专利名称：具有降低的脂肪酸饱和水平的油和种子的制作方法
具有降低的脂肪酸饱和水平的油和种子本申请为2005年10月7日提交的、发明名称为“在种子中具有“不饱和”或降低饱和水平的脂肪酸的某些植物以及来自种子的油”的PCT申请PCT/US2005/036052的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2007年5月25日，申请号为200580040443. 2。与相关串请的交叉参考本发明要求提交于2004年10月8日的美国临时申请系列号60/617，532的优先权。
背景技术：
植物油已经逐渐取代动物油和脂肪作为饮食脂肪摄入的主要来源。然而，在多数工业国家中饱和脂肪摄入保持在总热量消耗的约15%至20%。在推动更健康的生活方式的努力中，美国农业部(USDA)最近已经推荐饱和脂肪占每日热量摄入的小于10%。为使消费者易于了解，当前由USDA发布的标签指导现在要求总饱和脂肪酸水平低于I. 0g/14g方可获得“低饱和”标签，低于0. 5g/14g方可获得“无饱和”标签。这意味着植物油的饱和脂肪酸含量需要低于7%和3. 5%方可分别获得“低饱和”和“无饱和”标签。由于这些指导的发布，因此对“低饱和”油的消费需求明显增加。迄今为止，满足要求的主要为油菜油以及程度低得多的向日葵油和红花油。无论是植物或动物来源，油的特征主要由碳和氢原子的数目以及脂肪酸链包含的双键的数目和位置决定。来自植物的多数油由不同数量的软脂酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、亚油酸(18:2)和亚麻酸(18:3)脂肪酸组成。习惯上将软脂酸和硬脂酸称为“饱和”，因为其碳链被氢原子饱和，因此不具有双键；它们含有最大可能数目的氢原子。然而，油酸、亚油酸和亚麻酸是其中分别具有1、2和3个双键的18碳脂肪酸链。一般认为油酸是单不饱和脂肪酸，而认为亚油酸和亚麻酸是多不饱和脂肪酸。美国农业部将“无饱和”产品定义为具有少于3. 5% (以重量计)的组合饱和脂肪酸(与脂肪酸总量相比)的产品。不饱和脂肪(单不饱和及多不饱和)是有益的(特别是适量消费时)，而饱和脂肪及反式脂肪则不然。饱和脂肪和反式脂肪提高血中LDL胆固醇水平。膳食胆固醇也提高LDL胆固醇，并且甚至不提高LDL而促进心脏病。因此，建议选择低饱和脂肪、反式脂肪和胆固醇的食品作为健康饮食的一部分。最近的研究已经确定了以高水平单不饱和脂肪酸(特别是油酸)作为主要饮食脂肪组分的健康价值。这些饮食认为可降低由高饱和脂肪酸饮食导致的动脉硬化的发病率。因此存在对具有高单不饱和脂肪酸含量的食用植物油的需求。种子诱变已经用于产生具有不高于4%饱和脂肪酸含量的菜籽油(PCT国际专利申请公布号WO 91/15578)。1985年，超过13%的世界食用油供应产生自油料种子作物物种芸苔，通常称为油菜籽或芥菜。芸苔是第三重要的食用油来源，仅次于大豆和棕榈。由于芸苔能在相对低的温度下萌发和生长，因此它也是可在较冷的农业区种植以及在更温暖的地区作为冬季作物的少数具有经济重要性的食用油料种子作物之一。此外，正更多地考虑将植物油(特别是菜籽油)用于工业应用，因为它们具有提供与合成油或矿物/基于环烷的油相当的性能的潜力，还具有可生物降解这一非常需要的优势。在所有的植物油中，芸苔油具有最低水平的饱和脂肪酸。“芸苔”指油菜籽(芥)，其具有至多为种子脂肪酸总量2% (以重量计)(优选至多0.5% (以重量计)，最优选基本为0% (以重量计))的芥酸(C22:1)，并在压榨后产生每克含有小于30微摩尔脱脂(无油)粉的风干粉。这些类型的油菜籽通过其与该物种中更常规变种相比较的可食性来区分。可以以化学方法进行植物油的修饰。已经使用该方法获得含有少于约3%饱和脂肪酸的沙拉/烹调油(美国专利号4，948，811);油可以通过化学反应形成，或者通过物理分离饱和脂类而形成。一般参考使用“遗传工程”获得具有所需特征的油(参阅第3栏第58行及以下等等)。然而，没有详细公开如何这样修饰任一特定油料种子植物以提供具有 所需特征的植物油。作为替代的，一般通过常规育种技术修饰植物油的脂肪酸组成。这些技术使用现存的种质作为影响脂肪酸组成的天然发生的突变的来源。使用适当的筛选与其后的育种结合来发现和选择这些突变。例如，已经使用这样的方法来降低菜籽油中长链饱和脂肪酸芥酸的含量(Stefansson,B. R. (1983)((High and Low Erucic Acid Rapeseed Oils)),KramerJ. K. G.等编辑；Academic Press,New York ; 144-161页)和提高玉米油中单不饱和脂肪酸油酸的量(美国专利申请系列号07/554，526)。近来，已经尝试通过使用诱变剂增加用以选择所需特征的可用突变。然而，诱变剂一般通过失活或修饰已存在的基因而导致特定功能的丧失或降低来发挥作用。