地去除蛋白质等杂质，该二氯甲烷法提取DNA的原理，克服酚的缺点，加速有机相与液相分层，最后用更加环保的另一种有机溶剂?二氯甲烷进行抽提DNA，去除核酸溶液中的迹量酚，得到了同样高质量和高浓度的DNA。
【专利说明】
一种二氯甲烷法提取DNA的原理
技术领域
[0001]本发明涉及一种有机法提取DNA的原理，具体涉及一种二氯甲烷法提取DNA的原理，属于DNA提取技术领域。
【背景技术】
[0002]脱氧核糖核酸(缩写为DNA)又称去氧核糖核酸，是一种分子，双链结构，由脱氧核糖核苷酸(成分为:脱氧核糖、磷酸及四种含氮碱基)组成。可组成遗传指令，引导生物发育与生命机能运作，主要功能是长期性的资讯储存，可比喻为“蓝图”或“食谱”，其中包含的指令，是建构细胞内其他的化合物，如蛋白质与RNA所需，带有遗传讯息的DNA片段称为基因，其他的DNA序列，有些直接以自身构造发挥作用，有些则参与调控遗传讯息的表现，组成简单生命最少要265到350个基因。
[0003]现有有机法DNA提取主要原料为三氯甲烷(又名氯仿)，但是三氯甲烷是现在制作冰毒的必需原料，属于限购试剂，在实验中很难正常买到;其次，三氯甲烷具有高腐蚀性和毒性，对我们的环境和生活有着严重的影响，为了更为有效和环保的进行实验，我们尝试了在这个DNA提取方法中将二氯甲烷(易购买，毒性小)替代三氯甲烷(又名氯仿)，结果得到了同样高浓度和高质量的DNA，为此，我们提出一种有机二氯甲烷法提取DNA的原理。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题克服现有的缺陷，提供一种二氯甲烷法提取DNA的原理，该二氯甲烷法提取DNA的原理，克服三氯甲烷自身的缺点；加速有机相与液相分层，最后用更为环保并效果相同的二氯甲烷替代三氯甲烷抽提DNA，去除核酸溶液中的迹量酚，不仅保证了 DNA的提取率，而是更加环保和切合实际的提供另一种有机的DNA提取方法，有效解决【背景技术】中的问题。
[0005 ]为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案:
[0006](I)血液(痕):取血液ΙΟΟμΙ (血痕0.5cm2)置1.5ml移液器管中，加入400μ1 TES(1mmoI/L缓冲液，pH 8.0，100mmol/L氯化钠，lmmol/L EDTA),10%SDS 40μ1,10mg/ml ΡΚ8μ1，37Γ水浴过液，以等体积酚/二氯甲烷/异戊醇(25:24:1)抽提2-4次，二氯甲烷/异戊醇(24:1)抽提I次。加2倍体积冷无水乙醇和1/10体积3mol/L氯化钠沉淀DNA，置-20 °C 2h后10000r/min离心20min，倾去无水乙醇，70%_75%乙醇洗涤1000rpm 5min，弃乙醇，DNA干燥后加适量ddH20(pH 8.2)溶解备用。
[0007](2)组织:取1mg左右组织，研磨后，置I.5ml移液器管中，加入400μ1 TES，1 %SDS40yia0mg/ml ΡΚ12μ1，后继步骤同⑴。
[0008](3)毛根:取4-6根带毛囊毛发(0.3cm)，置0.5ml移液器管中，加入ΙΟΟμΙ TES,10%SDS 10yia0mg/ml ΡΚ8μ1，39mmol/L DTT 10μ1，后继步骤同⑴。
[0009](4)唾液斑:取唾液斑1.0-2.0cm2，剪碎，TES浸泡Ih，用灭菌牙签搅动载体以使细胞脱离载体，去载体，1000rpm离心1min，弃上清，于沉淀内加入400μ1 TES, 10%SDS 40μlaOmg/ml PK8yl，37°C过夜或56°C两小时，后继步骤同⑴。
[0010](5)混合斑:取混合斑0.5cm2，剪碎，TES4°C浸泡2h，去载体，1000rpm离心10_，弃上清液，于沉淀内加入400μ1 TES ,10% SDS 40μ1,10mg/ml ΡΚ8μ1，52°C3h，用TES反复洗涤3次除去阴道上皮细胞，方法①再加入400μ1 TESa0%SDS40yl,10mg/ml PK15yl，39mmDTT40yl，37 °C过夜或56 °C 2小时，以等体积酚/二氯甲烷/异戊醇(25:24:1)抽提2_4次，二氯甲烷/异戊醇(24:1)抽提I次。加2倍体积冷无水乙醇和I/10体积3mo 1/L氯化钠沉淀DNA，置-20°C2h后10000r/min离心20min，倾去无水乙醇，DNA干燥后加适量ddH20(pH 8.2)溶解备用；方法②加入 5%CHELEX-100 ΙΟΟμΙ，10mg/ml PK10yl,39mm DTT20yl，37°C 过夜或 56°C2小时，剧烈振荡，100 °C加热1min，剧烈振荡，10000r-min 1min，取上清液进行检测扩增。
[0011](6)骨、指甲:同血液DNA提取，骨和指甲的消化时间延长至3天到I周，蛋白酶K用量为25μ1 (20mg/ml)左右，消化时加入适量39mM DTT。
[0012](7)污染检材DNA提取:检材用TES液洗涤1-2次后以酚-二氯甲烷法提取DNA，提取的DNA经无水乙醇、3M氯化钠涫淀后再加入TES、10mg/ml PK、10%SDS进行二次消化，再以酸-二氣甲烧法提取DNA。
[0013]本发明所达到的有益效果是:一种二氯甲烷法提取DNA的原理，采用酚抽提细胞DNA，能够使蛋白质变性，同时抑制了脱氧核糖核酸酶的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相，使用酚的优点:1.有效变性蛋白质;2.抑制了脱氧核糖核酸酶的降解作用，采用二氯甲烷抽提细胞DNA，克服酚的缺点；加速有机相与液相分层，最后用二氯甲烷抽提，去除核酸溶液中的迹量酚。通过这种改良的有机法(即酚-二氯甲烷法)最后提取到了和三氯甲烷相同效果的DNA，改进了一种更加环保、实用的科研实验方法。
