免疫毒素的表达和纯化方法

免疫毒素的表达和纯化方法
【专利摘要】一种在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达免疫毒素的方法，包括：a)在包含蛋白的酶消化产物和酵母提取物的生长培养基中培养可表达免疫毒素的巴斯德毕赤酵母；b)对巴斯德毕赤酵母进行甲醇诱导，其中甲醇诱导的温度在约17.5℃以下。
【专利说明】免疫毒素的表达和纯化方法
[0001] 本申请为分案申请，其原申请的申请日为2004年8月2日，申请号为 201110263529. 9,名称为"免疫毒素的表达和纯化方法"。
[0002] 本申请要求2003年8月1日提交的美国临时申请60/491，923的权益。美国政府 对该申请拥有一定权利。
[0003] 发明背景

【技术领域】：
[0004] 本发明一般而言涉及蛋白表达和纯化方法，更具体地说，涉及免疫毒素的表达和 纯化方法。

【背景技术】：
[0005] 美国每年进行的器官移植手术约有24, 000例，主要包括肾脏移植（14, 000例）、 肝脏移植（5, 000例）、心脏移植（2, 200例），以及少量的胰、肺、心一肺和肠移植（2002年 0PTN/SRTR年度报告）。
[0006] 移植耐受仍然是患者和医生难以企及的目标，他们期望成功地实现异源器官移植 而无需坚持使用无限期的、非特异性的免疫抑制剂，并免除其带来的副作用。许多此类患者 使用环孢菌素（cyclosporin)、硫唑噪呤（azathioprine)和泼尼松（prednisone),以及多 种其他免疫抑制剂治疗，以诱导或维持免疫抑制。在美国，维持免疫抑制疗法的年均花费约 $11, 000 (Immunosuppressive Drugs Coverage Act, National Kidney Foundation,参见 http://www. kidney, org/general/pubpol/immufact. cfm)。虽然这些药物可有效防止排斥 反应，但免疫抑制疗法的副作用是相当大的。免疫抑制疗法诱导免疫系统的非特异性无应 答。移植接受者易于感染，并有患恶性肿瘤的风险，如以移植后淋巴增生性障碍的形式。移 植免疫生物学的主要目标是开发对器官移植的特异性免疫耐受，而使患者从持续药理免疫 抑制的副作用及其带来的并发症和费用中解脱出来。
[0007] 开发了二价抗T细胞免疫毒素，A-dmDT390-bisFV(G4S)，用于对移植、T细胞白血 病和自体免疫疾病进行耐受诱导。该免疫毒素由白喉毒素的前390个氨基酸残基（DT390) 和来自抗CD3抗体UCHTl的两个成串的抗原结合结构域（sFv)构成，后者负责将该免疫毒 素结合至T细胞受体复合物的CD3e Y亚基。抗CD3e抗体部分使得该免疫毒素能够靶向 特定细胞，而白喉毒素部分可杀死靶细胞。该免疫毒素可用于使至少部分T细胞耗尽，以治 疗或防止T细胞介导的免疫系统疾病或病症。
[0008] 施用抗T细胞免疫毒素提供了一种实现特异性免疫耐受的方法。它可应用于接受 者体内具有稳定移植物功能的新器官移植物，也可用于已经存在的移植物。该免疫毒素可 提供高度特异性免疫抑制，在灵长类中实现移植耐受，而没有非特异性免疫抑制药物、抗淋 巴细胞血清或放射的副作用。将排斥应答抑制到不会减短移植接受者平均寿命的程度，是 本领域的一个目标。
[0009] 甲基营养酵母-巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)已成功用于表达不同来源 的异源蛋白（Gellissen 2000)。作为真核生物，巴斯德毕赤酵母能够进行多种翻译后蛋白 修饰，如蛋白酶解加工、折叠、二硫键形成和糖基化作用。像其他酵母一样，巴斯德毕赤酵母 具有胜过高等真核细胞如中国仓鼠卵巢（CHO)或杆状病毒感染的昆虫细胞表达系统的显 著优点。它易于操控，生长速度快，所需培养基价格低廉。这大大减少了生产时间和费用， 特别在商业规模上更是如此。与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)不同，巴斯德毕赤 酵母并非强发酵酵母，可很容易地培养至> IOOg干细胞/升的极高细胞密度（Siegel et al.，1989)。再加上采用强AOXl启动子驱使外源基因转录，使得巴斯德毕赤酵母成为高水 平异源基因表达的优选系统。AOXl启动子在表达对表达宿主有害的外源蛋白时也具有优 势，因为该启动子在非甲醇生长条件下受到严格调控和高度抑制。可诱导的和严格调控的 AOXl启动子使得巴斯德毕赤酵母菌株（没有任何导致对DT有抗性的突变）可成功地以分 泌形式表达基于DT的免疫毒素（Woo et al.，2002)。然而，如果白喉毒素（DT)的催化区能 够进入胞质溶胶，它对所有的真核细胞来说都是很强的毒素。巴斯德毕赤酵母对这些毒素 本性上是敏感的。
[0010] 现有技术教导了培养巴斯德毕赤酵母的方法。例如，巴斯德毕赤酵母可在发酵 罐中培养。一种巴斯德毕赤酵母的发酵方法包括使用甘油作为最初的碳源，随后进行短 暂的碳饥饿，再使用甲醇作为碳源（Pichia pastoris Fermentation Using a BioFlo IlOBenchtop Fermentor, New Brunswick Scientific)。
[0011] Woo等记载，当在巴斯德毕赤酵母中表达二价抗人抗T细胞免疫毒素 A-dmDT390-bisFv(G4S)时，含1%酪蛋白氨基酸的pH7. 0的缓冲复合物培养基可提供摇瓶 培养的最高表达，加入1至3mM范围的PMSF可提高表达水平。（25Protein Expression and Purification270-82 (2002))。
[0012] Sreekrishna记载，以摇瓶培养巴斯德毕赤酵母，当细胞通入大量空气并在补 充有酵母提取物和胨的PH6.0的缓冲培养基中培养时，可使分泌水平提高（Chapter 16, Industrial Microorganisms:Basic and Applied Molecular Genetics (1993)) 〇 含酵 母氮碱基以及硫酸铵、生物素和甘油的生长培养基，使用磷酸钾以及酵母提取物和胨调节 pH至6.0。诱导培养基含有甲醇代替甘油。
[0013] 与之相比，本发明提供了一种使用巴斯德毕赤酵母制备免疫毒素的改进的方法。 本发明所表达和纯化的免疫毒素可用于诱导免疫耐受的方法中。很有必要提供一种提高免 疫毒素产量的表达和纯化方法。本发明在下文中阐述了此问题以及其他一些问题。


【发明内容】

[0014] 本发明一方面涉及一种在巴斯德毕赤酵母毒素抗性EF-2突变株中表达免疫毒素 的方法，包括：a)在包含蛋白的酶消化产物和酵母提取物的生长培养基中培养巴斯德毕赤 酵母；b)对巴斯德毕赤酵母进行甲醇诱导，诱导过程中添加0. 5至0. 75ml/min (每10L初 始培养基）的限量甲醇，且甲醇诱导的温度在约17. 5°C以下。
[0015] 本发明另一方面涉及一种在巴斯德毕赤酵母中表达免疫毒素的方法，包括：a)在 包含蛋白的酶消化产物和酵母提取物的生长培养基中培养巴斯德毕赤酵母；b)使用含甲 醇和甘油的添加物对巴斯德毕赤酵母进行甲醇诱导，其中巴斯德毕赤酵母与苯甲烷磺酰氟 (phenylmethanesulfonyl fluoride)和氨基酸源相接触，且甲醇诱导的温度在约17. 5°C以 下。
[0016] 本发明再一方面涉及一种纯化非糖基化免疫毒素的方法，包括：a)将含有非糖基 化免疫毒素的溶液装入疏水作用柱（hydrophobic interaction column)中；b)从疏水作 用柱中获得含洗脱剂的第一非糖基化免疫毒素；c)将步骤（b)中获得的含洗脱剂的非糖基 化免疫毒素装入阴离子交换柱中；d)通过使用硼酸钠溶液洗脱非糖基化免疫毒素，从阴离 子交换柱中获得含洗脱剂的第二非糖基化免疫毒素；e)稀释步骤（d)中获得的含洗脱剂的 第二非糖基化免疫毒素，使其中的硼酸钠浓度达到约50mM或更低；f)在阴离子交换柱上浓 缩在步骤（e)中获得的含洗脱剂的稀释的非糖基化免疫毒素；g)从阴离子交换柱获得纯化 的非糖基化免疫毒素。
[0017] 应该理解，上文的一般性叙述和下文的详细叙述均只起示例和解释作用，并不限 制由权利要求书限定的本发明范围。

【专利附图】

【附图说明】
[0018] 附图显示一个或多个本发明的实施方案，并与文字叙述一起解释本发明的原理。
[0019] 图I : (a)真核EF-2中白喉酰胺结构域的保守性以及DT抗性突变。（b)巴斯德毕 赤酵母EF-2中可导致Arg替换Gly 701的核苷酸序列突变。带有下划线的序列为由核苷 酸突变导致的限制酶Sac II位点。见SEQ ID NO: 1-10。
