专利名称：一株产胞外多糖的嗜热链球菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株产胞外多糖的嗜热链球菌及其应用。
背景技术：
乳酸菌胞外多糖(Exopolysaccharides, EPSs)是乳酸菌在生长、代谢过程中分泌到细胞外的黏液多糖或荚膜多糖的总称。上世纪70年代初，微生物多糖作为一个新兴的发酵行业，相继在美国、法国、日本和意大利等国家发展起来。乳酸菌EPS作为一种新型的天然食品添加剂，近几年来以其独特的理化学特性和生物学功能倍受青睐。乳酸菌EPS能够提高菌体对胃肠道表面的非特异性粘附能力，改善肠道菌群和功能，提高机体免疫功能，抗肿瘤等。乳酸菌是食品级有机体，具有重要的工艺学功能，对酸乳、干酪及绝大多数发酵乳制品的流变性质、质构、口感以及风味具有重要的影响。在食品工业中可作为增稠剂、稳定 齐U、乳化剂、起泡剂和凝胶剂，取代或降低工业稳定剂和增稠剂的用量，可进一步发挥产品的成本优势。嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)为革兰氏阳性菌,通常与保加利亚乳杆菌共同用作酸奶的发酵剂。有些嗜热链球菌能够在乳基质中原位产生胞外多糖，这些胞外多糖的量虽然很低，但是其天然的增稠作用能够增加乳制品的粘度；赋予酸乳更强的持水力，从而避免乳清析出；此外，产胞外多糖而产生的持水性增强有助于提高干酪等产品的得率。现在人们更喜欢滑润、粘稠的天然酸乳制品，EPS无需添加其他稳定剂，在低浓度情况下即可改善酸乳产品的品质。随着消费者对纯天然食品的需求，这种发酵剂和酸乳生产方式在明令禁止使用添加剂的一些欧洲国家已被普遍使用。乳酸菌原位发酵产生的胞外多糖可应用于全天然发酵乳品的生产，这将从市场角度拉动乳酸菌胞外多糖的研究。因此，开展产胞外多糖乳酸菌的研究，对于改善乳制品生产力、开发具有特定功能性质的乳酸菌发酵乳制品，具有十分重要的研究意义和经济价值。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株胞外多糖产量高的嗜热链球菌，即嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) TIMR0705-6,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 6646，可用于制备发酵酸乳。所述嗜热链球菌HMR0705-6具有如下生物学特性在M17培养基平板上划线分离，42°C培养48h，菌落(图I)为圆形，凸起，边缘整齐，颜色乳白色，挑取能拉丝，不透明，表面湿润光滑，菌体呈球状(图2)，多排列成长短不一的链状，不产芽孢。过氧化氢酶实验阴性，革兰氏染色阳性，硝酸盐还原实验阴性，无运动性、需氧或兼性厌氧生长，不液化明胶，不产生硫化氢，吲哚实验阴性。在45°C生长良好，15°C不生长。最适生长温度为37-42°C;最高和最低初始生长pH为9. O和4. 0，最适生长初始pH为6. 5-7. O ;在42°C条件下用M17培养液进行培养的延迟期相对较短，培养2小时即进入对数生长期，10小时达到稳定期；产生的胞外多糖在42°C条件下用M17培养液发酵培养30小时达到最高值，为148mg/L (图3)。
本发明的另一个目的是提供一种嗜热链球菌工作发酵剂，其活性成分为所述嗜热链球菌 TIMR0705-6。所述嗜热链球菌工作发酵剂中所述嗜热链球菌TIMR0705-6的含量为IO9—1010cfu/mL,如 109cfu/mL、5 X 109cfu/mL 或 10lclcfu/mL。所述嗜热链球菌发酵剂的制备方法具体如下将所述嗜热链球菌TIMR0705-6接种于M17培养液中，在42°C条件下培养8-10小时进行活化，连续活化两代，获得活化培养液；将所述活化培养液按体积比为(2 — 4): 100的量接种于M17培养液中，在42°C条件下培养8—10小时，4°C条件下6000r/min离心IOmin,将沉淀用无菌乳悬浮。本发明保护所述嗜热链球菌TIMR0705-6和所述嗜热链球菌工作发酵剂在制备发酵食品中的应用。
在上述应用中，所述的发酵食品具体可为发酵酸乳。在上述应用中，所述发酵食品的制备包括如下步骤将权利要求2或3所述嗜热链球菌工作发酵剂和与嗜热链球菌共生的保加利亚乳杆菌发酵剂分别按体积比为(3—
5):100的量加入原料乳中进行发酵，获得滴定酸度以乳酸计为O. 6-0. 7的发酵产物即为所述发酵食品。所述嗜热链球菌工作发酵剂与所述保加利亚乳杆菌发酵剂加入所述原料乳的体积比为1:1。所述与嗜热链球菌共生的保加利亚乳杆菌发酵剂中的保加利亚乳杆菌具体为中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)的保藏编号为6047的德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus);其在所述保加利亚乳杆菌发酵剂中的活菌含量为101Qcfu/mL。本发明还提供一种胞外多糖，所述胞外多糖是按照包括如下步骤的方法制备得到的将所述嗜热链球菌TIMR0705-6进行液体发酵，收集所有发酵液，从所述发酵液中提取胞外多糖。