因此通过诱变引入新特征经常依赖于某个现存性状的丧失。此外，通过诱变剂实现所需目的通常是不确定的。使用该方法仅在植物油中获得了少数类型的修饰脂肪酸组成。这种影响脂肪酸组成的“创造性”突变的一个实例是降低菜籽油中多不饱和脂肪酸(特别是亚油酸和亚麻酸)，而同时提高单不饱和脂肪酸油酸(Auld,M.,等，(1992)Crop Sci.出版中)。另一实例是降低菜籽油中的饱和脂肪酸(PCT国际专利申请公布号WO 91/15578)。然而，种子油合成的生物化学是复杂并且尚未完全了解的，可能存在若干机制造成在菜籽油中观察到的脂肪酸组成改变(PCT国际专利申请公布号WO 91/15578)。使用诱变影响这些改变基本上是随机、非特异的。理论上，通过使用遗传工程修饰脂肪酸组成的可能性会允许精确受控地引入特定的所需基因以及失活不需要的特定基因或基因产物。因此，可以向植物中引入完全不依赖于现存基因的新性状，或者可以失活或修饰预选择的基因。然而，有效使用遗传工程修饰脂肪酸组成的一个先决条件是在植物细胞中调节脂肪酸合成和加工的机理的合理的准确模型。美国专利号6，495,738(还可参阅WO 99/50430)显示可以通过在植物细胞内表达真菌软脂酰CoA A-9去饱和酶来改变玉米油和烟草种子的饱和脂肪酸水平。这些蛋白质最可能使软脂酰CoA分子酶酶促去饱和，优选通过移去分子CoA部分的第9和第10个碳原子之间的两个氢原子并添加双键，从而产生棕榈油酰CoA(16:1 A-9)。棕榈油酰CoA最终掺入种子油中，从而降低所述油的总饱和水平。玉米油的总饱和脂肪酸水平(平均约为13. 9% )不符合上文所述当前的标签指导。此外，与大豆、芸苔、向日葵等相比，一般不认为玉米是油料作物。事实上，认为产生并提取自玉米的油是淀粉提取中使用的湿磨方法的副产品。因此，几乎没有兴趣修饰玉米油的饱和水平。公认在油料种子中脂肪酸合成主要发生在质体中，并且新合成的脂肪酸从质体外运至胞质。它们在胞质中用于在内质网中发生甘油三酯的装配。脂肪酸合成的主要产物是软脂酸(16:0)，它似乎可有效延伸成硬脂酸(18:0)。仍然在质体中时，饱和脂肪酸可以接着通过称为A-9去饱和酶的酶去饱和，以引入一个或多个碳-碳双键。特别是硬脂酸可被质体A-9去饱和酶迅速去饱和而获得油酸(18:1)。事实上，软脂酸也可被质体A-9去饱和酶去饱和成棕榈油酸(16:1)，但该脂肪酸在多数植物油中仅以痕量存在(0-0. 2% )。因此，质体中脂肪酸合成的主要产物为软脂酸、硬脂酸和油酸。在多数油中，由于饱和脂肪酸以小得多的比例存在，因此油酸是合成的主要脂肪酸。其后在胞质中质体外植物脂肪酸的去饱和似乎仅限于油酸，它可去饱和成亚酸(18:2)和亚麻酸(18:3)。此外，取决于植物，油酸可以通过延长(至20:1、22:1和/或24:1)或通过加入官能团而进一步进行修饰。接着这些脂肪酸与饱和脂肪酸软脂酸和硬脂酸一起可以装配成甘油三酯。植物A-9去饱和酶是可溶的。它位于质体间质中，使用酯化成ACP (主要是硬脂酰ACP)的新合成脂肪酸作为底物。这与酵母A-9去饱和酶相反，后者位于内质网膜(ER，或微粒体)中，使用酯化成CoA的脂肪酸作为底物，并且使饱和脂肪酸软脂酸和硬脂酸去饱和。美国专利号5，723，595和6，706，950涉及植物去饱和酶。酵母A-9去饱和酶已经从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中分离、克隆并测序(Stukey, J. E.等，J. Biol. Chem. 264 :16537-16544 (1989) ；Stukey, J. E.等，J. Biol.Chem. 265 :20144-20149 (1990))。该基因还已用于在显然过表达的条件下转化同一酵母菌株，引起转化酵母细胞中贮藏脂类累积的提高，所述提高通过使用尼罗红染色甘油三酯的荧光显微术测定(美国专利号5，057，419)。没有对脂肪酸组成进行表征。该参考文献包含对使用来自分离的酵母A-9去饱和酶基因的信息首先从酵母或从其他生物分离其他去饱和酶基因，接着在条件下将这些基因再引入酵母或植物的一般讨论。推测这可以导致高表达，从而修饰产生的油及其脂肪酸组成。其后，报道了将酵母A-9去饱和酶基因引入烟草叶组织(Polashcok，J.等，FASEB J. 5 :A1157(1991))并在该组织中明显表达。此外，该基因在番茄中表达。参阅Wang 等，J.Agric Food Chem. 44 :3399-3402(1996)和 C. Wang 等，Phytochemistry 58 227-232(2001)。尽管在烟草和番茄中报道了某些不饱和物的提高和一些饱和物的降低，但是烟草和马铃薯显然不是油料植物。还将该酵母基因引入了欧洲油菜(Brassica napus)中(参阅美国专利号5，777，201)。