[0020] 图2 :巴斯德毕赤酵母EF-2的5'端序列，显示短内含子（SEQ ID NO: 11 ;mRNA)和 (SEQ ID N0:12;gDNA)。5'剪接位点、分支位点以及3'剪接位点使用下划线标出。EF-2编 码序列使用粗体标出。
[0021] 图3 : (A) (B) (C) (D)巴斯德毕赤酵母EF-2 (SEQ ID NO: 13)的核苷酸序列和推得的 氨基酸序列。核苷酸序列从起始密码子的开端处开始编号。蛋白序列中共有的GTP结合基 序为AHVDHGKST(SEQ ID勵:14)，据推测在体内被￡?-2激酶磷酸化的苏氨酸残基用圆圈标 出，在所有的延长因子中均保守的效应物结构域为DEQERGITIKSTA(SEQ ID N0:15)。白喉酰 胺结构域中22个高度保守的残基使用方框标出。
[0022] 图4 :使用已经体外突变的EF-2的3'序列进行定向突变。突变质粒 pBLURA-A 5' mutEF-2包括四个重要元件：P -内酰胺酶基因（Ampr)、尿啼陡选择标记 (URA3)、3'A0X1转录终止序列（TT)和体外突变的FF-23'序列A5'mutEF-2。
[0023] 图5 :对来自巴斯德毕赤酵母JC308菌株的所选Ura+克隆的PCR产物进行琼脂糖 凝胶电泳。（a)使用引物1和M的PCR产物；(b)使用引物2和w的PCR产物；（c) Sca II 消化的使用引物2和3的PCR产物。
[0024] 图6 :在突变型和野生型巴斯德毕赤酵母菌株中胞质溶胶表达的DT-A链的蛋白质 印迹分析。（a)泳道1?6为使用pPIC3-DtA转化的6个独立mutEF2JC307-8克隆的细胞 提取物，+C:纯化的 A-dmDT390_bisFv。M:SeeBlue plus2 蛋白标记（Invitrogen)。（b)在 两个独立菌落mut-3和mut-5 (分别为mutEF2JC307-8 (3)和（5))，C3和C4培养物中，胞质 溶胶表达的DT-A链。蛋白样本加于4?12% NuPAGE凝胶（Invitrogen)上。
[0025] 图7 :细胞内表达DT-A对带有突变型或野生型EF-2的巴斯德毕赤酵母菌株的存 活的影响。Mut-3 和 Mut 5 分别为 EF-2 突变体 mutEF2JC307-8-DtA(3)和（5)，Mut-3 在胞 质溶胶中表达DT A链，而mut-5并非如此。C3和C4是野生型EF-2菌株，在胞质溶胶中表 达（C4)或不表达DT A链。每一类的第一个柱表示甲醇诱导前的菌落形成单位。每一类的 第二个柱代表甲醇诱导后的菌落形成单位。
[0026] 图 8 :质粒构建示意图。（a)pBLARG-A-dmDT390-bisFv ; (b) pPGAPArg-A-dmDT390-bisFv ; (c)pPGAPHis-A-dmDT390-bisFv。
[0027] 图9 :A-dmDT390-bisFV表达情况的蛋白质印迹分析。培养基（a)和细胞提取物 (b)样本加于 4 ?12% NuPAGE 凝胶（Invitrogen)上。+c 泳道为纯化的 A-dmDT390_bisFv。 泳道1?9是使用2拷贝A-dmDT390-bisFv基因转化的mut EF2JC303中，所选的9个克隆 样本。泳道10、11和12是单拷贝克隆样本：泳道12为非突变型EF-2克隆JHW#2,泳道10 和11是两个选出的mutEF2JC307-8(l)和mutEF2JC307-8(2)克隆，后者也称为YYL#8-2。
[0028] 图10:比较不同巴斯德毕赤酵母菌株的甲醇消耗速率。所有这些菌株均为 Mut+(甲醇利用增加），除了 pJHW#3为MutS(甲醇利用缓慢）。pJHW#2到5和EF-2突变体 YYL#8-2均表达二价免疫毒素A-dmDT390-bisFv。X-33为不表达A-dmDT390-bisFv的野生 型菌株，但使用表达载体转化。
[0029] 图11 :X_33和JW102之间，以及在指定温度下对JW102添加不同营养物之间的甲 醇消耗速率曲线的比较。YE和casa分别代表添加酵母提取物和酪蛋白氨基酸。
[0030] 图12 :降低发酵中的搅拌速度减少免疫毒素聚集体。在高搅拌速度下进行发酵导 致50%以上的分泌免疫毒素在上清液中以无活性的聚集体形式存在。另外，聚集体在诱导 时间内累积。然而，将搅拌速度从SOOrpm降低到400rpm减少了免疫毒素聚集体。免疫毒 素聚集体在诱导时间内水平保持不变。
[0031] 图13 :在30°C、250rpm下，经20小时诱导之后，TWEEN 20?对纯化免疫毒素聚集 的影响。使用纯化免疫毒素，通过搅拌，TWEEN20?可防止聚集体的形成。通过在30°C、 250rpm下诱导20小时，大约50%的纯化免疫毒素聚集。然而，通过搅拌，0. 01 %?0. 04% 的TWEEN 20?可显著减少纯化免疫毒素的聚集。
[0032] 图14 :甲醇诱导的前44小时内湿细胞密度收获量的变化。MeOH，只有甲醇并加入 酪蛋白氨基酸；M:G = 4:1，补充甲醇/甘油混合物并补充酪蛋白氨基酸；YE+MeOH，补充酵 母提取物以及只有甲醇；YE+4:1，补充酵母提取物并补充甲醇/甘油混合物。
[0033] 图15 :根据诱导温度不同，二价免疫毒素的表达水平及其最终纯化产率。A :诱导 温度不同表达水平的变化。B :从甲醇诱导22、44和67小时时所取的1升上清液中所获最 终纯化产率的变化。22小时、44小时和67小时代表甲醇诱导时间。C :诱导温度不同甲醇 消耗量的变化。
[0034] 图16 :优化的发酵批次的代表。在所示时间点取的样本在4?20% SDS-tris-甘 氨酸凝胶上分级，并且该凝胶使用考马斯蓝染色。箭头表示二价免疫毒素的位置。使用Mark 12 标记（Invitrogen) 〇
[0035] 图17 :通过butyl 650M捕捉步骤获得的蛋白的SDS-PAGE电泳分析。泳道1?4,样 本流过组分#1?#4 ;泳道5,汇集的样本流过组分；泳道6?8,洗涤组分#1?#3 ;泳道9， 汇集的洗漆组分；泳道1〇、11、17,上清液；泳道12, Mark 12蛋白标准样本（Invitrogen); 泳道13?15,洗脱组分#1?#3 ;泳道16,汇集的洗脱组分。IT，免疫毒素。
[0036] 图18 :通过Poros 50HQ硼酸盐阴离子交换步骤获得的蛋白的SDS-PAGE电泳分 析。泳道1，Mark 12蛋白标准样本（Invitrogen);泳道2,从Butyl 650M HIC步骤获得的 样本；泳道3?7,样本流过组分#1?#5 ;泳道8,使用25mM溶于缓冲液B的硼酸盐洗脱的 组分#1 ;泳道9,使用50mM溶于缓冲液B的硼酸盐洗脱的组分#2 ;泳道10,使用75mM溶于 缓冲液B的硼酸盐洗脱的组分#3 ;泳道11，使用IOOmM溶于缓冲液B的硼酸盐洗脱的组分 #4 ;泳道12,使用IM溶于缓冲液B的NaCl洗脱的组分#5 ;IT，免疫毒素。
[0037] 图19 :纯化免疫毒素的分析凝胶过滤和SDS-PAGE电泳分析。A :Superdex 200 10/300 GL凝胶过滤色谱图。B :考马斯染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶图谱。
[0038] 图 20 : (a) (b) (c)Ala-dmDT390-bisFv(UCHTl)的氨基酸序列（SEQ ID NO: 16)。
[0039] 图21 :甲醇诱导过程中的细胞生长、甲醇消耗和免疫毒素分泌曲线比较。组A : X-33菌株和产生免疫毒素的毒素抗性EF-2突变体mutEF2JC307-8 (2)。这两个菌株在甲醇 诱导过程中具有相似的甲醇消耗速率和湿细胞密度增长曲线。组A中所示数据来自X-33。 对于毒素抗性突变体，在甲醇诱导44h时，最大甲醇消耗速率和湿细胞密度增长分别为 2. 2ml/min和9. 17%。组B-F:菌株JW102。在所有组A-F中的恒定条件是在诱导之前的甘 油分批阶段，并继之以甘油补料分批阶段。对于诱导，仅使用纯甲醇（MeOH)或者使用4:1 甲醇：甘油（M/G)混合补料。诱导过程中持续注入溶于甲醇的IOmM的PMSF。当不添加酵 母提取物（YE)时则添加酪蛋白氨基酸。诱导条件：组A，添加M/G，不添加YE;组B，添加甲 醇，不添加YE ;组C，添加甲醇，添加YE ;组D，添加M/G，添加YE ;组E，添加M/G，不添加YE ; 组F，添加M/G，添加YE。诱导温度，A-E为23?25°C，F为15°C (注意组F的右侧轴与其 他组相比压缩2倍）。甲醇消耗速率（ml/min)，虚线；湿细胞密度（％，w/v)，实线；分泌免 疫毒素水平（mg/L)，短划线。因为在IOL生物反应器发酵中有大量的工作，所以重复组A-E 的结果是不切实际的。优化方法组F进行了 3次，点为平均值，当均值的标准差超过10%时 在图中表示出来。湿细胞密度和分泌免疫毒素水平的准确数据点显示为方块和圆圈。因为 每分钟测量一次甲醇消耗速率，所以省略了甲醇消耗速率的准确数据点。
