一种嗜热链球菌胞外多糖及其制备和检测方法

专利名称：一种嗜热链球菌胞外多糖及其制备和检测方法
技术领域：
本发明涉及胞外多糖及其生产方法，更具体说，本发明涉及一种嗜热链球菌胞外多糖，本发明还涉及这种胞外多糖的制备方法及检测方法。
背景技术：
嗜热链球菌为健康人肠道正常菌群，可在人体肠道中生长、繁殖。可直接补充人体正常生理细菌，调整肠道菌群平衡，抑制并清除肠道中对人具有潜在危害的细菌。嗜热链球菌活菌真正对人体起作用的是其乳发酵产物和底物。这些物质进入人体内，可以促进体内有益菌的增殖，抑制有害菌的繁殖，起到整肠及抗菌作用，也正因为如如此，有关嗜热链球菌优良菌株、生理功能及应用等相关研究已成为人类研究的热点。胞外多糖i^xopolysaccharides, EPS)是微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的粘液或荚膜多糖，易与菌体分离，可通过深层发酵实现工业化生产。微生物多糖均有植物多糖不具备的优良性质，他们生产周期短，不受季节、地域和病虫害条件限制，具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景。他们不仅可以作为胶凝剂、成膜剂、保鲜剂、乳化剂等添加剂用于食品和制药中来改善产品的硬度和粘度，而且具有抗氧化、抗衰老以及增强免疫等多种功能。经研究，乳酸菌胞外多糖有免疫调节及抗肿瘤等生物活性，也具有改善酸乳的流变特性，增加酸乳黏度，提高酸乳稳定性的优良特征。一些乳酸菌胞外多糖对人体健康有促进作用，如作为不被消化的食物成分，抗肿瘤、溃疡、免疫调节和降低胆固醇。嗜热链球菌所产胞外多糖为杂型多糖，又称异型多糖，主要由半乳糖、葡萄糖和鼠李糖聚合而成。各种单糖在酶的作用下通过α或β糖苷键连接形成基本重复单元，最后再聚合为不同分子量的多糖。不同菌株所产胞外多糖的组成结构一般会有差异，这也意味着在功能上会有所差别，如β- (I —2)为主链的葡聚糖、甘露糖和半乳聚糖，大都有一定的抑制肿瘤活性而β-(1 — 3)为主链的葡聚糖，含有(I — 6)支链的多糖，有的有抑制肿瘤活性，有的无抑制肿瘤活性或活性不高。近些年来，对胞外多糖的研究逐渐增多，但由于对乳酸菌EPS合成机理研究较少，而EPS的产量又受多种合成因素影响。因此，目前有关胞外多糖的专利报道中多集中在真菌多糖和部分细菌多糖，很少见到乳酸菌胞外多糖的专利。如2004年7月，张俐娜、金勇、陈莉申请中国专利一种真菌胞外多糖复合物的制备及应用，专利申请号为 200410041167. 9，但是也并不是对乳酸菌EPS的系统研究。其次，关于嗜热链球菌的专利文献，多集中在功能性嗜热链球菌菌株的开发利用， 如2003年12月，张柏林、吴荣荣申请中国专利嗜热链球菌酸奶或其他发酵乳干粉发酵齐U，专利申请号为200310107758. 7。而关于嗜热链球菌代谢产物的研究寥寥无几。此外，关于检测胞外多糖相关专利文献中沉淀蛋白方法均用三氯乙酸沉淀法， 透析最低分子量为5000D，但他们明显忽略三滤乙酸能分解胞外多糖和最低分子量能达2000D等问题，因此检测出的EPS含量与实际含量可能有出入。如刘慧等人申请中国专利乳酸乳球菌和嗜热链球菌中胆盐水解酶与胞外多糖的提取方法，专利申请号为200710123108. X。

发明内容
本发明所要解决的问题是弥补现有技术中的不足，提供一种嗜热链球菌胞外多糖，胞外多糖可简称EPS。
本发明的胞外多糖为杂型多糖，是由不同类型的单糖以及其他有机及无机分子组成，它们是由含有3-8个不同残基的重复单位组成。一般杂型多糖的重复单位是N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰半乳糖、海藻糖、核糖、甘露糖组成。目前大学有50多个杂型多糖通过核磁共振光谱进行测定，其中有31个独立结构测定出来。这些结构的刚度、空间重排、摩尔质量大小都可以变化。一般在食品加工的杂型多糖的产品所应用的乳酸菌属有乳杆菌属和链球菌属。然而，若要明确乳酸菌EPS的组成与分子结构，解析EPS结构与功能的关系，探究一定组成和分子结构的EPS与其生理功能的关系，这些均依赖于分离纯化EPS的高效性。本发明的嗜热链球菌EPS中，含有76-81%的酸性EPS和12-16%的中性EPS ;由四种不同分子量的 EPS 组成，分别是 Fl: > 1000 kD、F2:1000-100 kD、F3:100-10 kD 和 F4:
<10 kD,分别占EPS总量的68-71%、18-21%、3-6%和2-11% ;并且所述的胞外多糖EPS中含有4-4. 2%海藻糖、12. 6-13%鼠李糖、9-10%半乳糖、葡萄糖O. 5-0. 7%、30-33%半乳糖胺和 21-22%葡萄糖胺等成分，所述百分数是质量百分数。本发明的嗜热链球菌EPS，通过免疫学分析得出具有提高机体免疫能力的功能，提高免疫能力的EPS主要成分为Fl (> 1000 kD)，呈酸性，本发明中EPS功能明显高于其他文献中所提的现有技术的EPS功能。本发明的嗜热链球菌EPS应用广泛，例如，将总EPS作为原料，添加到乳制品中，添加配比为50mg-300mg/L，所涉及乳制品为发酵乳、乳饮料、发酵果蔬汁、奶酪等系列产品，当然，根据未来市场需求趋势也可应用到冰激凌、乳粉、制剂、胶囊等产品中，或除乳制品外的其他产品中。本发明还提供了一种本发明嗜热链球菌EPS的制备方法，包括如下步骤
(1)将嗜热链球菌{Streptococcusthermophilus) MN-ZLW-002接种到培养基中发酵培养，其中所述的嗜热链球菌{Streptococcus thermophilus) MN-ZLW-002保藏号为CGMCC No. 3817 ;所述的培养基由下述比例的成分组成葡萄糖5g，酵母粉3g，吐温lg，磷酸氢二钾
O.2g，乙酸钠lg，柠檬酸三钠O. 2g，硫酸镁O. 02g,硫酸锰O. 055g,半胱氨酸盐酸盐O. 3g，加水至 IOOOmL ；
(2)将发酵液离心，上清液中添加无水乙醇，离心沉淀，之后利用85%酒精清洗，收集沉淀物质，即为胞外多糖。因此，本发明的嗜热链球菌EPS是通过将嗜热链球菌MN-ZLW-002发酵培养而生产的。本发明中，嗜热链球菌^Streptococcus米自于内蒙古自治区和林格尔县传统发酵乳制品，已于2010年5月7日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为北京市朝阳区北辰西路I号院，中科院微生物研究所)， 保藏号CGMCC No. 3817。本发明用于培养嗜热链球菌MN-ZLW-002的培养基中的碳源和氮源分别为葡萄糖和酵母粉。
培养基由下述比例的成分组成葡萄糖5g，酵母粉3g，吐温lg，磷酸氢二钾O. 2g， 乙酸钠lg，柠檬酸三钠O. 2g，硫酸镁O. 02g,硫酸锰O. 055g,半胱氨酸盐酸盐O. 3g，加水至 1000mL。所述的份数只表示比例关系，实际操作可按此比例放大。培养条件培养温度43°C，培养时间为20_24h，培养的初始pH值6. I。接种比例
2-4% ο发酵液离心分离沉淀离心条件为10000rpm-15000rpm，温度为4 °C，时间为 5-20min,上清液中添加无水乙醇，添加比例为1:2 3，摇匀，离心沉淀EPS，离心条件为 5000rpm-16000rpm，温度为4°C，时间5_ 20min，之后利用85%酒精清洗3次，收集沉淀物质。本发明对EPS的制备提取条件进行优化，使EPS总产量可达到4_5g/L，EPS根据电荷分离产量能达O. 7-4g/L，EPS根据分子量生产产量也将达O. l-3g/L。本发明的方法可提高EPS提取率，具有EPS专有特性、生产成本低，易于工业化生产等特点。此外，本发明还提供本发明嗜热链球菌EPS的检测方法，包括如下步骤
(1)提取10-20g样品，分别添加乙酸锌和亚铁氰化钾各5ml,并用蒸懼水定容至100ml, 放置30min后，过滤去除蛋白沉淀物；
(2)提取过滤溶液3-6ml放置于离心管，添加6-18ml无水乙醇，摇匀，离心沉淀，之后利用85%酒精清洗，收集糖类物质沉淀物质，用分子量为2000-3500、D的透析袋进行透析，得固体EPS ；