尽管报道了软脂酸和硬脂酸(饱和物)的减少以及棕榈油酸和油酸(不饱和物)的增加(参阅该专利实施例7的表Ia和Ib)，但在下文详述章节中将更详细地讨论该参考文献。WO 00/11012和美国专利号6，825，335涉及用于在植物中表达的合成酵母去饱和酶基因，其中该基因包含去饱和酶结构域和cyt b5结构域。这些参考文献的背景章节详细讨论了脂肪酸合成。植物油的性能特征(无论是饮食特征或工业特征)基本由其脂肪酸谱决定，即由油中存在的脂肪酸种类以及每个种类的相对和绝对量决定。尽管已知脂肪酸谱和性能特征之间的若干关系，但有许多仍然未知。尽管如此，植物油中存在的不饱和的类型和数量与其饮食和工业应用都相关。标准芸苔油含有约8-12%的亚麻酸，这使其就氧化而言(因此也就风味和稳定性而言)处于与大豆油相似的类别。可以以许多方式提高芸苔油的氧化稳定性，例如通过氢化来减少不饱和量、添加抗氧化剂和用具有较好氧化稳定性的油进行调和。例如，用低亚麻酸油(如向日葵)调和芸苔油可降低18:3水平，从而提高油的稳定性。然而，这些处理必然提高油的费用，并且可能具有其他问题，例如氢化可能同时提高饱和脂肪酸的水平和反式不饱和的量，这两者都是饮食应用中所不希望的。高油酸油是可以提供的，但是除了这些溢价油可能增加的费用以外，来自为极高油酸水平育种的作物的植物油可证明不适用于工业用途，因为它们保留了很高水平的多不饱和脂肪酸，主要是亚油酸和/或亚麻酸。这些油对于饮食应用仍然非常有用，包括作为烹调油，但在可见于工业应用的更严格条件下氧化稳定性不足。添加抗氧化剂甚至也不能使这些油达到工业应用所需的氧化稳定性水平，这可能是因为这些油中对氧化极端敏感的亚麻酸水平。
氧化稳定性对于工业应用是很重要的，可在热和压力条件下以及在化学副产物存在下延长润滑剂的寿命。在这些应用中，亚麻酸(以及亚油酸，其程度较低)仍然是弱氧化稳定性的最主要原因。因此需要获得欧洲油菜变种，其具有农业成活力并产生具有足以使其可用于饮食应用的氧化稳定性水平，并且还本身足够稳定或者(取决于确切的应用)对抗氧化剂具有足够的感应性，从而可用于工业应用。欧洲专利申请EP 323753、美国专利号5，840, 946和美国专利号5，638，637涉及具有80-90%油酸含量(以脂肪酸总量的重量计)和不高于2%的芥酸的菜籽油。使用诱变提高油酸含量。’ 946申请的权利要求书进一步规定该油具有不超过2%的芥酸含量和小于3. 5%的a-亚麻酸含量以及不高于7%的硬脂酸和软脂酸形式的饱和脂肪酸含量。这些专利涉及在诱变之后进行选择。美国专利号5，387，758,5, 434，283和5，545，821涉及具有2-4% (以重量计)的硬脂酸和软脂酸组合以及不高于约2% (以重量计)的芥酸含量的菜籽油。使用诱变降低硬脂酸和软脂酸含量。国际申请WO 92/03919 和美国专利号 5，668，299,5, 861，187 和 6，084，157 涉及
具有改变的脂肪酸谱的油菜籽、植物和油。提到了若干这样的谱，其全部预期最高约2%的芥酸含量与约7%至约12%的软脂酸含量、约14%至约20%的亚油酸含量、约0. 8%至约I. 1%的硬脂酸含量、约7%至约9%的a-亚麻酸含量以及某些范围的FDA饱和物的组合。这些专利将饱和脂肪酸和“FDA饱和物”定义为月桂酸(C12:0)、肉豆蘧酸(C14:0)、软脂酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)的总和。国际申请WO 93/06714 和美国专利号 6，270，828、6，562，397、6，680，396 和6，689，409涉及具有降低的硫苷(glucosinolate)(从而具有降低的硫)以及约2%至约7%的a-亚麻酸含量的芸苔油和种子。美国专利号6，169，190涉及来自芸苔种子的油，其具有约71-77%的油脂肪酸含量和少于约3%的亚麻酸含量。还要求了 34-55之间的油酸亚麻酸比。美国专利号6，063，947和5，850，026要求保护得自芸苔种子的油、相关芸苔植物以及产生油的方法，其中油具有高于约80% (约86-89%)的油酸含量、约2%至约6%的亚油酸含量、少于约2. 5% (约1-2% )的a -亚麻酸含量和少于约2% (水解后)的芥酸含量。这些专利涉及种子特异性抑制微粒体油酸去饱和酶(将油酸转化成亚油酸的A-12去饱和酶)和微粒体亚油酸去饱和酶(将亚油酸转化成a-亚麻酸的A-15去饱和酶)的基因表达。美国专利号5，952，544要求保护催化碳15和16间反应的植物质体或微粒体A-15脂肪酸去饱和酶的片段。美国专利号4，627，192和4，743，402涉及向日葵种子和向日葵油，其具有约80-94% (相对于其总脂肪酸含量)的油酸含量，并且亚油酸与油酸的比值小于约0. 09。这些向日葵植物通过常规育种技术得到。WO 2003002751涉及激酶基因等用于改变植物油表型的用途。