[0040] 图22 :蛋白降解和免疫毒素生产。A :在补充甲醇和酵母提取物的培养物（图21C) 中，甲醇诱导过程中免疫毒素水平的时程。免疫毒素条带使用IT和箭头标出。B :对等体 积的纯化免疫毒素QSOyg/ml)与等体积的在甲醇诱导后所示时间收集的上清液，在培育 (28 °C，20h，250rpm摇动）后通过SDS-PAGE对残留免疫毒素进行分析。等体积纯化免疫毒 素和PBS缓冲液的混合物，或者来自Oh的上清液用作对照（CON)。10 ill制备的样本加于 SDS-PAGE，并在非还原条件下在4?20% SDS-tri-甘氨酸凝胶上分级。凝胶使用考马斯蓝 染料染色。使用Mark 12标记（Invitrogen)作为蛋白标记。
[0041] 图23 :温度对生产免疫毒素的影响。在所不诱导时间点（44,50,67h)从不同诱导 温度（15?23°C )批次中取得的样本，在非还原条件下在4?20% SDS-tris-甘氨酸凝胶 上分级。对于所有批次，持续添加酵母提取物和甲醇-甘油补料。凝胶使用考马斯蓝染料 染色。IT-dp表示二价免疫毒素的降解产物。这些降解产物通过蛋白质印迹使用抗DT抗体 和抗（G 4S)3接头抗体识别。抗（G4S)3接头抗体可检测二价免疫毒素和降解产物，因为免疫 毒素包含三个（G 4S)3接头。箭头指向与二价免疫毒素无关的条带。IT表示免疫毒素。使 用Mark 12标记（Invitrogen)作为蛋白标记。
[0042] 图24 :在15°C下的甲醇诱导过程中，对于存在和不存在PMSF的上清液中的蛋白酶 活性进行分析。上清液是在甲醇诱导〇、22、44和67h时，从持续添加酵母提取物和甲醇-甘 油补料处理的发酵批次中取得的。上清液与作为底物的无切口的CRM9 -起培育。培育后， 10 样本在还原条件下在4?20% SDS-tris-甘氨酸凝胶上分级。染色和干燥后，通过 使用NIH成像软件将凝胶数字化并分析无切口 CRM9的条带密度。在甲醇诱导中补充PMSF， 实线；无PMSF，虚线。每个数据点为3个发酵批次的平均值，并带有均值的标准差。

【具体实施方式】
[0043] 在公开和描述本发明的化合物、组合物、物品、装置和/或方法之前，应该理解，除 非另有说明，并不限于特定的合成方法或特定的重组生物技术方法，除非另有说明，并不限 于特定试剂，因其毫无疑问地可有多种变化形式。还应理解，本文所用术语只是出于描述特 定实施方案的目的，而非意在限制。
[0044] 如在说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式的"一"、"一种"和"该"包括复 数指代对象，除非上下文中另外明确指出。因此，例如，提及"一种药物载体"包括两种或更 多种这类载体的混合物等等。
[0045] 本文中范围可以表示为从"大约"一个具体的数值，和/或至"大约"另一个具体 的数值。当表示为这种范围时，另一个实施方案包括从前述的一个具体的数值和/或至前 述的另一个具体的数值。类似地，当通过在前面使用"大约"将数值表示为近似值时，应当 理解的是，该具体的数值构成另一个实施方案。应当进一步理解的是，每个范围的端点在与 另一个端点相关和独立于另一个端点时都是有意义的。还应当理解的是此处公开了许多数 值，且除了数值本身外每一个数值在此还以"大约"该具体数值公开。例如，如果公开了数 值"10"，那么也公开了 "大约10"。还应当理解的是，当公开了一个数值时，也公开了 "小于 或等于该数值"，"大于或等于该数值"以及数值间可能的范围，如本领域技术人员所恰当理 解的。例如，如果公开了数值"10"，也公开了 "小于或等于10"以及"大于或等于10"。还 应理解，在整个本申请中，以多种不同格式提供数据，这些数据代表了端点和起点，以及这 些数据点任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点"10"和特定数据点15,应该理解， 大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15,以及10和15之间的数值也认为已经公 开。
[0046] 在本说明书及其后的权利要求书中，将会提及许多被界定为具有如下含义的术 语：
[0047] "可选的"或"可选地"意即：随后所描述的事件或情况可以发生或不发生，以及该 描述包括其中所述事件或情况发生的例子及其不发生的例子。
[0048] "接触"是指将一种物质置于可与另一种物质发生物理关联的条件下。
[0049] "非糖基化"是指没有糖基化作用，或者使用本领域常规的测定糖基化的方法，检 测不到糖基化作用。因此，非糖基化包括已使糖基化位点发生突变使得糖基化作用不发生， 在不发生糖基化作用的系统中表达，或者在野生状态下不具有糖基化作用位点。
[0050] "装入"柱中是指将样本放在某位置，以使至少一部分样本最终进入柱中由树脂占 据的位置。
[0051] "酶消化"是指使用一种或多种不同的酶将蛋白或肽在肽键处水解。此类酶包括但 不限于胰岛素、糜蛋白酶、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草 杆菌蛋白酶或羧肽酶A。
[0052] "酵母提取物"是指通过对酵母细胞内的蛋白进行蛋白酶解而获得的肽和氨基酸 的制备物。
[0053] "诱导"是指为给定的启动子提供信号，促使给定基因的表达。
[0054] "添加"是指以一定速率提供新鲜培养基或营养物，以至少部分取代被消耗掉的培 养基或营养物。
[0055] "部分"是指可分为多个部分的分子或化合物的一个部分。在本发明中，部分可以 指免疫毒素的毒素部分或抗体部分。
[0056] 本发明中，术语"二价"是指单个组合物能够与两个配体相结合。例如， A-dmDT390-bisFv(G 4S)免疫毒素可结合两个⑶3分子。还应理解，术语"两价"在本领域中 具有相似的含义。在此，术语"二价"和"两价"指相同的性质，可互换使用。
[0057] 本发明提供了一种在巴斯德毕赤酵母变体中表达和纯化变体ADP核糖基化毒 素和毒素融合蛋白的系统。本发明方法具有遵循优质生产规范（Good Manufacturing Practices)的优点。
[0058] 正如广泛使用的情况一样，免疫毒素可选为融合蛋白。免疫毒素可包括白喉毒素 部分。应该理解且涵盖于本文之中的是，本方法可使用其他ADP核糖基化免疫毒素。例如， 特别考虑的是免疫毒素包含绿脓杆菌外毒素A(Psuedomonas exotoxin A)部分的融合蛋 白。毒素部分可为截短型（truncated)部分和/或可包含相对于野生型毒素的变异。免疫 毒素可进一步包括CD3抗体部分或其他抗体部分。还应理解，免疫毒素可包括除CD3抗体以 外的靶向抗体部分。本领域技术人员可根据靶细胞，知道在免疫毒素中使用何种部分。例 如，CD22抗体可用于将免疫毒素融合蛋白引导至B细胞。
[0059] 本发明提供了一种在巴斯德毕赤酵母毒素抗性EF-2突变株中表达免疫毒素的方 法，包括：在包含蛋白的酶消化产物和酵母提取物的生长培养基中培养巴斯德毕赤酵母； 在约17. 5°C以下的温度下进行甲醇诱导。
[0060] 本发明一方面提供了一种在巴斯德毕赤酵母毒素抗性EF-2突变株中表达免疫毒 素的方法，包括：在包含蛋白的酶消化产物和酵母提取物的生长培养基中培养巴斯德毕赤 酵母；对巴斯德毕赤酵母进行甲醇诱导，诱导过程中添加0. 5至0. 75ml/min (每IOL初始培 养基）的限量甲醇，且甲醇诱导的温度在约17. 5°C以下。
[0061] 本发明另一方面提供了一种在巴斯德毕赤酵母中表达免疫毒素的方法，包括：在 包含蛋白（如大豆蛋白）的酶消化产物和酵母提取物的生长培养基中培养巴斯德毕赤酵 母；使用含甲醇和甘油的添加物（如甲醇和甘油的比例为约4:1)对巴斯德毕赤酵母进行甲 醇诱导，其中巴斯德毕赤酵母与苯甲烷磺酰氟和氨基酸源（如酵母提取物）相接触，且甲醇 诱导的温度在约17. 5°C以下。
[0062] 在该表达方法中，将巴斯德毕赤酵母与苯甲烷磺酰氟和氨基酸源接触的操作包 括，将这些细胞与苯甲烷磺酰氟和氨基酸源接触至少2小时，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或 更多的小时数，或者介于其中的任何量。优选地，苯甲烷磺酰氟溶于4:1的甲醇甘油诱导添 加物中，浓度不超过10mM。
[0063] 甲醇诱导温度优选在约17. 5°C以下，更优选约15°C。本方法实践中适于发生甲醇 诱导的其他温度包括 17. 0、16. 5、16. 0、15. 5、14. 5、14. 0、13. 5、13、12. 5、12°C或者介于其中 的任何量。