(3)对透析后的胞外多糖进行含量测定。在EPS含量的检测当中，由于不可能完全检出真正EPS含量，因此提高EPS含量检测率，使其能较接近实际含量，是必要的。本发明的EPS含量的检测方法，解决了现有技术用于乳制品中EPS含量检测中出现的提取率偏低的问题。本发明的EPS含量的检测方法，使用的蛋白沉淀剂可以有效地沉淀乳蛋白，不损伤EPS。检测乳制品中EPS步骤提取10_20g样品，分别添加乙酸锌和亚铁氰化钾(沉淀蛋白试剂，比其他专利所使用三氯乙酸更适合沉淀蛋白。据分析，三氯乙酸能分解EPS，因此影响提纯结果)各5ml,并用蒸懼水定容至100ml,放置30min后,利用滤纸过滤去除蛋白沉淀物。沉淀蛋白试剂乙酸锌和亚铁氰化钾溶液浓度分别为21. 9%和10. 6%质量百分比。沉淀EPS条件提取过滤溶液3-6ml放置于50ml离心管，添加6_18ml无水乙醇， 摇匀，离心沉淀胞外多糖。其中，离心条件为5000rpm-16000rpm，温度为4°C，时间5-20min， 之后利用85%酒精清洗3次，收集沉淀物质。EPS纯化条件透析袋分子量为2000-3500 D，而现有技术是使用的透析袋分子量下限为5000D，使小分子量多糖流失，导致检测率降低。检测EPS :得出的EPS利用苯酚-硫酸法进行含量测定。本发明的检测方法优化了检测乳制品中EPS实验条件，提高其检出率，具有方法简便，快速、准确、高重复性等特点。


图I显示的是本发明MN-ZLW-002所生产的EPS分离图。图2显示的是0LL1073R-1所生产的EPS分离图。图3显示的是本发明MN-ZLW-002的EPS组成成分。图中，1_海藻糖；2_未知；
3-鼠李糖；4_半乳糖胺；5_葡萄糖胺；6_半乳糖；7_葡萄糖；8_甘露醇；9至14-未知。图4显示的是LAB的EPS组成成分。图中，1_海藻糖；2_鼠李糖；3_半乳糖胺；
4-葡萄糖胺；5-半乳糖；6-葡萄糖；7-甘露醇。图5显示的是本发明MN-ZLW-002 EPS中分离成分对细胞因子的影响。图6显示的RW-9595M EPS和0LL1073R-1EPS中分离成分对细胞因子的影响。 图7显示的是苯酚-硫酸法测定的标准曲线。图8显示的是本发明MN-ZLW-002的生物学特性。
具体实施例方式
I.本发明的嗜热链球菌{Streptococcus thermophilus) MN-ZLW-002的分离鉴定 (I)菌株的筛选
经无菌离心管采集回来的内蒙古自治区和林格尔县传统发酵乳制品，及时移入超净工作台，以无菌枪头吸取25mL，溶解于225mL的生理盐水中，振荡均匀，得到KT1的菌悬液。用移液枪吸取ImL此菌悬液注入9mL的生理盐水管中，得到稀释度为10_2，的菌悬液，厌氧条件下逐级稀释，直到10_6。每个稀释度分别取lmL，接种到M17琼脂培养基中，37°C恒温厌氧培养。培养48h 后取出观察。待菌落形成后，用接种环或接种针挑取菌落，接种于M17液体中，置于37°C条件下，培养24h-48h。待菌株生长良好后，再次划线接种于M17琼脂培养基中，置于37°C条件下，培养24h-48h，仔细观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征。将革兰氏阳性链球菌暂定为嗜热链球菌进一步纯化培养，并采用冷藏_85°C冻结保存或低温真空冷冻保存。将从传统发酵乳制品中分离的链球菌菌株，经生理生化学试验、乳酸旋光性测定等一系列试验分析鉴定，并将鉴定后的菌株分别制成供试菌液。吸取菌悬液，以2%接菌量接种于200mL 12%脱脂乳中。置于43°C条件下进行18 小时过夜培养，在4°C条件下打冷5-8小时，打冷后对各样品进行检测。用流变仪测定各样品的流变特性以及黏度大小；利用苯酚硫酸法测定各样品的胞
外多糖产量。(2)嗜热链球菌的鉴定
分离纯化的嗜热链球菌{Streptococcus thermophilus MN-ZLW-002)经生理生化学特性分析和16SrDNA序列分析的方法鉴定。嗜热链球菌Sirepiococcws thermophilus MN-ZLW-002的生物学特性如附图8所不，嗜热链球菌Streptococcus thermophilus MN-ZLW-002的16SrDNA序列也已测定。2.本发明嗜热链球菌胞外多糖(EPS)的性能鉴定
本发明的嗜热链球菌EPS，其中的酸性和中性EPS的分离鉴定过程是利用离子色谱分离技术从总EPS中分离出酸性EPS和中性EPS，分离条件为利用阴离子交换柱、介质溶液为O. 4M NaCl, 20 mM Tris-HCl缓冲液(pH 8. 6)，分离紫外吸光度为490nm。经测定，本发明嗜热链球菌EPS主要成分为酸性EPS和中性EPS，分离出的酸性EPS占总量的76_81%，约为80% ;中性多糖占总量的12-16%，约为15% ;其他未定性多糖约占总量5% ;而现有技术的胞外多糖，如乳酸菌0LL1073R-1生产EPS中，酸性多糖约60%、中性多糖约40%。