不能预计A-9去饱和酶基因显著(并且需要地)影响已经有益的油料种子作物的脂肪酸谱的能力，特别是降低饱和脂肪水平而不对植物和油的其他方面产生不利影响的能力。发明概述本发明提供“无饱和”芸苔油。本发明还部分涉及减少某些植物种子中饱和脂肪酸的方法。令人惊奇地，通过在芸苔(Brassica)中使用A-9去饱和酶基因实现了这些结果。该技术可应用于本文公开的其他植物。本发明包括能产生这些油和种子的植物，优选芸苔。本发明还提供来自所述植物的种子和油，其中特别地，油具有此前未曾得到过的优势特征和脂肪酸谱。本发明还提供植物优化的A-9去饱和酶基因。在一些优选的实施方案中，优选的植物包含本发明△-9去饱和酶基因的至少两个拷贝。令人惊奇地，这些植物产生的种子不显示基因沉默的效应，而是还具有总饱和物水平的令人惊奇的降低。附图
简述图I显示在拟南芥中实现了饱和脂肪酸大于60%的降低。该图概述了单个拟南芥事件的T2和T3种子数据。图2显示来自18个额外转化体的T2拟南芥种子中“饱和物”高达60-70%的降低。该图中展示的数据为表8中显示的数值数据和较早的数值数据的组合。图3显示在Westar芸苔中饱和脂肪超过43%的降低(包括24:0时为50%的降低)。图4A显示来自多种芸苔植物(包括事件36-11. 19)的种子中总饱和物与对照相比的柱形图。图4B和4C显示柱形图中展示的数值数据。图5A显示来自多种芸苔植物(包括事件218-11. 30)的种子中总饱和物与对照相比的柱形图。图5B和5C显示柱形图中展示的数值数据。图6A-F显示来自T3大田试验的半种子数据。图6A和6B明确显示了与空白(转基因分离出植物的事件)和野生型对照(未转化株系)相比，转基因事件中C16:0的降低和C16:l的提高。图6C和6D明确显示了与空白和野生型对照相比，转基因事件中C18:0的降低和C18:1的提高。图6E和6F分别明确显示了与空白和野生型对照相比，转基因事件中C20:0和C22:0的降低。图6G和6H明确显示了与空白和野生型对照相比，转基因事件中C16:0的改变和降低以及C16:1的改变和提高。图61和6J明确显示了与空白和野生型对照相比，转基因事件中C18:0的改变和降低以及C18:1的改变和提高。图6K和6L显示C18:2和C18:3相似的柱形图。图6M进一步展示了与现有的优秀株系Nex 710相比总饱和物的降低。图6N显示了 1000个种子的分布。图7A和7B展示使用实施例16的方案得到的数据。图8和9是用来自实施例19讨论的F3植物的DNA进行的两个凝胶电泳的图片。序列简沭SEQ ID NO : I显示本文使用的植物优化的A-9去饱和酶基因可读框的核酸序列。SEQ ID NO :2显示前面为Kozak序列和BamHI克隆位点(残基1-10)的SEQ IDNO :1的ORF序列以及ORF末端的翻译终止子(残基1379-1381)。SEQ ID NO 3显示用于扩增A-9基因的A-9正向B引物的核酸序列。SEQ ID NO 4显示用于扩增A-9基因的A-9反向B引物的核酸序列。SEQ ID NO 5显示SEQ ID NO 1编码的氨基酸序列。发明详述本发明提供“无饱和”芸苔油。本发明还部分涉及减少某些植物种子中饱和脂肪酸的方法。令人惊奇地，通过在植物(优选油料植物，更优选芸苔(Brassica))中使用A-9去饱和酶基因产生“无饱和”水平的脂肪酸实现了这些结果。本发明包括这些植物，还提供来自所述植物的种子和油，其中油具有此前未曾获得的特别有利的特征和脂肪酸谱。本文不例了构巢曲霉(Aspergillus nidulans)微粒体A _9_CoA去饱和酶基因。这种A -9去饱和酶是膜结合酶，催化16:0-CoA和18:0-CoA至16:1-CoA和18:1-CoA的反应(在A-9位置加入双键)。本发明的意义还在于其他饱和物(如C20:0、C22:0和C24:0)的水平也令人惊奇并有利地降低了，而C16:1和C18:1不饱和物则提高(C18:2和C18:3不提高或几乎不提高，在一些情况下这些相对不稳定的多不饱和物甚至降低)。迄今为止尚不清楚这在已经具有需要的(但不是最优的)脂肪酸谱的芸苔和其他“优良”油料种子作物中是否是良好的酶(包括该基因是否可以足够表达)。(例如，它在玉米中仅得到饱和物10%的降低。)如背景章节中提到的，由于复杂的脂肪酸谱和不同生物和植物的代谢途径及其不同的物理细胞机器，尽管该基因和酶可能在芸苔中有效力，也不能期待该效力是有益的。如背景章节中所讨论的，一种或多种类型所需脂肪酸的提高经常导致其他所需脂肪酸的降低、不需要脂肪酸的提高和农学损失(即对修饰植物的其他完全不利的效应)。令人惊奇地，还可以实践本发明而不对其他有价值的农学特征，如种荚大小、种子产量、种子大小、油产量等产生相应的不利效应。在单个转基因插入片段纯合的植物中没有不利效应。一些双纯合叠加(通过两个转基因事件的杂交产生)显示种荚数和结实率的降低，原因未知。