[0064] 生长培养基是指所选有机体生长所需的任何物质。生长所需的物质包括但不限于 碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、镁、钙、钠、铁、微量元素和有机生长因子。生长培养基中可包括多 种原料以提供所需物质。这些物质包括但不限于单糖，提取物如胨、大豆胨（soytone)、胰 胨（tryptone)、酵母提取物，二氧化碳，维生素，氨基酸，噪呤和啼陡。本发明方法的一个实 例利用了 DIFCO公司生产的大豆的酶消化产物的存在。本发明方法的另一个实例利用了 DIFCO公司生产的酵母提取物的存在。应该理解，可使用生产此类产品的任何厂商（如New England Biosciences)生产的酵母提取物和酶消化产物。
[0065] 在本方法的一个具体的非限制性实例中，生长培养基的组成为约4%甘油，约2% 酵母提取物，约2%大豆蛋白的酶消化产物，约1.34%含有硫酸铵不含氨基酸的酵母氮碱 基，以及约〇. 43% PTMl溶液。生长培养基可选进一步包括消泡剂。更具体地，消泡剂的浓 度为约0. 01 %或更高。例如，消泡剂浓度可为0. 07%，或者约0. 01 %至约0. 07 %之间的任 何量。消泡剂的最佳水平可选择为：使液体一空气界面之上的泡沫层减少至1/2英寸或更 薄所需的最小量。因此，生长培养基的组成可为约4%甘油，约2%酵母提取物，约2%大豆 蛋白的酶消化产物，约1. 34%含有硫酸铵不含氨基酸的酵母氮碱基，约0. 43% PTMl溶液， 以及约0.02 %消泡剂。
[0066] 应该理解，本领域技术人员知道可以改变生长培养基的组成以利于最佳生长。特 别考虑的变化是高于或低于生长培养基中组分百分比最多20%。因此本文公开了一种 生长培养基，其中该生长培养基的组成为约3. 2-4. 8%甘油，约1. 6-2. 4%酵母提取物，约 1. 6-2. 4%大豆蛋白的酶消化产物，约1. 07-1. 61 %含有硫酸铵不含氨基酸的酵母氮碱基， 以及约.34-. 52% PTMl溶液。例如，特别公开了一种培养基，其中该生长培养基的组成为约 3. 6%甘油，约2. 4%酵母提取物，约1.9%大豆蛋白的酶消化产物，约1.43%含有硫酸铵不 含氨基酸的酵母氮碱基，以及约〇. 43% PTMl溶液。
[0067] 在本发明的表达方法中，可选地，生长培养基中溶解氧浓度保持在40%或更高 (如45%、50%、55%、60%或65%)的数值。例如，在本发明中，甲醇诱导开始之前采用添 加甘油批料阶段（glycerol-fed batch phase)以获得高细胞密度。当溶解氧浓度上升到 40%以上时开始添加甘油批料阶段。每当溶解氧上升至40%以上时即添加甘油，直至该水 平降至40%以下。停止添加甘油后溶解氧再次升高时，添加物换为甲醇。溶解氧（DO)水平 升高或达到尖峰说明已耗尽碳源。通常DO尖峰用于显示生长所用的甘油已耗尽，说明应该 转为甲醇诱导阶段。
[0068] 另外，生长阶段可选pH值为约3. 0-4. 0,甲醇诱导阶段pH值为约6. 7-7. 4。例如， 生长阶段PH值为3. 5,甲醇诱导阶段pH值为7. 0。
[0069] 可增加甲醇诱导时间以提高产量。通常的诱导时间包括22h、44h、67h和163h。诱 导可长达12天（288h)。因此，特别考虑的甲醇诱导持续约22h至约12天（288h)。例如， 应该理解，甲醇诱导可持续163h。
[0070] 因而本发明的一个实施方案为一种在巴斯德毕赤酵母中表达免疫毒素的方法，包 括：a)在包含蛋白的酶消化产物和酵母提取物的生长培养基中培养巴斯德毕赤酵母；b) 对巴斯德毕赤酵母进行甲醇诱导，其中所述甲醇诱导包括添加0. 5-0. 75ml/min/10L初始 体积的限量甲醇，其中诱导进行的温度在17. 5°C以下，补充消泡剂至0.07%，搅拌减慢至 400RPM，且其中诱导步骤进行约22至288h之间。
[0071] 更具体地，本发明的一个实施方案包括一种在巴斯德毕赤酵母中表达免疫毒素的 方法，包括：a)在生长培养基中培养可表达免疫毒素的巴斯德毕赤酵母，所述生长培养基 包括约4%甘油，约2%酵母提取物，约2%大豆蛋白的酶消化产物，约1. 34%含有硫酸铵不 含氨基酸的酵母氮碱基，以及约〇. 43% PTMl溶液，其中生长期间pH值约为3. 5,且生长培 养基中溶解氧浓度保持在40%或更高的数值；b)对巴斯德毕赤酵母进行甲醇诱导，其中所 述甲醇诱导包括添加0.5-0.75ml/min/10L初始体积的限量甲醇，其中诱导进行的温度为 15°C，pH值约7. 0,补充消泡剂0. 02%，搅拌减慢至400RPM，且诱导阶段约163h。
[0072] 已经开发了可选择性杀伤人T细胞的二价抗T细胞免疫毒素 A-dmDT390-bisFv(G 4S)，用以治疗T细胞白血病、自体免疫病和移植耐受诱导（美国专利 申请09/573, 797,通过引用纳入本文）。二价抗T细胞免疫毒素A-dmDT390-bisFv (G4S)， 由白喉毒素（DT)的前390个氨基酸残基（DT390)和来自抗CD3抗体UCHTl的两个成串 的抗原结合结构域（sFv)构成。通过引入两个突变已将DT390免疫毒素中的两个N糖基 化位点除去（Liu et al.，2000)，导致生成分子量96.5kDa的非糖蛋白。免疫毒素还可 包括接头分子，用以连接抗体部分与毒素部分。接头（U可为Gly-Ser接头。Gly-Ser 接头可以是但不限于（Gly4Ser)n或（Gly3Ser)n。更具体地说，接头可为（Gly4Ser)3 接头（GGGGSGGGGSGGGGS) (SEQ ID NO: 17)，本文也称为（G4S)，或者（Gly3Ser)4 接头 (6665666566656665)(5￡〇10勵:18)，本文也称为（635)。在一个优选的实施方案中，免疫 毒素包括 A-dmDT390-bisFv (G4S)。
[0073] 免疫毒素对6.0以下的pH水平敏感，这与低pH可诱导DT390部分的易位结构 域（translocation domain)的不可逆构象改变相一致。易位结构域介导DT390的A链以 质子依赖方式从内体或质膜到胞质溶胶的易位。催化型A链在胞质溶胶中通过延长因子 2 (EF-2)的ADP核糖基化负责蛋白合成抑制。这种蛋白合成抑制作用对许多真核细胞具有 毒性。由于阳离子交换色谱法和亲和色谱法需用低PH缓冲液洗脱，所以免疫毒素的pH敏 感性限制了这两种技术的使用。
[0074] 使用毒素抗性真核细胞可克服免疫毒素的毒性问题。然而，筛选和鉴定毒素抗性 真核细胞是一项烦琐、费力、费时的工作。而且，在EF-2突变体CHO细胞表达系统中生产二 价免疫毒素被限制在5mg/L，无法通过选择多基因插入提高其产量。由于这种限制，除三个 例外（12, 20, 25)，所有治疗用途的重组免疫毒素的生产均限于使用大肠杆菌（E. coli)制 备，迫使包含体（6)变性再重新折叠。然而，来自大肠杆菌的二价免疫毒素的多结构域结构 的重新折叠不能有效完成，无法恢复其全部生物活性（25)。还有，二价免疫毒素的多结构域 结构妨碍大肠杆菌的高效生产。因此，现有生产系统的缺点驱使我们试图开发有效的二价 免疫毒素的巴斯德毕赤酵母生产系统。
[0075] 对于二价抗T细胞免疫毒素A-dmDT390-bisFv来说，巴斯德毕赤酵母是良好的表 达系统，这是因为，与原核表达系统相比，它可提供最佳的蛋白折叠，而与哺乳动物细胞表 达相比（CH0细胞），它可提供更高的产量。抗体融合蛋白需要正确的二硫键，酵母的内质 网提供了与真核的抗体制造细胞相似的氧化环境。二价免疫毒素的多结构域结构需要真 核表达系统来正确地折叠这种复杂的蛋白。而免疫毒素一旦表达，多数真核生物对其蛋白 合成抑制作用敏感。然而，一种芽殖酵母--巴斯德毕赤酵母对DT具有一定程度的耐受性 (Neville et al.，1992 ;Woo et al.，2002)，在发酵罐培养中免疫毒素的产量可达40mg/L。 通过遗传工程改造的巴斯德毕赤酵母（JW102,从pJHW#2重新命名（Woo et al.，2002))的 发酵，由分泌途径制备免疫毒素。如实施例41所示，本方法在163h的诱导阶段之后可提供 120mg/l的产量，纯化后的产量为90. 8mg/L (见表6)。