【具体实施方式】
[0014]以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0015]实施例:本发明一种二氯甲烷法提取DNA的原理:
[0016](I)血液(痕):取血液ΙΟΟμΙ (血痕0.5cm2)置1.5ml移液器管中，加入400μ1 TES(1mmoI/L缓冲液，pH 8.0，100mmol/L氯化钠，lmmol/L EDTA),10%SDS 40μ1,10mg/ml ΡΚ8μ1，37Γ水浴过液，以等体积酚/二氯甲烷/异戊醇(25:24:1)抽提2-4次，二氯甲烷/异戊醇(24:1)抽提I次。加2倍体积冷无水乙醇和1/10体积3mol/L氯化钠沉淀DNA，置-20 °C 2h后100001'/111；[11离心20111；[11，倾去无水乙醇，70%_75% 乙醇洗涤1000rpm 5min，弃乙醇，DNA干燥后加适量ddH20(pH 8.2)溶解备用。
[0017](2)组织:取1mg左右组织，研磨后，置I.5ml移液器管中，加入400μ1 TES，1 %SDS40yia0mg/ml ΡΚ12μ1，后继步骤同⑴。
[0018](3)毛根:取4-6根带毛囊毛发(0.3cm)，置0.5ml移液器管中，加入ΙΟΟμΙ TES,10%SDS 10yia0mg/ml ΡΚ8μ1，39mmol/L DTT 10μ1，后继步骤同⑴。
[0019](4)唾液斑:取唾液斑1.0-2.0cm2，剪碎，TES浸泡Ih，用灭菌牙签搅动载体以使细胞脱离载体，去载体，1000rpm离心1min，弃上清，于沉淀内加入400μ1 TES, 10%SDS 40μia0mg/ml PK8yl，37°C过夜或56°C两小时，后继步骤同⑴。
[0020](5)混合斑:取混合斑0.5cm2，剪碎，TES4°C浸泡2h，去载体，1000rpm离心10_，弃上清液，于沉淀内加入400μ1 TES ,10% SDS 40μ1,10mg/ml ΡΚ8μ1，52°C3h，用TES反复洗涤3次除去阴道上皮细胞，方法①再加入400μ1 TESa0%SDS40yl,10mg/ml PK15yl，39mmDTT40yl，37 °C过夜或56 °C 2小时，以等体积酚/二氯甲烷/异戊醇(25:24:1)抽提2_4次，二氯甲烷/异戊醇(24:1)抽提I次。加2倍体积冷无水乙醇和I/10体积3mo 1/L氯化钠沉淀DNA，置-20°C2h后10000r/min离心20min，倾去无水乙醇，DNA干燥后加适量ddH20(pH 8.2)溶解备用；方法②加入 5%CHELEX-100 ΙΟΟμΙ，10mg/ml PK10yl,39mm DTT20yl，37°C 过夜或 56°C2小时，剧烈振荡，100 °C加热1min，剧烈振荡，10000r-min 1min，取上清液进行检测扩增。
[0021](6)骨、指甲:同血液DNA提取，骨和指甲的消化时间延长至3天到I周，蛋白酶K用量为25μ1 (20mg/ml)左右，消化时加入适量39mM DTT。
[0022](7)污染检材DNA提取:检材用TES液洗涤I _2次后以酚-二氯甲烷法提取DNA，提取的DNA经无水乙醇、3M氯化钠涫淀后再加入TES、10mg/ml PK、10%SDS进行二次消化，再以酸-二氣甲烧法提取DNA。
[0023]DNA提取原理:动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白(DNP)可溶于水或浓盐溶液(如lmol/L氯化钠)，但在0.14mol/L氯化钠盐溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白(RNP)则在
0.14mol/L氯化钠中溶解度最大，利用这一性质可将其分开。将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，使DNA与蛋白质分离开。加入固体氯化钠使其浓度达至Ijlmol/L，使DNA溶解。加氯仿-异戊醇去除蛋白质，也可重复该步操作得较纯DNA。最后用95 %乙醇沉淀DNA。溶解:将离心后除去RNA的沉淀，用30ml生理盐水溶解，充分搅拌后，匀浆一次。加4毫升1 % SDS溶液，使溶液的SDS浓度达到I %左右，边加边搅拌，放置60 V水浴保温10分钟(不停搅拌)，冷却。加固体氯化钠，使溶液氯化钠浓度达到lmol/L，充分搅拌10分钟；除杂质:加等体积氯仿-异戊醇混合液，充分震荡10分钟，8000r/min离心7分钟，取上层液量好体积，倒入烧杯中(离心管)，加同体积的氯仿-异戊醇混合液，重复上次操作。直至界面不出现蛋白凝胶为止;沉淀:准确量取上清液体积，加2倍体积95%冷乙醇，搅拌后，置冰箱静止冷却，待有白色丝状物出现，约10-15分钟，离心8000r/min离心7分钟，得白色沉淀；溶解:将沉淀物用0.lmol/L氢氧化钠约10毫升溶解，得DNA溶液。