所述液体发酵的温度具体可为42°C，发酵的时间具体可为30小时，所述液体发酵的发酵培养基具体可为M17培养液；所述提取包括如下步骤将所述发酵液煮沸后用三氯乙酸沉淀离心，取上清液用乙醇沉淀，将所述沉淀溶解于水后再用水透析，即获得所述胞外多糖；和/或,所述离心的条件为4°C、10000r/min、离心30min ；和/或，所述三氯乙酸的使用终浓度为40g/L ；和/或，所述乙醇的添加终浓度为体积百分含量75%。本发明保护所述胞外多糖在制备发酵食品中的应用；所述发酵食品具体可为发酵酸乳。本发明所提供的嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)T IMR0705-6在42°C条件下用M17培养液发酵30小时产胞外多糖的量达到最高值，为148mg/L ;在原料乳鲜奶中按体积比为(3—5) : 100的量添加含IO9 — 10lclcfu/mL所述嗜热链球菌I1MR0705-6的工作发酵剂和相同体积的含保加利亚乳杆菌101(lCfU/mL的发酵剂获得的以乳酸计酸度为0. 6-0. 7的发酵酸乳，与对照I (添加不产胞外多糖的嗜热链球菌)和对照2 (添加不产胞外多糖的嗜热链球菌和稳定剂)相比，在冷藏期间(第I天一第28天)，粘度和凝胶强度明显提高，持水力在第21天以后也明显提高。利用本发明所提供的菌株制备发酵酸乳可降低增稠剂和稳定剂的用量，本发明在发酵食品领域具有广阔的应用前景。保藏说明菌种名称嗜热链球菌拉丁名Streptococcusthermophilus菌株编号IlMR0705-6保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称CGMCC
地址北京市朝阳区大屯路保藏日期2012年10月8日保藏中心登记入册编号CGMCC No. 664
图I 为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TIMR0705-6CGMCC No. 6646 的
菌落形态。图2 为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) TIMR0705-6CGMCC No. 6646 的细胞形态(X1000)。图3 为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) TIMR0705-6CGMCC No. 6646 的生长曲线及多糖含量变化曲线。图4为发酵酸乳保藏期间的持水力变化。图5为发酵酸乳保藏期间的粘度变化。图6为发酵酸乳保藏期间的凝胶强度变化。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用培养基的制备方法如下还原脱脂乳培养基(RSM):将脱脂乳粉按照110g/L用水还原制成脱脂乳培养基，115°C灭菌15min，冷却备用。MRS培养基蛋白胨10. Og,牛肉膏10. Og,酵母膏5. Og,柠檬酸铵2. Og,葡萄糖20. Og,吐温801. OmL,乙酸钠5. Og,磷酸氢二钾2. Og,硫酸镁0. 5g,硫酸锰0. 25g,蒸馏水IL0将各成分加入水中加热溶解，调pH6. 6，121°C灭菌15min，冷却备用。纯化增菌培养基(M17培养液)大豆蛋白胨5. 0g，蛋白胨2. 5g，酵母提取物5. Og,酪蛋白胨2. 5g，抗坏血酸0. 5g，牛肉浸膏5. Og, β -甘油磷酸二钠19g，MgSO4 · 7H200. 25g，蒸馏水1L。将各成分加入水中加热溶解，调pH7. 0,121°C灭菌15min，冷却备用。纯化培养基平板(M17培养基平板):上述IL的M17培养液中加入琼脂15g后121 °C灭菌15min，冷却备用。嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)KC5 :文献李达等.西藏灵燕中产胞外多糖嗜热链球菌的分离筛选及其发酵性能测定.食品科学.2011，32 (13) :225-228.公众可从吉林省农业科学院获得。实施例I、嗜热链球菌菌株的分离和鉴定一、菌株的分离本发明从中国传统发酵制品西藏灵菇的微生物群落中分离筛选菌株。将西藏灵菇接种至RSM中，于42°C培养8h至牛乳凝固。取凝乳逐级稀释涂布于M17培养基平板，42°C培养48-72h，待菌落形成后，用接种环或接种针挑取可疑菌落，接种于M17培养液中，置42°C培养8-10h。待分离菌株生长良好后，再次划线接种于M17培养基平板，置42°C培养48-72h。将培养好的单菌落接种M17培养液纯化增菌培养的同时进行涂片，筛选出多株革兰氏阳性、过氧化氢酶实验阴性双球状或链状排列的乳酸球菌。纯化后的菌株接种到M17培养液培养后，加入20%甘油，_80°C冰箱保存备用。