[0076] 在经过基因优化，减少DNA序列中的AT含量之后，在生物反应器内经过24 - 44小时的诱导，受AOXl启动子控制的分泌表达水平可达25 - 30mg/L。巴斯德毕赤酵母 对在胞质溶胶中表达的白喉毒素A链的毒性作用敏感，该链使延长因子2 (EF-2) ADP核糖 基化导致蛋白合成停止。通过分泌途径表达的A-dmDT390-bisFv的毒性可通过诱导后甲 醇消耗水平的不断降低来说明。给细胞提供甘油和甲醇的混合添加物。在胞质溶胶中表 达DT的催化结构域（A链）对巴斯德毕赤酵母来说是致命的。当使用甲醇诱导带有构建 体A-dmDT390-bisFv(UCHTl)的细胞以表达免疫毒素时，24小时后近50%被杀死（Woo et al.，2002)。与之相比，当在具有DT抗性突变的CHO细胞中表达相同的免疫毒素时，没有观 察到毒性作用（Liu, et al.，2000 !Thompson, et al.，2001)。在真核细胞的胞质溶胶中，DT 的催化结构域催化延长因子2(EF-2)的ADP核糖基化，导致蛋白合成抑制和细胞死亡（by protein starvation and or apoptosis, Van Ness et al.，1980 ;Houchins, 2000) 〇 真核 EF-2对这些毒素所致的ADP核糖基化的敏感性在于该蛋白的结构。EF-2是约850个氨基酸 的单条多肽链，由两个结构域组成。N末端G结构域负责结合和水解可促进翻译的GTP，C末 端R(或白喉酰胺）结构域被认为与核糖体相互作用（Kohno et al.，1986;Perentesis et al.，1992)。白喉酰胺结构域（图la)在22残基的区域中包括一个在所有真核生物EF-2中 高度保守的组氨酸残基。该保守性组氨酸经过特别的翻译后修饰变为衍生物白喉酰胺，白 喉酰胺为DT所致ADP核糖基化时的独特靶标（Van Ness et al.，1880)。在酿酒酵母中，可 使该保守性组氨酸发生突变并使用某些其他2个氨基酸替换，可产生对ADP核糖基化具有 抗性的功能性 EF-2(Phan et al.，1993;Kimata and Kohnol994)。然而，其 EF-2 在白喉酰 胺位置发生突变的细胞比表达野生型EF-2的细胞生长缓慢。在CHO细胞中，位于白喉酰胺 C末端一侧第3位置的另一个高度保守的甘氨酸若被精氨酸单一替换，也可阻止白喉酰胺 的形成（Kohno&Uchida, 1987 ;Foley et al.，1992)，生成不可 ADP 核糖基化的 EF-2。该突 变对酿酒酵母EF-2具有相同的效果（Kimata et al.，1993)。与白喉酰胺的突变相比，EF-2 中Gly到Arg的突变不会影响CHO和酿酒酵母的细胞生长（Foley et al.，1992 ;Kimata and Kohno 1994 ；Kimata et al. , 1993)〇
[0077] 为了确定可否通过使巴斯德毕赤酵母对毒素不敏感来实现进一步提高 A-dmDT390-bisFv的表达水平，使巴斯德毕赤酵母的EF-2基因产生突变，701位的Gly变 为Arg，该突变在其他生物体内已经显示可阻止EF-2的ADP核糖基化。EF-2诱变需要克 隆该基因，将带有选择标记URA3的体外突变序列引入基因组中，以及对突变的克隆进行 PCR鉴定。巴斯德毕赤酵母的整个EF-2基因已被克隆和测序。巴斯德毕赤酵母EF-2的编 码序列为2526个核苷酸，编码842个氨基酸。巴斯德毕赤酵母EF-2与酿酒酵母和裂变酵 母（S. pombe)的EF-2长度相同，并分别与两者在氨基酸序列上具有88 %和78%的相同性 (identity)。与这两种酵母相比，巴斯德毕赤酵母只有一个含较短内含子的EF-2基因拷 贝。在弄清EF-2的完整序列之前，曾使用各种方法使巴斯德毕赤酵母发生突变，以获得DT 抗性株。由于缺少有效的筛选方法，所有这些努力都以失败而告终。基于获得的EF-2序 列，构建了靶向巴斯德毕赤酵母EF-2基因的pBLURA- A 5 'mutEF-2，通过同源重组在该基因 中引入Gly 701到Arg的突变。该构建体包括EF-2的3'端1028个核苷酸和营养缺陷标 记URA3,其中EF-2已经体外诱变含有上述的氨基酸替换。还开发了 PCR检测方法，以便在 尿嘧啶筛选之后快速准确地分辨突变克隆。使用构建体pBLURA- A 5' mutEF-2进行的定向 克隆手段使得在巴斯德毕赤酵母EF-2基因的突变体中，约40%的尿嘧啶阳性克隆被发现 含有引入的突变。使用不同的营养缺陷标记培育EF-2突变体，（特别是mutEF2JC308 (ade 1 arg4his4)，mutEF2JC303 (arg4his4)和 mutEF2JC307 (his4))，证实了 EF-2 中 Gly701 至 Arg 的突变使之对胞质溶胶中表达的DT A链产生抗性。
[0078] 当EF-2突变体在AOXl启动子的调控之下用于表达A-dmDT390-bisFv时，与未 突变的表达株JW102相比，在摇瓶中制备该蛋白时并未显示出优势。然而，若在JW102 的最适条件下进行大规模发酵培养，突变株YYL#8-2[MUT2JC307-8(2)]的产量在96小 时内持续提高，达到高于未突变JW102株1. 46倍的水平。至于细胞生长和甲醇消耗 速度，表达A-dmDT390-bisFv的突变株和不表达的野生株是相等的。因此，似乎表达 A-dmDT390-bisFv对突变株没有毒性。EF-2突变体允许在组成型GAP启动子（P mp)的调控 下表达A-dmDT390-bisFv。在摇瓶培养中，由控表达A-dmDT390-bisFv的产量比由 P mxi调控表达要高出约30%。若采用发酵培养，由Pmp调控表达的产量可更为显著地提高， 这是由于发酵可使细胞生长至极高的密度。
[0079] 在巴斯德毕赤酵母表达系统中，使用简单的合成培养基（defined medium)已成功 表达和/或分泌了多种异源蛋白，如疫苗用肉毒菌神经毒素片段（Potter et al.，2000)、 乙型肝炎病毒表面抗原（Hardy et al.，2000)、明胶（Werten et al.，1999)、胶原 (Nokelainen et al.，2001)和胰岛素（Wang et al.，2001)。胞质溶胶中表达DT的催化结 构域导致蛋白合成抑制，使合成培养基中所有细胞死亡，但在天然培养基中不会如此（Liu et al.，2003)。该发现表明，天然培养基在减弱由EF-2的ADP核糖基化导致的蛋白合成抑 制方面起着重要作用。使用摇瓶培养时，在合成培养基中观察到极少量二价免疫毒素生成， 但在天然培养基中没有。已经开发了基于合成培养基的巴斯德毕赤酵母发酵方法，用以表 达异源蛋白，但使用天然培养基以分泌形式表达二价免疫毒素会提高产量。
[0080] 在当前利用巴斯德毕赤酵母大规模制备二价免疫毒素过程中，将诱导温度降至 15°C会显著提高生物活性免疫毒素的分泌量，因而可补偿巴斯德毕赤酵母分泌能力的限 制。另外，使用含酵母提取物的天然培养基明显减弱了免疫毒素对巴斯德毕赤酵母宿主的 毒性作用，进一步提高了免疫毒素的分泌量。
[0081] 通过按如下方式优化巴斯德毕赤酵母的发酵条件，生物反应器培养时的二价免疫 毒素表达水平可比摇瓶培养提高4倍：（1)使用基于大豆蛋白胨（Soytone Peptone)和酵母 提取物的天然培养基，（2)甲醇诱导过程中，使用甲醇/甘油混合添加物（4:1)补充能源， (3)诱导过程中继续添加PMSF和酵母提取物，（4)甲醇诱导过程中将温度降至15°C。甲醇 诱导过程中降低温度可导致分泌量相比23°C时提高2倍。
[0082] 如上所述，生产二价免疫毒素的主要问题是在甲醇诱导阶段甲醇利用量减少。甲 醇利用量减少是由限速酶醇氧化酶（AOXl)的活性降低所致。这相对于从分泌区泄漏或者 从轻度酸性分泌区通过质子依赖的易位，而到达胞质溶胶区的二价免疫毒素所导致的蛋白 合成抑制来说，还是次要的（Arata et al.，2002)。在EF-2基因中具有毒素抗性突变的巴 斯德毕赤酵母菌株中，甲醇利用量不受产生免疫毒素的影响（Liu et al.，2003)，这一事实 说明在菌株JW102中，毒素诱导的ADP核糖基化是AOXl活性降低的原因。然而，AOXl水平 是由合成和降解两方面的平衡来控制的，降解机制可因毒素介导的ADP核糖基化而加强。 出于未知原因，酵母提取物可提高甲醇利用量，但对野生型水平不起作用。另外，低甲醇利 用量会负面影响巴斯德毕赤酵母细胞的生长。这在本方法中，通过在甲醇诱导过程中加入 另一种碳源--甘油，以及持续添加酵母提取物来解决。这两项措施将甲醇利用量提高到 非表达菌株的80%。