然而表27含有具有与非转基因对照相似的种子产量以及“无饱和”组成的叠加(即显然提高了拷贝数的事件)。去饱和酶之间(甚至是酵母、真菌、植物和动物A-9去饱和酶之间)的差异产生了不可预见性的另一原因。去饱和酶的差异可以部分归结为不同去饱和酶的来源生物细胞结构的差异。上文背景章节中讨论了来自美国专利号5，777，201的酵母去饱和酶。它比本文示例的曲霉去饱和酶更长(510个氨基酸对455个氨基酸)。此外，它仅在约400个氨基酸上具有约52%的同一性(通过BLAST和BestFit (Smith-Waterman程序)确定，都用EMBOSS完成)。该专利实施例7的表Ia和Ib显示使用酵母去饱和酶实现的饱和物降低远弱于根据本发明在芸苔中使用示例的曲霉去饱和酶实现的降低。有多种因素可能解释酵母去饱和酶相对弱的性能。例如，该蛋白可能在植物中内在地不稳定(而本发明去饱和酶很显然在芸苔中非常稳定)。在其他酶特性上也可能存在差异，如催化效率、底物亲和力、辅因子亲和力等。与美国专利号5，723，595和6，706, 950的红花去饱和酶相比，红花去饱和酶(396个氨基酸)比本发明示例的曲霉去饱和酶(455个氨基酸)更短。红花去饱和酶还可见于质体，而本发明曲霉去饱和酶见于ER/微粒体/胞质隔室。此外,红花去饱和酶使用见于质体的酰基ACP底物，而曲霉去饱和酶使用见于胞质隔室的酰基CoA底物。因此，就本发明而言，不了解酰基CoA底物库中的大部分是否可用于曲霉去饱和酶。因此，非常有意义的是，发现本发明的A-9去饱和酶能够获得具有优秀特性(特别是就提高油的食用品质而言)的芸苔植物、种子和来自于它们的油。非常令人惊奇地，在拟南芥中获得了饱和脂肪酸的高于60%的降低，在芸苔中获得了饱和脂肪酸的高于43% 的降低。必须注意到，这是在已经产生任何适当植物的最佳脂肪酸谱之一的植物中获得的。如下文所示并详细讨论的，本发明还用于获得令人惊奇并有利的脂肪酸谱和比例。尽管认为硬脂酸是饱和脂肪酸，但是已经发现其具有降低胆固醇的作用。因此，相对较高的硬脂酸水平可能是有益的。类似的，相对较高水平的花生四烯酸可能是需要的。如本文数据所示，来自本发明种子的油具有有利的这两种脂肪酸谱以及所需水平的如11-十八碳烯酸。本文还显示，在本发明的商品品质植物中，有利水平的这些脂肪酸和/或总饱和物与需要的植物高度、产量和其他有益特征组合存在(与如矮化植物相反)。本文展示了这些本发明植物的示例数据。还应该注意,本发明不仅限于示例的去饱和酶。GENBANK中提供了多种去饱和酶和A-9去饱和酶，可以使用标准方法进行序列比对以观察并比较酶序列的差异。可以根据本发明使用与本文的示例相似的酶。例如，本发明的曲霉去饱和酶具有两个结构域。第一个结构域(大致在分子的氨基端三分之二)为去饱和酶结构域，第二个结构域(大致在分子的C端三分之一)为细胞色素b5结构域。例如，SEQ ID NO :5的残基62-279可以与如脂肪酸去饱和酶gnl I CDD I 25523pfam00487 的残基 4-233 比对。SEQID NO :5 的残基 332-407 可以与 gnl | CDD | 22935pfam00173(细胞色素b5结构域)的残基1_74比对。SEQ ID NO :5的残基17-305可以与脂肪酸去饱和酶gnl IcddI 11113 cog 1398 (ole 1)脂类代谢结构域的残基3-288比对。seqID NO 5的残基301-449可以与gnl | CDD 114396 C0G5274的CYB5 (与脂类代谢相关的细胞色素b)的残基11-163比对。缺乏细胞色素b5的SEQ ID NO :5去饱和酶结构域可以是功能性的，因为这是植物质体去饱和酶的一般结构。也已经公开了假想的微粒体松去饱和酶(L0⑶SAF438199)，其使用可见于胞质隔室的酰基CoA底物，并且缺乏细胞色素b5结构域。还可以将曲霉细胞色素b5结构域与其他生物(甚至是来自植物胞质去饱和酶)的进行交换。如下文详细讨论的，这些结构域或编码一种或两种这些结构域的区段可作为探针用于定义本发明的分子。因此，可根据本发明使用的基因和蛋白质不仅包括具体示例的全长序列，还包括这些序列的部分、区段和/或片段(包括与全长分子相比的内部和/或末端缺失)、其变体、突变体、嵌合体和融合物。用于本发明的蛋白质可以具有替代的氨基酸，只要它们保留本文具体示例的蛋白质的特征性酶活性。“变体”基因具有编码相同蛋白质或与示例蛋白质功能等价的等价蛋白质的核苷酸序列。术语“变体蛋白质”和“等价蛋白质”指具有与示例蛋白质相同或基本相同的生物/功能活性的蛋白质。在本文中使用的“等价”序列指具有改善功能性或不对功能性产生不利影响的氨基酸替换、缺失、添加或插入的序列。该定义还包括保留功能性的片段。保留与示例蛋白相应片段相同或相似功能的片段和其他等价物在本发明的范围内。可以为了多种目的而产生变化如氨基酸替换或添加，例如为了提高(或降低)蛋白质的蛋白酶稳定性(而不明显/显著降低蛋白质的功能性)。可以使用标准技术(例如产生点突变)便利地构建基因的改变。此外，例如美国专利号5，605，793描述了通过在随机断裂后使用DNA再装配产生额外的分子多样性的方法。变体基因可用于产生变体蛋白质，重组宿主可用于产生变体蛋白质。使用这些“基因改组”技术可以构建等价基因和蛋白质，其包含任一本文示例序列的(例如)任意5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60个连续残基(氨基酸或核苷酸)。