溶液I一溶菌液:溶菌酶:它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β_1，4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中PH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖:增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA:(1)螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用；(2)EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。溶液II一NAOH—SDS液:氢氧化钠:核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH> 12或pH<3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NAOH浓度为0.2mol/L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。SDS = SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有:(I)溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。(2)解聚细胞中的核蛋白。(3) SDS能与蛋白质结合成为R-O-S03-…R+-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中受到干扰。溶液II1-3moI/L NAAC(pH4.8)溶液:NAAC的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NAAC-HAC的缓冲液。用pH4.8的NAAC溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol/L NAAC有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS—蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67 %左右。因而也可改用95 %乙醇来替代无水乙醇(因为无水乙醇的价格远远比95 %乙醇昂贵)。但是加95 %的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用
0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15 — 30分钟即可。在用乙醇沉淀DNA时，在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NAAC或NACL，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。加进去的RNASE本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAC使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNASE。在溶液中，有人以KAC代替NAAC，也可以收到较好效果。在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统(PKA = 7.2)和硼酸系统(PKA = 9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3(P04)2沉淀;在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用TRIS-HCL(PKA = 8.0)的缓冲系统，由于缓冲液是TRISH+/TRIS，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用TRIS-HCL系统，而TE缓冲液中的Η)ΤΑ更能稳。抽提DNA去除蛋白质时，酸与二氯甲烷是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或二氯甲烷混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或二氯甲烷挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与二氯甲烷有机溶剂比重更大，保留在最下层。作为表面变性的酚与二氯甲烷，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10%?15%的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而二氯甲烷的变性作用不如酚效果好，但二氯甲烷与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与二氯甲烷效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与二氯甲烷是互溶的，可用二氯甲烷第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与二氯甲烷混合(1:1)使用。在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用二氯甲烷与异戊酵为24:1之比。也可采用酚、二氯甲烷与异戊醇之比为25:24:1(不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24:1的二氯甲烷与异戊醇即成)，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。