[0083] 为了进一步补偿由表达的免疫毒素所致的巴斯德毕赤酵母蛋白合成抑制，采 用使甲醇代谢限速酶-醇氧化酶I (AOXl)具有最大活性的发酵条件（Veenhuis et al.，1983)。既然免疫毒素基因和AOXl基因处于同一强启动子的调控之下，免疫毒素应该 被高水平表达。然而，先前曾观察到，在异源蛋白的分泌中，各种蛋白似乎分别具有最佳分 泌水平。在哺乳动物、昆虫和酵母细胞中，分泌型异源蛋白的超过最佳水平的表达（过表 达）可导致分泌型蛋白产量减少（Bannister and Wittrup, 2000 ;Liebman et al.，1999; Liu et al.，2003 ;Pendse et al.，1992)。为了确定二价免疫毒素在巴斯德毕赤酵母中是 否过表达，在甲醇诱导过程中降低诱导温度。由于在低温下包括蛋白合成在内的大部分细 胞活性均降低，所以降低诱导温度应该降低二价免疫毒素的合成速率。对所导致的任何分 泌变化均作出判断。在较低的诱导温度下，二价免疫毒素的表达水平提高，在17. 5°C时达到 最大值，生物活性的免疫毒素的分泌在15°C时达到最大值,尽管存在甲醇消耗率在15°C时 下降至23°C时的75%这一事实。因为在诱导过程中持续添加PMSF和酵母提取物可有效抑 制上清液中的蛋白酶活性，所以似乎不能用较低诱导温度下蛋白酶活性降低来解释15°C下 二价免疫毒素的分泌水平增加了近2倍。前述的巴斯德毕赤酵母分泌二价免疫毒素的限制 可能实际上反映了在23°C时过表达，在15°C时表达减少，从而实现分泌区内输入和输出的 较好平衡。
[0084] 简单地说，使用巴斯德毕赤酵母（JW102)，在发酵罐中以甲醇作为碳源，在AOXl启 动子的调控下以分泌途径制备免疫毒素。高效制备免疫毒素主要有两大障碍，免疫毒素对 巴斯德毕赤酵母的毒性和巴斯德毕赤酵母分泌免疫毒素的能力限制。对巴斯德毕赤酵母的 毒性导致在合成培养基中进行甲醇诱导的过程中，出现甲醇消耗代谢率下降、细胞生长速 率减缓以及产量极低等。这些问题通过以下手段克服：（1)使用基于大豆蛋白的酶消化产 物（如大豆蛋白胨）和酵母提取物的天然培养基，（2)在甲醇诱导过程中使用甲醇/甘油 混合添加物（4:1)补充能源，（3)甲醇诱导过程中持续添加PMSF和酵母提取物。将诱导温 度降至15°C，与诱导温度23°C时的分泌相比，分泌的免疫毒素产量提高几乎2倍，达40mg/ L (诱导67小时），尽管此时甲醇消耗量下降。另外，使用本方法，以无生物活性的寡聚体形 式存在的免疫毒素部分减少。
[0085] 本发明还提供了一种纯化非糖基化免疫毒素的方法，包括：a)将含有非糖基化免 疫毒素的溶液装入疏水作用柱中；b)从疏水作用柱中获得含洗脱剂的第一非糖基化免疫 毒素；c)将步骤（b)中获得的含洗脱剂的非糖基化免疫毒素装入阴离子交换柱中；d)通过 使用硼酸钠溶液洗脱非糖基化免疫毒素，从阴离子交换柱中获得含洗脱剂的第二非糖基化 免疫毒素；e)稀释步骤（d)中获得的含洗脱剂的第二非糖基化免疫毒素，使其中的硼酸钠 浓度达到约50mM或更低；f)在阴离子交换柱上浓缩在步骤（e)中获得的含洗脱剂的稀释 的非糖基化免疫毒素；g)从阴离子交换柱获得纯化的非糖基化免疫毒素。可选地，本方法 进一步包括在使用硼酸钠溶液洗脱之前，先使用约25mM硼酸钠溶液洗涤阴离子交换柱。被 纯化的非糖基化免疫毒素优选通过本文教导的方法表达。
[0086] 纯化方法的步骤（d)中，硼酸钠溶液浓度在约25mM至约200mM之间，优选在约 75mM至约IOOmM之间。例如，步骤（e)中硼酸钠浓度为约20mM。
[0087] 从巴斯德毕赤酵母上清液中大规模纯化二价抗T细胞免疫毒素 A-dmDT390-bisFv(G4S)时所遇到的主要问题，是存在具有相似电荷、大小和疏水特性的宿 主糖蛋白。这个问题通过采用硼酸盐阴离子色谱来解决。硼酸盐阴离子对碳水化合物具有 亲和性，可使这些结构带有负电荷。硼酸钠浓度在50至IOOmM之间时，非糖基化免疫毒素不 与Poros 50HQ阴离子交换树脂结合，但是糖蛋白，包括与免疫毒素相关的聚集体却可以结 合。通过利用硼酸钠存在时的免疫毒素的这种特性，开发了 3步纯化过程=(I)Butyl 650M 疏水作用色谱，（2)硼酸盐存在下的Poros 50HQ阴离子交换色谱，（3) Q阴离子交换色谱。该 方法具有以下几个优点：（1)相对简单，无渗析或渗滤步骤；（2)重复性好；（3)最终产率超 过50%;(4)最终纯度超过98%。以前，硼酸树脂一直用于从蛋白质中分离糖蛋白。然而， 将硼酸盐阴离子与常规阴离子交换树脂结合可实现从糖蛋白中分离免疫毒素，没有必要根 据优质生产规范准则评估非标准树脂。因此，将硼酸盐阴离子交换色谱用于从巴斯德毕赤 酵母糖蛋白中分离免疫毒素。
[0088] 免疫毒素只有单体形式具有功能活性。然而，从发酵过程中收获的上清液包含免 疫毒素的单体、二聚体和更高的寡聚体形式，以及巴斯德毕赤酵母蛋白。在这些巴斯德毕赤 酵母蛋白之中，一种约45kDa的糖蛋白以二聚体形式（?90kDa)存在。二聚体和更高的寡 聚体形式的免疫毒素可相对容易地使用常规疏水作用色谱和阴离子交换色谱分离。然而， 分离纯单体免疫毒素非常困难，因为45kDa的糖蛋白与单体免疫毒素的大小、疏水性和等 电点非常相似。
[0089] 以前，一直使用固定的苯硼酸树脂从蛋白质中分离糖蛋白（Myohanen et al.，1981 ;Bouritis et al.，1981 ;Williams et al.，1981 ;Zanette et al.，2003)。根据 pH值、糖的存在与否、糖的类型、糖的浓度和缓冲液类型，这些固定树脂可结合并选择性阻 碍糖蛋白。将免疫毒素与45kDa的糖蛋白分离时使用硼酸盐阴离子交换色谱，而不使用固 定苯硼酸亲和色谱，因为苯硼酸树脂的分离能力太差。硼酸盐与具有邻近顺式羟基的糖残 基形成复合物（Boeseken, 1949)，并且这些复合物可逆（Weigel, 1963)。硼酸盐与糖蛋白上 的碳水化合物形成可逆复合物，导致糖蛋白的负电荷增加。该性质使得非糖蛋白和糖蛋白 的分离可以在阴离子交换色谱上进行（Nomoto et al.，1982 ;Nomoto and Inoue, 1983)。
[0090] 在分离免疫毒素与糖蛋白的过程中，硼酸盐阴离子交换色谱和苯硼酸亲和色谱具 有不同的结合特性。在苯硼酸亲和色谱中，糖蛋白以及免疫毒素在低离子强度条件下结合， 它们可使用0 - IOOmM硼酸钠梯度或0 - 50mM山梨糖醇梯度共洗脱，说明免疫毒素通过另 一种机制与至少一种结合的糖蛋白发生物理相互作用，或者与苯硼酸柱发生相互作用。纯 化的二价免疫毒素也可与苯硼酸柱结合，这一事实说明结合通过另一种机制进行。
[0091] 在以前的使用摇瓶培养的纯化方法中，采用包括DEAE阴离子交换色谱和蛋白L亲 和色谱的2步操作过程来纯化免疫毒素（Woo et al.，2002)。然而，在巴斯德毕赤酵母的 高密度发酵罐培养上清液中，含有严重影响阴离子交换树脂能力的物质。另外，蛋白L亲和 步骤需要超大型柱，费用较高，且没有优质生产规范（GMP)认证。因而，需要开发其他方法。 利用Butyl 650M的疏水作用色谱可顺利进行捕捉步骤，但同样，浓缩的巴斯德毕赤酵母糖 蛋白与免疫毒素具有相似的电荷、大小和疏水性。刀豆素A(concanavalin A)亲和树脂有 望可除去糖蛋白，但具有潜在毒性的刀豆素A从树脂上流下，造成对最终产品的不可接受 的污染。
[0092] 阴离子交换柱可以是但不限于阴离子丙烯酸、阴离子琼脂糖、阴离子纤维素、阴离 子葡聚糖或阴离子聚苯乙烯。阴离子交换柱优选Poros HQ 50和Q阴离子交换柱。在本发 明中，通过使用Poros 50HQ硼酸盐交换色谱，可实现免疫毒素单体形式的基本纯化，尽管 洗脱部分的免疫毒素被稀释。因此，随后通过Q阴离子交换色谱进行浓缩步骤。
[0093] 疏水作用柱可以是但不限于Phenyl- SEPHAROSE? CL-4B, Octyl Agarose,Phenyl-Sepharose 6Fast Flow, Phenyl-Agarose, Phenyl-Sepharose 6Fast Flow,Octyl-Sepharose 4Fast Flow, Butyl Sepharose? 4Fast Flow, Octyl Agarose, Ph enyl-Agarose, Hydrophobic chromatography media-monoamino MAA-8, Hexyl-Agarose, D odecyl-Agarose, Hexyl-Agarose, 4-Phenylbutylamine-Agarose,Ethyl-Agarose,Matrix ,Butyl-Agarose, Propyl Agarose, Affinity chromatography media AAF-8, Octyl Agaro se,Butyl-Agarose, Decyl-Agarosej Phenyl-Agarose, Methyl Matrix:Ceramic HyperD F Hydrogel Composite, Octyl Agarose, Trityl-Agarosej Q Sepharose, Ether 650,Phenyl 650, Butyl 650或Hexyl 650。疏水作用柱优选Butyl650M疏水作用柱。
[0094] 这里的硼酸盐阴离子交换色谱可用于纯化巴斯德毕赤酵母表达的其他蛋白。巴斯 德毕赤酵母正越来越多地用作治疗用重组蛋白的表达系统（Cereghino et al.，2002)。由 于巴斯德毕赤酵母和人类的糖基化作用模式具有显著差异，许多这些重组蛋白已经去掉了 其糖基化作用位点。然后这些重组蛋白可使用硼酸盐阴离子交换色谱来纯化。