可以使用市售的外切核酸酶或内切核酸酶按照标准方法产生全长基因的片段。例如可以使用酶如Bal31或位点定向诱变来系统地从这些基因的末端切除核苷酸。还可以使用多种限制性酶获得编码活性片段的基因。可以使用蛋白质直接获得这些蛋白质的活性片段。可以截短本发明蛋白质而仍然保留功能活性，这在本发明范围内。“截短蛋白质”指可以切割而在切割后仍然显示酶活性的蛋白质的部分。此外，可以使用分子生物学技术产生有效切割的蛋白质，其中通过用限制性内切核酸酶消化或通过本领域技术人员可用的其他技术去除编码所述蛋白质的DNA碱基。截短后，可以在异源系统如大肠杆菌、杆状病毒、基于植物的病毒系统、酵母等中表达所述蛋白质，接着在本文公开的昆虫测定中测定活性。本领域熟知，可以成功地产生截短蛋白质，以使它们保留功能活性，而比完整的全长序列更短。本领域熟知，可以以截短(核心毒素)形式使用B.t.毒素。参阅如Adang等，Gene 36 :289-300(1985), ^Characterizedfull-length and truncated plasmid clonesof the crystal protein of Bacillusthuringiensis subsp kurstaki HD—73 and theirtoxicity to Manduca sexta. ”。存在其他保留杀虫活性的截短蛋白质的实例,包括昆虫保幼激素酯酶(Regents of the University of California 的美国专利号 5，674，485)。本文使用的术语“毒素”还意在包括功能活性截短物。可以通过如使用寡核苷酸探针定义、鉴定和/或获得根据本发明使用的蛋白质和基因。这些探针为可检测的核苷酸序列，所述核苷酸序列由于适当的标记或如国际申请号WO 93/16094所述使其具有固有的荧光性而可被检测。探针(和本发明的多核苷酸)可以是DNA、RNA或PNA。除了腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶⑴和尿嘧啶(U，RNA分子中)之外，本发明的合成探针(和多核苷酸)还可以含有次黄苷(能与全部四种碱基配对的中性碱基，有时用于在合成探针中代替全部四种碱基的混合物)。因此，当本文中提到合成的简并寡核苷酸时一般使用“N”或“n”，“N”或“n”可以是G、A、T、C或次黄苷。本文使用的多义密码子与提交本申请的标准IUPAC命名约定一致(如R为A或G、Y为C或T等)。
如本领域所熟知，如果探针分子与核酸样品杂交，可以合理的假设探针和样品具有显著同源性/相似性/同一性。优选地，首先进行多核苷酸杂交，之后使用本领域所熟知的技术在低、中或高严格条件下进行洗涤，如Keller，G. H.，M. M. Manak(1987) ((DNAProbes)), Press, New York, NY, 169-170页中所述。例如，如文中所述,可以通过首先在室温下用2 X SSC (标准柠檬酸盐溶液)/0. 1% SDS (十二烷基硫酸钠)洗涤15分钟来得到低严格条件。一般进行两次洗涤。可以通过降低盐浓度和/或通过提高温度得到较高的严格性。例如，在上述洗涤之后可以接着在室温下两次用0. 1XSSC/0. 1% SDS洗涤15分钟，然后在55°C用0. 1XSSC/0. 1% SDS接着洗涤30分钟。如本领域技术人员所知，这些温度可以与本文公开的其他杂交和洗涤程序一起使用(例如可以用SSPE代替SSC作为盐使用)。可以通过向445ml水中加入50ml 20XSSC和5ml 10% SDS制备2XSSC/0. 1% SDS。可以通过组合NaCl (175. 3g/0. 150M)、柠檬酸钠(88. 2g/0. 015M)和水并接着用IONNaOH调整pH至7. 0，然后调节体积至I升来制备20XSSC。可以通过将IOg SDS溶解到50ml高压灭菌水中，然后稀释到IOOml来制备10% SDS0探针检测提供了以已知方式测定杂交是否保持的方法。这种探针分析提供了鉴定本发明毒素编码基因的快速方法。可以使用DNA合成仪和标准程序合成本发明用作探针核苷酸片段。这些核苷酸序列还可以用作PCR引物以扩增本发明的基因。与给定的多核苷酸杂交是可用于鉴定、发现和/或定义本发明蛋白质和基因的技术。