酚与二氯甲烷是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或二氯甲烷混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或二氯甲烷挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与二氯甲烷有机溶剂比重更大，保留在最下层。作为表面变性的酚与二氯甲烷，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10%?15%的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而二氯甲烷的变性作用不如酚效果好，但二氯甲烷与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与二氯甲烷效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与二氯甲烷是互溶的，可用二氯甲烷第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与二氯甲烷混合(1:1)使用。在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用二氯甲烷与异戊酵为24:1之比。也可采用酚、二氯甲烷与异戊醇之比为25:24:1(不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24:1的二氯甲烷与异戊醇即成)，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。
[0024]最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种二氯甲烷法提取DNA的原理，其特征在于，各种生物样本具体DNA提取操作方法: (1)血液(痕):取血液ΙΟΟμΙ(血痕0.5cm2)置1.5ml移液器管中，加入400μ1 TES(1mmoI/L缓冲液，pH 8.0，100mmol/L氯化钠，lmmol/L EDTA),10%SDS 40μ1,10mg/ml ΡΚ8μ1，37Γ水浴过液，以等体积酚/二氯甲烷/异戊醇(25:24:1)抽提2-4次，二氯甲烷/异戊醇(24:1)抽提I次。加2倍体积冷无水乙醇和1/10体积3mol/L氯化钠沉淀DNA，置-20 °C 2h后100001'/111；[11离心20111；[11，倾去无水乙醇，70%_75% 乙醇洗涤1000rpm 5min，弃乙醇，DNA干燥后加适量ddH20(pH 8.2)溶解备用； (2)组织:取1mg左右组织，研磨后，置I.5ml移液器管中，加入400μ1 TES，10 % SDS 40μia0mg/ml ΡΚ12μ1，后继步骤同⑴; (3)毛根:取4-6根带毛囊毛发(0.3cm)，置0.5ml移液器管中，加入ΙΟΟμΙTES,10%SDS.10yia0mg/ml ΡΚ8μ1，39mmol/L DTT 10μ1，后继步骤同⑴; (4)唾液斑:取唾液斑1.0-2.0cm2，剪碎，TES浸泡Ih，用灭菌牙签搅动载体以使细胞脱离载体，去载体，1000rpm离心lOmin，弃上清，于沉淀内加入400μ1 TES, 10%SDS 40μ1，.10mg/ml PK8yl，37°C过夜或56°C两小时，后继步骤同(I); (5)混合斑:取混合斑0.5cm2，剪碎，TES4 °C浸泡2h，去载体，1000rpm离心1mm，弃上清液，于沉淀内加入400μ1 TES,10%SDS 40yl，10mg/ml ΡΚ8μ1，52°C3h，用TES反复洗涤3次除去阴道上皮细胞，方法①再加入400μ1 TESa0%SDS40yia0mg/ml PK15yl,39mm DTT40yl,.37 °C过夜或56 °C 2小时，以等体积酚/二氯甲烷/异戊醇(25: 24:1)抽提2_4次，二氯甲烷/异戊醇(24:1)抽提I次。加2倍体积冷无水乙醇和1/10体积3mol/L氯化钠沉淀DNA，置-20 °C 2h后10000r/min离心20min，倾去无水乙醇，DNA干燥后加适量ddH20(pH 8.2)溶解备用；方法②加入5%CHELEX-100100yl，10mg/ml PK10yl，39mm DTT20yl，37°C过夜或56°C2小时，剧烈振荡，100 °C加热I Omin，剧烈振荡，lOOOOr-minlOmin，取上清液进行检测扩增； (6)骨、指甲:同血液DNA提取，骨和指甲的消化时间延长至3天到I周，蛋白酶K用量为25μ I (20mg/ml)左右，消化时加入适量39mM DTT ； (7)污染检材DNA提取:检材用TES液洗涤1-2次后以酚-二氯甲烷法提取DNA，提取的DNA经无水乙醇、3M氯化钠涫淀后再加入TES、10mg/ml PK、10%SDS进行二次消化，再以酚-二氯甲烷法提取DNA。
【文档编号】C12N15/10GK105821031SQ201610031013
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年1月18日
【发明人】聂胜洁, 胡利平, 顾涛, 张秀峰, 聂爱婷, 饶旼, 王尚文, 杜雷, 刘建兴
【申请人】昆明医科大学