[0095] 可考虑使用任何缓冲液、流速和柱大小，只要与装在柱上的免疫毒素相比，其可以 成功影响免疫毒素的洗脱，使之处于更加纯净的状态。
[0096] 本发明中使用的免疫毒素包括与抗体部分（靶向部分）相连的突变型毒素部分 (如DT毒素）。可使用的毒素包括但不限于白喉毒素、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素。抗体部 分优选单链（sc)可变区。
[0097] 除非另有说明，本发明实施时将采用分子生物学、微生物学、重组DNA、蛋 白质化学和免疫学领域内的常规技术。这些技术在参考文献中给出详细解释，包括 Sambrook，et al.，MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL第二版（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989) ;DNA CLONING,第 I 和 II 卷，D. N Glover 编著 (IRL Press, 1985) !OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS, M.J. Gait 编著（IRL Press, 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION, B. D. Hames 和 S. J. Higgins 编著（IRL Press,1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION, B.D. Hames 和 S.J. Higgins 编著，（IRL Press, 1984); ANIMAL CELL CULTURE, R. I. Freshney 编著（IRL Press, 1986) ;IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES，K.Mosbach(IRL Press，1986) ;B.Perbal，A PRACTICAL ⑶IDE TO MOLECULAR CLONING, Wiley(1984);系列 METHODS IN ENZYM0L0GY，Academic Press,Inc. ;GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS, J.H. Miller 和 M.P. Calos 编著（Cold Spring Harbor Laboratory,1987) !METHODS IN ENZYM0L0GY，第 154 和 155 卷，分 别由 Wu 和 Grossman 编著，以及 Wu 编著，（Academic Press, 1987)，IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY, R. J. Mayer 和 J. H. Walker 编著（Academic Press London, Harcourt Brace U.S.，1987)，PROTEIN PURIFICATION:PRINCIPLES AND PRACTICE,第 2 版（Springer-Verlag，N.Y. (1987)，和 HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY,第 I-IV卷，D.M. Weir et al.，（Blackwell Scientific Publications, 1986); Kitts et al. , Biotechniques 14:810-817 (1993) ；Munemitsu et al.，Mol. and Cell. Biol.10:5977-5982(1990)。
[0098] 本发明利用了编码含白喉毒素的融合蛋白的核酸，其中该核酸可由酵母细胞表 达。可由酵母表达的核酸包括修饰的天然白喉编码序列。为了促进本发明的核酸由酵母细 胞的表达，对富含A和T核苷酸的核酸区进行修饰，以使其编码的免疫毒素融合蛋白可由酵 母表达。例如，这种修饰使之可由巴斯德毕赤酵母表达。这种修饰设计为可抑制聚腺苷酸 化信号和/或减少RNA转录的提前终止。更具体地说，对天然白喉编码序列的一个或多个 富含AT区进行修饰，减少AT含量。富含AT区包括AT含量至少60%的至少150个连续核 苷酸的区域，或者AT含量至少65%的至少90个连续核苷酸的区域，富含AT区的AT含量优 选降至55 %或更低。富含AT区还包括AT含量至少63 %的至少150个连续核苷酸的区域， 或者AT含量至少68%的至少90个连续核苷酸的区域，富含AT区的AT含量降至55 %或更 低。优选将天然白喉编码序列进一步修饰以编码C末端截短的白喉毒素。而且，优选将天 然白喉编码序列进一步修饰，以在天然白喉毒素氨基末端甘氨酸残基之前编码一个或多个 氨基酸。而且，优选将天然白喉编码序列进一步修饰，以编码a-交配因子信号肽或其一部 分。
[0099] 本发明的免疫毒素可在多种生物体内表达和纯化。这些生物体包括酵母如巴斯 德毕赤酵母或酿酒酵母，细菌如大肠杆菌，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞或杆状病毒 感染的昆虫细胞。使用酵母表达系统（包括，例如酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母）有以下几 个优点。首先，有证据表明，由酵母分泌系统产生的蛋白显示正确的二硫配对（disulfide pairing)。其次，使用酵母表达系统，可进行高效的大规模生产。酿酒酵母前-原-a交 配因子前导区可用于指导酵母的蛋白分泌（Brake，et al. (82))。前-原-a交配因子的 前导区包括信号肽和原-片段，其中原-片段又包括由KEX2基因编码的酵母蛋白酶的识 别序列：该酶在Lys-Arg二肽切割信号序列的羧基一侧将前体蛋白切除。核酸编码序列与 前-原_a交配因子前导区发生框内（in-frame)融合。该构建体可放置于强转录启动子的 调控之下，如醇脱氢酶I启动子、醇氧化酶I启动子、糖分解启动子（glycolytic promoter) 或者半乳糖利用途径启动子。核酸编码序列随后是翻译终止密码子，再后是转录终止信号。 或者，核酸编码序列可与另一条蛋白编码序列（如Sj26或P -半乳糖苷酶）融合，以有利 于融合蛋白通过亲和色谱法纯化。可在用于酵母表达的构建体内插入蛋白酶切割位点，以 便将该融合蛋白的各部分分开。
[0100] 当白喉毒素A链在胞质溶胶区合成而没有分泌信号时，该毒素对酵母是有毒性的 (Parentesis et al.，1988)。该毒素催化活性对EF-2具有特异性，发生于第699位的独特 的翻译后组氨酸残基，该残基在所有真核生物EF-2的保守性氨基酸序列中均有发现。酵母 EF-2中的第701位甘氨酸变为精氨酸残基，可导致对DT产生抗性。
[0101] 在另一个纯化方法中，（Ala) dmDT390-bisFv (UCHTl)在毕赤酵母（Pichia)培养基 中生产，产量在5mg/ml水平，不论是否存在突变型EF-2基因。在以下两方面之间存在极紧 耦合：一方面是a _交配因子信号序列的存在，另一方面是（Ala)dmDT390-bisFv(UCHTl)区 室化，进入分泌途径而远离胞质溶胶区中的EF-2毒素底物，因为胞质溶胶中的一个毒素分 子在24小时内就可以使99%的EF-2失活。利用a-交配因子信号序列在毕赤酵母中生产 (Ala) dmDT390-bisFv (UCHTl)，而非使毕赤酵母产生毒素抗性的突变，已经提供了成功的结 果。另外，酵母产生的毒素（蓖麻毒素A链）和信号序列Kar2的结合可导致生产细胞的死亡 (Simpson et al.，1999(80))。在毕赤酵母中的免疫毒素融合蛋白的基因剂量较高的情况 下，mEF-2有可能对生产具有益处。对生产免疫毒素融合蛋白来说，酵母相对于哺乳动物细 胞的另一个优势为，未经任何处理的酵母即对存在于外部培养基中的水平高达3. 3X KT6M 的白喉毒素具有极高的抗性。显然，酵母荚膜阻止了毒素被逆行运输回胞质溶胶区，而在哺 乳动物细胞和酵母原生质球中会发生此类现象（Chen et al.，1985)。