本发明的嗜热链球菌EPS，其中的不同分子量EPS的分离鉴定过程是利用膜分离技术本发明的EPS，分离条件分离温度20°C、分离压力O. 5psi。本发明的EPS依据分子量大小又可分为F1、F2、F3、F4等四种，把EPS可分离成四种Fl: > 1000 kD、F2:1000-100 kD、F3:100-10 kD、F4: < 10 kD ;经过分离后得出，四种不同分子量的EPS分别占EPS总量的 68-71%、18-21%、3-6%和 2_11%。本发明的嗜热链球菌EPS，其中组成成分的确定分析过程为利用离子色谱技术， 三氯乙酸分解将总EPS分离出10多种单糖和糖胺组成，试验条件阴离子交换柱PA10、 18mM NaOH溶液为介质、紫外线吸光度180nm。经过对照分析，结果，本发明胞外多糖EPS中含有4-4. 2%海藻糖、12. 6-13%鼠李糖、9-10%半乳糖、O. 5-0. 7%葡萄糖、30-33%半乳糖胺和 21-22%葡萄糖胺的成分，比现有技术研究的EPS组成分多至少多5种成分。3.本发明嗜热链球菌胞外多糖检测方法中的苯酚-硫酸法
苯酚-硫酸法为一现有技术方法，具体是准确称取标准葡萄糖20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取2. 5、5、10、20、40及80 ml，各以蒸馏水补至100ml，浓度分别为 O. 005mg/ml、0. 01mg/ml、0. 02mg/ml、0. 04mg/ml、0. 08mg/ml、0. 16mg/ml,然后加入 6% 苯酚I. Oml及浓硫酸5. 0ml，摇匀放置室温5min后沸水水浴放置15min，冷却，在30min内于 490nm处测定其吸光值，以2. Oml水按 同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。样品含量测定将所得EPS放入10毫升离心管中，再加5ml的10%硫酸溶液稀释， 温度控制在40°C，有利于充分溶解EPS，充分混匀。从以上EPS稀释液中吸取2ml溶液加入 IOml试管,然后加入6%苯酹I. Oml及浓硫酸5. Oml,摇勻冷却室温放置20分钟以后于490nm 测光吸光值。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量(注所用苯酚均为先用现配)。实施例
下列实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。下列实施例中的百分含量， 如无特别说明，均为质量百分含量。本发明中，单位D或Da表示道尔顿(Dalton)，是分子量常用单位，并且IkD=IOOO摩尔质量(I kg/mol)本发明的嗜热链球菌胞外多糖，由于是通过将嗜热链球菌MN-ZLW-002发酵培养而生产的，因此下面实施例中本发明的嗜热链球菌胞外多糖可简称为MN-ZLW-002 EPS。实施例I、利用嗜热链球菌MN-ZLW-002生产本发明的嗜热链球菌胞外多糖(EPS) I.菌株来源
生产菌种嗜热链球菌MN-ZLW-002 (保藏号CGMCC No. 3817);对比菌株标准菌株 203070 (产EPS)(中国微生物保藏中心)。2.生产工艺
1)、培养基制备葡萄糖5g，酵母粉3g，吐温lg，磷酸氢二钾O.2g，乙酸钠lg，柠檬酸三钠O. 2g，硫酸镁O. 02g,硫酸锰O. 055g,半胱氨酸盐酸盐O. 3g，加水至IOOOmL :得MRS液体
培养基；
2)、接种培养将嗜热链球菌MN-ZLW-002和标准菌株203070(产EPS)按照2%比例接种到MRS液体培养基中，培养温度43°C，培养时间为20h，培养的初始pH值6. I ;
3)、总EPS的提取将培养20h后的发酵液中离心取出菌体，离心转速为12000rpm，离心温度为4°C，离心时间为15min;弃沉淀后在培养溶液上清液中添加无水乙醇(分析纯)， 添加比例为1:3，混匀，再离心弃掉上清液，离心转速为lOOOOrpm，离心温度为4°C，离心时间为15min，之后利用85%酒精清洗3次，收集沉淀物质，冷冻干燥即得总EPS，具体生产含量见表I。表I.对比两种菌株生产EPS性能
权利要求