本文使用的“严格”杂交条件指得到与本文所述条件相同或大致相同程度杂交特异性的条件。通过标准方法可以进行固定在DNA印迹上的DNA与32p标记的基因特异性探针的杂交(参阅如 Maniatis, T.，E. F. Fritsch, J. Sambrook[1982]Molecular Cloning ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。一般在允许检测靶序列的条件下进行杂交和其后的洗涤。对于双链DNA基因探针，在6XSSPE、5XDenhardt溶液、0. I % SDS,0. lmg/ml变性DNA中在DNA杂交体解链温度(Tm)以下20-25°C进行过夜杂交。按下式描述解链温度(Beltz, G. A.，K. A. Jacobs, T. H. Eickbush,P. T. Cherbas 和 F. C. Kafatos[1983]Methods of Enzymology, R. ffu, L. Grossman 和K. Moldave [编辑]Academic Press, New York 100:266-285)Tm = 81. 5°C +16. 6Log[Na+] +0. 41 (G+C% )-0.61(甲酰胺％ )-600/双链体长度(喊基对)一般如下述进行洗涤I)在I X SSPE、0. I % SDS中室温洗涤两次，每次15分钟(低严格洗涤)。2)在0. 2X SSPE、0. 1% SDS中在Tm-20°C洗涤一次15分钟(中度严格洗涤)。对于寡核苷酸探针，在6 X SSPE、5 XDenhardt 溶液、0. I % SDS,0. lmg/ml 变性DNA中在杂交体解链温度(Tm)以下10-20°C进行过夜杂交。按下式确定寡核苷酸探针的 Tm:Tm(°C) =2(T/A 碱基对数目)+4(G/C 碱基对数目)(Suggs，S. V. , T. Miyake,E. H. Kawashime,M. J. Johnson,K. Itakura和R. B. Wallace [1981] ICN-UCLA Symp. Dev. Biol.Using PurifiedGenes, D. D. Brown [编辑],Academic Press, New York, 23 :683-693)。如下述进行洗涤I)在I X SSPE、0. I % SDS中室温15分钟洗涤两次(低严格洗涤)。2)在I X SSPE、0. I % SDS中在杂交温度下洗涤一次15分钟(中度严格洗涤)。
一般可以改变盐和/或温度以改变严格性。对于长度> 70碱基左右的标记DNA片段，可以使用以下条件低I 或 2XSSPE，室温低I 或 2XSSPE，42°C中0. 2X 或 1XSSPE，65°C高0. 1XSSPE，65°C。双链体的形成和稳定性依赖于杂交体两条链间的显著互补性，且如上文所提到的，某种程度的错配是允许的。因此，本发明的探针序列包括所述序列的突变(单个和多个)、缺失、插入及其组合，其中所突变、插入和缺失允许与目的靶多核苷酸形成稳定的杂交体。可以以多种方法在给定的多核苷酸序列中产生突变、插入和缺失，这些方法为本领域普通技术人员所公知。其他方法可能在将来被了解。由于遗传密码的简并性/冗余性，多种不同的DNA序列都可以编码本文公开的氨基酸序列。产生编码相同或基本相同的酶的替代DNA序列在受本领域训练的技术人员的能力范围内。这些变体DNA序列在本发明的范围内。例如，本发明包括I)得自野生型生物的蛋白质；2)由突变产生的变体；3)通过进行保守性氨基酸替换设计的变体；和
4)通过随机断裂并重新组装编码本发明TC蛋白的多种不同序列(DNA改组)产生的变体。参阅如美国专利号5，605，793。编码本发明蛋白质的DNA序列可以是野生型序列、突变体序列或设计用于表达预定蛋白质的合成序列。通过如避免多腺苷酸化信号和使用植物优选的密码子而设计在植物中闻表达的DNA序列是特别有用的。本文示例了某些蛋白质和基因。由于这些蛋白质和基因仅作为示例，因此显然本发明包括具有与示例蛋白质相同或相似功能的变体或等价蛋白质(以及编码其等价物的核苷酸序列)的用途。等价蛋白质与示例酶(或其活性片段)具有氨基酸相似性(和/或同源性)。可以以较窄的同一性和/或相似性范围的方式定义本发明优选的多核苷酸和蛋白质。例如与本文示例或建议的序列相比，酶蛋白的同一性和/或相似性可以是40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。可以使用上文列出的任一数字定义上限和下限。例如，本发明的蛋白质可以定义为例如与示例蛋白具有50-90 %的同一性。