[0102] 本发明可利用包含编码免疫毒素融合蛋白的核酸的细胞。该细胞可为原核细胞， 包括，例如细菌细胞。更具体地说，细菌细胞可为大肠杆菌细胞。或者，该细胞可为真核细 胞，包括，例如中国仓鼠卵巢（CHO)细胞（包括，例如，如Moehring和Moehring所选择的 DT抗性CHO-KlRE 1.22c细胞系）、骨髓瘤细胞、毕赤酵母细胞或昆虫细胞。可将免疫毒素 融合蛋白编码序列引入中国仓鼠卵巢（CHO)细胞系，例如通过氨甲喋呤抗性编码载体，或 者使用适当的选择标记引入其他细胞系。可通过DNA印迹分析来确定转化细胞中是否存在 载体DNA。可通过RNA印迹分析来确定是否有相应于插入编码序列的RNA产生。已经开发 了许多其他适合的宿主细胞系，包括骨髓瘤细胞系、成纤维细胞系，以及多种肿瘤细胞系如 黑色素瘤细胞系。这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，如复制起点、启动子、增强子， 以及必需的信息处理位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止 子序列。表达控制序列优选来自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头状瘤病毒等的启动 子。含有所研究的核酸片段的载体可通过公知的方法转入宿主细胞中，且这些方法可根据 细胞宿主类型而变化。例如，氯化钙转化通常用于原核细胞，而磷酸钙、DEAE葡聚糖或脂质 体（Iipofectin)介导的转染或者电穿孔可用于其他细胞宿主。
[0103] 用于本发明的核酸可与一个或多个可指导和调控插入核酸的转录的功能元件有 效连接，并且该核酸可被表达。例如，核酸可与细菌或噬菌体启动子有效连接，用于指导核 酸的体外转录。
[0104] 提供了巴斯德毕赤酵母的突变株。该突变株包括在至少一个编码延长因子2 (EF2) 的基因中发生突变。该突变包括在修饰的组氨酸残基白喉酰胺的羧基一侧的两个残基位置 发生Gly到Arg的替换。籍此，可使该突变株产生对于白喉毒素ADP核糖基化毒性作用的 抗性。
[0105] 提供了一种表达白喉毒素蛋白部分的方法。本发明的此方法包括，在可使细胞中 蛋白编码核酸表达的条件下，使用包括毒素蛋白编码核酸的载体转染本发明的突变巴斯德 毕赤酵母细胞。所述条件为用于巴斯德毕赤酵母细胞的条件，且可根据该特定系统优化。
[0106] 抗体部分优选经由抗⑶3途径或其他T细胞表位途径。免疫毒素可为单价，但目 前来讲优选二价抗体部分，因为已经发现二价抗体可增强细胞杀伤能力约15倍。可考虑将 任何数量的化学耦合或重组DNA方法用于生成本发明的免疫毒素。因此，提到融合毒素或 耦合毒素，未必是限制性的。免疫毒素可为重组法制备的融合蛋白。可在重组产生的二价 抗体（靶向部分）和重组产生的突变型毒素部分的特殊位点，通过化学硫醚键连接制备免 疫毒素。免疫毒素的祀向部分可包括人U CH2、ii CH3和ii CH4区，以及来自鼠Ig抗体的VL 和VH区。这些区可来自抗体UCHT1，以使该抗体部分为scUCHTl，它是具有人ii CH2、ii CH3 和UCH4区和如图所示的小鼠可变区的单链CD3抗体。可考虑多种DT突变型毒素部分，包 括例如DT390和DT389,带有多个突变或者以野生型毒素部分的形式。
[0107] 毒素部分保留其毒性功能，以及全部膜易位至胞质溶胶的功能。位于该蛋白的受 体结合区域的结合功能的丧失，可通过减少与非靶细胞的结合来实现减小全身毒性。因此， 该免疫毒素可安全施用。通常由毒素结合功能提供的寻路（routing)功能由靶向抗体抗 CD3来提供。重要的寻路途径有（1)定位于有被小窝进行胞吞作用，（2)从溶酶体寻路中逃 逸，（3)返回质膜。
[0108] 任何以此方式寻路的抗体均可与毒素部分一起发挥作用，而不论该抗体所针对的 表位，只要毒素沿该途径可实现足够的蛋白酶解加工。足够的加工可通过细胞杀伤水平来 确定。
[0109] 作为核内体酸化的结果，受体构型受特定受体的诱导而变化，可导致抗体与 其受体的脱离，这时抗体进入溶酶体途径。这可以通过以下方式避免或控制在最小水 平：将抗体导向质膜附近的相同受体上的外功能区表位（Ruud, et al. (1989) Scand. J. Immunol. 29:299 ；Herz et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:21355) 〇
[0110] 突变型DT毒素部分可为具有和没有点突变或置换的截短型突变体，如DT390、 DT389或DT383,或其他的截短型突变体，以及具有点突变的全长毒素，如DTMl或CRM9 (在 溃疡棒状杆菌（C. ulcerans)中克隆），与DTMl和DT483的scUCHTl融合蛋白，DT390和 DT389,并且已经在大肠杆菌中克隆和表达。抗体部分可为具有本文所详细叙述的寻路和其 他特性的scUCHTl或其他抗CD3或抗T细胞抗体。因此，用于本发明方法的免疫毒素的一 个实例包括融合蛋白免疫毒素UCHTl (或其片段）-DT390。
[0111] 有一条糖基化作用的共有序列（NXS/T(SEQ ID NO: 19))，可将其去除或插入以控 制糖基化作用。糖基化作用存在于所有真核生物中，如巴斯德毕赤酵母。
[0112] 有多种免疫毒素的变体。蛋白变体和衍生物为本领域技术人员所公知，可包括氨 基酸序列修饰。例如，氨基酸序列修饰通常可归入三类中的一类或多类：置换、插入或缺失 变体。插入包括氨基和/或羧基末端融合，以及在序列内部插入单个或多个氨基酸残基。 插入通常为比氨基或羧基末端融合小的插入，例如大约一至四个残基。具免疫原性的融合 蛋白衍生物，例如实施例中所述的，是通过体外交联或者使用编码该融合蛋白的DNA转化 的重组细胞培养，以使足够大的可产生免疫原性的多肽与靶序列融合来制备。缺失的特征 是一个或多个氨基酸残基从蛋白序列中去除。通常在蛋白分子内的任何位点，不超过大约 从2至6个残基缺失。这些变体一般通过将编码该蛋白的DNA中的核苷酸进行定点诱变制 备，由此产生编码该变体的DNA，然后在重组细胞培养中表达。在具有已知序列的DNA中的 预定点造成置换突变的技术已为公知，例如M13引物诱变和PCR诱变。氨基酸置换通常为 单个残基，但可以同时在多个不同位置发生；插入通常为大约1至10个氨基酸残基；缺失 的范围为大约1至30个残基。缺失或插入优选在相邻的一对中发生，即2残基缺失或2残 基插入。置换、缺失、插入或其任意形式的结合可一起实现最终的构建体。突变不可将序列 置于读框之外，优选不产生可导致二级mRNA结构的互补区。置换变体是去掉至少一个残基 并在该位置插入另一个残基形成的变体。该置换一般按照下表进行，被称为保守性置换。
[0113] 氨基酸缩写
[0114]

【权利要求】
1. 一种纯化非糖基化免疫毒素的方法，包括： a) 将含有所述非糖基化免疫毒素的溶液加入疏水作用柱中； b) 从所述疏水作用柱中获得含洗脱剂的第一非糖基化免疫毒素； c) 将步骤（b)中获得的所述含洗脱剂的非糖基化免疫毒素加于阴离子交换柱上； d) 通过使用硼酸钠溶液洗脱所述非糖基化免疫毒素，从所述阴离子交换柱中获得含洗 脱剂的第二非糖基化免疫毒素； e) 将步骤（d)中获得的所述含洗脱剂的第二非糖基化免疫毒素中的硼酸钠浓度稀释 至约50mM或更低； f) 在阴离子交换柱上浓缩在步骤（e)中获得的所述稀释的含洗脱剂的非糖基化免疫 毒素； g) 从阴离子交换柱获得纯化的非糖基化免疫毒素。
2. 根据权利要求1的方法，其中所述非糖基化免疫毒素是在酵母中表达。
3. 根据权利要求2的方法，其中所述酵母为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)。
4. 根据权利要求1的方法，其中所述免疫毒素为融合蛋白。
5. 根据权利要求1的方法，其中所述免疫毒素包括白喉毒素部分。
6. 根据权利要求5的方法，其中所述白喉毒素部分为截短型。
7. 根据权利要求6的方法，其中所述免疫毒素进一步包括CD3抗体部分。
8. 根据权利要求7的方法，其中所述非糖基化免疫毒素包括A-dmDT390-bisFv (G4S)。
9. 根据权利要求1的方法，进一步包括在使用所述硼酸钠溶液进行洗脱之前，使用约 25mM的硼酸钠溶液洗涤所述阴离子交换柱。
10. 根据权利要求1的方法，其中步骤（d)中的所述硼酸钠溶液的浓度在约50mM至约 200mM之间。
11. 根据权利要求10的方法，其中步骤（d)中的所述硼酸钠溶液的浓度在约75mM至约 100mM之间。
12. 根据权利要求1的方法，其中步骤（e)中的硼酸钠的浓度为约20mM。
【文档编号】C07K16/28GK104356241SQ201410643698
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2004年8月2日 优先权日:2003年8月1日
【发明者】D·M·内维尔, J-H·禹, Y-Y·刘 申请人:美国政府（由卫生和人类服务部、国立卫生研究院的部长所代表）