1.一种嗜热链球菌胞外多糖，其特征在于，所述的胞外多糖(EPS)中，含有76-81%的酸性EPS和12-16%的中性EPS;由四种不同分子量的EPS组成，分别是Fl: > IOOOkD,F2:1000-100kD、F3:100-10kD 和 F4 < IOkD,分别占 EPS 总量的 68-71%、18_21%、3_6% 和2-11% ;并且所述的胞外多糖EPS中含有4-4. 2%海藻糖、12. 6-13%鼠李糖、9-10%半乳糖、0. 5-0. 7%葡萄糖、30-33%半乳糖胺和21-22%葡萄糖胺的成分。
2.权利要求I所述的胞外多糖，其特征在于所述的胞外多糖是通过将嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) MN-ZLff-002 发酵培养而生产的。
3.—种权利要求2所述胞外多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)将嗜热链球菌{Streptococcusthermophi lus) MN-ZLW-002接种到培养基中发酵培养，其中所述的嗜热链球菌{Streptococcus thermophi lus) MN-ZLW-002保藏号为CGMCCNo. 3817 ;所述的培养基由下述比例的成分组成葡萄糖5g，酵母粉3g，吐温lg，磷酸氢二钾0. 2g，乙酸钠lg，柠檬酸三钠0. 2g，硫酸镁0. 02g,硫酸锰0. 055g,半胱氨酸盐酸盐0. 3g，加水至 IOOOmL ； (2)将发酵液离心，上清液中添加无水乙醇，离心沉淀，之后利用85%酒精清洗，收集沉淀物质，即为胞外多糖。
4.根据权利要求3的生产方法，其特征在于，步骤(I)中，所述发酵的培养温度43°C，培养时间为20-24h，培养的初始pH值6. I。
5.根据权利要求3的生产方法，其特征在于，步骤(2)中，将发酵液离心，离心条件为10000rpm-15000rpm，温度为4°C，时间为5_20min，上清液中添加无水乙醇，添加比例为1:2 3,摇勻，离心沉淀,离心条件为5000rpm-16000rpm,温度为4°C,时间5_20min,之后利用85%酒精清洗3次，收集沉淀物质。
6.一种权利要求I所述胞外多糖的检测方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)提取10_20g样品，分别添加乙酸锌和亚铁氰化钾各5ml,并用蒸懼水定容至100ml,放置30min后，过滤去除蛋白沉淀物； (2)提取过滤溶液3-6ml放置于离心管，添加6-18ml无水乙醇，摇匀，离心沉淀，之后利用85%酒精清洗，收集糖类物质沉淀物质，用分子量为2000-3500 D的透析袋进行透析，得固体EPS ； (3)对透析后的胞外多糖进行含量测定。
7.根据权利要求6的检测方法，其特征在于，步骤⑴中，所述的沉淀蛋白试剂乙酸锌和亚铁氰化钾溶液浓度分别为21. 9%和10. 6%质量百分比。
8.根据权利要求6的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，离心沉淀，离心条件为5000rpm-16000rpm，温度为4°C，时间5_20min，之后利用85%酒精清洗3次，收集沉淀物质。
9.根据权利要求6的检测方法，其特征在于，步骤⑶中，利用苯酚-硫酸法对胞外多糖的含量进行测定。
全文摘要
本发明公开了一种嗜热链球菌胞外多糖(EPS)，本发明所用的菌种为嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)MN-ZLW-002。本发明对嗜热链球菌MN-ZLW-002发酵产生EPS条件进行了优化，分离获得的EPS含有76-81%的酸性EPS和12-16%的中性EPS；由四种不同分子量的EPS组成；并且含有海藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖胺和葡萄糖胺等成分。具有提高机体免疫能力的功能，明显高于现有技术的EPS功能。本发明还公开了这种胞外多糖的制备方法及检测方法。
文档编号C12R1/46GK102702372SQ20111026161
公开日2012年10月3日 申请日期2011年9月6日 优先权日2010年10月28日
发明者周琦, 孙国庆, 康小红, 张兰威, 张志国, 生庆海, 龄南 申请人:内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司