除非另有说明，使用如Karlin 和 Altschul (1993)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :5873-5877 中所改良的 Karlin 和 Altschul (1990)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 2264-2268的算法确定本文所使用的两个核酸的序列同一性和/或相似性百分比。这样的算法整合在 Altschul 等(1990)，J. Mol. Biol. 215 :402-410 的 NBLAST 和 XBLAST 程序中。使用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索，评分=100、字宽=12。可以如Altschul等(1997)，Nucl. AcidsRes. 25 :3389-3402 中所述使用 Gapped BLAST。使用 BLAST 和 GappedBLAST 程序时，使用程序(NBLAST和XBLAST)各自的默认参数。参阅NCBI/NIH网站。
使用默认参数，用Vector NTI Suite 8(InforMax, Inc. , North Bethesda, MD,美国A)中的AlignX函数得到用于比较目的的缺口比对。默认参数一般为缺口打开罚分15、缺口延伸罚分6. 66和缺口分离罚分范围8。可以以这种方式或本领域熟知的其他技术比对和比较两种或更多序列。通过分析这些比对可以鉴定本发明多肽中相对保守和非保守的区域。这可用于例如评估通过修饰或替换一个或多个氨基酸残基来改变多肽序列是否预期是可接受的。氨基酸同源性/相似性/同一性一般(但不必然)在蛋白质的决定生物活性的区域中是最高的，或者在与最终决定生物活性的三维构型决定相关的区域中是最高的。考虑到这一点，某些氨基酸替换是可以接受的并预计是可承受的。例如，这些替换可以在对活性非关键的蛋白质区域中。可以使用蛋白质晶体结构分析和基于软件的蛋白质结构建模来鉴定可(使用位点定向诱变、改组等)进行修饰以确实改变蛋白质特性和/或提高功能性的蛋白质区域。还可以改变蛋白质的多种特性和三维特征而不对蛋白质的活性/功能性产生不 利影响。保守性氨基酸替换预期是可以接受的/不对分子的三维构型产生不利影响的。氨基酸可置于如下类别非极性、极性不带电荷、碱性和酸性。只要替换不损害化合物的生物活性，则保守性替换在本发明的范围内，在所述保守性替代中，一种类别的氨基酸被同一类型的另一氨基酸替换。下表提供了属于每一类的氨基酸实例。
权利要求
1.芸苔植物的细胞，其中所述芸苔植物产生具有包含少于3.5%总饱和物和少于80%油酸的油级分的种子，其中所述总饱和物为所有不含双键的脂肪酸的总数。
2.权利要求I的植物细胞，其中所述油级分包含70%至78%的油酸。
3.权利要求I的植物细胞，其中所述油级分包含不高于3%的亚麻酸。
4.权利要求I的植物细胞，其中所述油级分包含70%至78%的油酸和不高于3.5%的亚麻酸。
5.权利要求I的芸苔植物细胞，其中所述油级分具有不高于2.7%的总饱和物。
6.权利要求I的植物的细胞，其中所述植物高度至少为100cm，平均种子重量大于3mg。
7.由权利要求I的芸苔植物细胞所来源的芸苔植物产生的种子的细胞。
8.权利要求7的芸苔种子的细胞，所述种子具有包含不高于2.7%的总饱和物的油级分，其中所述总饱和物为所有不含双键的脂肪酸的总数。
9.由权利要求7的细胞产生的植物的细胞。
10.芸苔油，其包含少于3.5%的总饱和物和少于80%的油酸，其中所述油是在没有饱和脂肪酸水平的化学修饰下从来自相同芸苔植物的至少8个种子获得的。
11.油炸食品组合物，其包含马铃薯材料和根据权利要求10的芸苔油。
12.权利要求10的芸苔油，其具有包含不高于2.7%的总饱和物的油级分。
13.产生油炸食品组合物的方法，其中所述方法包括在根据权要求10的芸苔油中油炸马铃薯材料。
14.权利要求10的油，其中所述油包含70%至78%的油酸。
15.权利要求10的油，其中所述油包含不不高于3%的亚麻酸。
16.权利要求10的油，其中所述油包含70%至78%的油酸和不高于3.5%的亚麻酸。
全文摘要
本发明提供了“无饱和”芸苔油。本发明还提供了可用于产生这些油的种子。产生这些种子的植物也包括在本发明之内。所有这些都通过在芸苔中使用Δ-9去饱和酶基因而令人惊奇地实现。该计数可用于本文公开的其他植物。本发明的油具有迄今为止尚未获得的特别有利的特征和脂肪酸谱。本发明还提供植物优化的Δ-9去饱和酶基因。本发明还提供植物优化的Δ-9去饱和酶基因。在一些优选的实施方案中，优选植物包含至少两个拷贝的本发明Δ-9去饱和酶基因。令人惊奇地，这些植物产生的种子不显示基因沉默效应，而是令人惊奇地具有进一步降低的总饱和物水平。
文档编号A23L1/217GK102978153SQ201210487268
公开日2013年3月20日 申请日期2005年10月7日 优先权日2004年10月8日
发明者M·汤普森, S·莱迪 申请人:美国陶氏益农公司