用苯酚硫酸法测定多株纯培养菌种胞外多糖的产量，筛选出一株胞外多糖产量高的菌株，将其命名为TIMR0705-6。二、菌株的鉴定I、形态特征将步骤一分离获得的菌株HMR0705-6在M17培养基平板上划线分离，42°C培养48h，菌株生长良好。其菌落形态如图I所示。菌落为圆形，凸起，边缘整齐，颜色乳白色，挑取能拉丝，不透明，表面湿润光滑。菌体呈球状(图2)，多排列成长短不一的链状，不产芽孢。2、生理生化试验步骤一分离获得的菌株I1MR0705-6为H2O2酶实验阴性，革兰氏染色阳性，硝酸盐还原实验阴性，无运动性、需氧或兼性厌氧生长，不液化明胶，不产生硫化氢，吲哚实验阴性。3、培养特性步骤一分离获得的菌株I1MR0705-6在45°C生长良好，15°C不生长。最适生长温度为37— 42°C ;最高和最低初始生长pH为9. O和4. 0，最适生长初始pH为6. 5-7. O ;菌株TIMR0705-6在42°C条件下用M17培养液进行培养的延迟期相对较短，培养2小时即进入对数生长期，10小时达到稳定期；产生的胞外多糖在42°C条件下用M17培养液发酵培养30小时达到最高值，为148mg/L (图3)。4、糖发酵试验鉴定菌株挑取少许菌株HMR0705-6培养物划线于M17培养基平板是上42°C培养48_72小时。从平板上挑取单菌落，接入API 50CH液体培养基(生物梅里埃中国有限公司，API50CHMedium)中制成菌悬液，接入API 50CH鉴定试剂条(生物梅里埃中国有限公司)，42°C培养48-72小时，记录菌株对49种碳水化合物的发酵结果，将其输入梅里埃公司的鉴定软件API LAB PLUS，反应结果如表I所示。经数据库查询，菌株HMR0705-6与嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)具有99. 9%的相似性，因此，将菌株TIMR0705-6初步鉴定为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。表I.菌株HMR0705-6碳源利用结果
权利要求
1.一株产胞外多糖的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TIMR0705-6,在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 6646。
2.一种嗜热链球菌工作发酵剂，其特征在于所述工作发酵剂的活性成分为权利要求I所述的嗜热链球菌TIMR0705-6。
3.根据权利要求2所述的嗜热链球菌工作发酵剂，其特征在于所述嗜热链球菌工作发酵剂中的所述嗜热链球菌TIMR0705-6的活菌含量为IO9 — 101(lCfu/mL。
4.权利要求I所述嗜热链球菌TIMR0705-6和权利要求2或3所述嗜热链球菌发酵剂在制备发酵食品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的发酵食品为发酵酸乳。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述发酵食品的制备包括如下步骤将 权利要求2或3所述嗜热链球菌工作发酵剂和与嗜热链球菌共生的保加利亚乳杆菌发酵剂分别按体积比为(3 — 5): 100的量加入原料乳中进行发酵，获得滴定酸度以乳酸计为0. 6-0.7的发酵产物即为所述发酵食品。
7.一种胞外多糖，其特征在于所述胞外多糖是按照包括如下步骤的方法制备得到的将权利要求I所述嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TIMR0705_6进行液体发酵，收集所有发酵液，从所述发酵液中提取胞外多糖。
8.根据权利要求8所述的胞外多糖，其特征在于所述提取包括如下步骤将所述发酵液煮沸后用三氯乙酸沉淀离心，取上清液用乙醇沉淀，将所述沉淀溶解于水后再用水透析，即获得所述胞外多糖； 和/或，所述离心的条件为4°C、10000r/min、离心30min ； 和/或，所述三氯乙酸的使用终浓度为40g/L ； 和/或，所述乙醇的添加终浓度为体积百分含量75%。
9.权利要求7或8所述胞外多糖在制备发酵食品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述发酵食品为发酵酸乳。
全文摘要
本发明公开了一株产胞外多糖的嗜热链球菌及其应用。所述嗜热链球菌为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TIMR0705-6，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.6646。该菌株在42℃条件下用M17培养液发酵30小时产胞外多糖达到最高值，为148mg/L；在原料乳鲜奶中按体积百分含量为3—5%添加含109—1010cfu/mL所述嗜热链球菌TIMR0705-6的工作发酵剂和相同体积的含保加利亚乳杆菌1010cfu/mL的发酵剂获得的以乳酸计酸度为0.6—0.7的发酵酸乳，与对照相比，在冷藏期间(第1天—第28天)，粘度和凝胶强度明显提高，持水力在冷藏第21天以后也有明显提高。本发明在发酵食品领域具有广阔的应用前景。
文档编号C12P19/04GK102965318SQ20121048783
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月26日 优先权日2012年11月26日
发明者李盛钰, 李达, 张健, 高磊, 张雪, 赵玉娟, 张莉, 牛春华 申请人:吉林省农业科学院