专利名称：苏云金芽胞杆菌菌株及其伴胞晶体、伴胞晶体提取方法及其在植物线虫病害防治中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物及其在植物保护技术领域中应用，尤其涉及一种苏云金芽胞杆菌及其伴胞晶体以及相应的提取方法和用途。
背景技术：
植物寄生线虫病是农作物的重要病害之一。全球每年由植物寄生线虫所造成的作物损失超过千亿美元，线虫病害已成为农业生产上的一个突出问题。目前，农业生产上常采用化学杀线虫剂来防治植物寄生线虫病害，但现今市场上杀线虫剂的品种有限，大部分为高毒、高残留农药，长期单一地使用高毒、高残留的化学杀线虫剂，不仅对环境造成了严重的污染，也引发了农产品中农药残留超标、线虫抗药性日益突出等系列环境和社会问题。近年来，随着人们对农产品安全的日益关注，化学农药的使用越来越受到限制，因此，研发有效的杀线虫微生物以补充或替代化学杀线虫剂就显得日益迫切。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是目前世界上应用最广泛、最成功的微生物杀虫剂，被广泛应用于农业、林业、贮藏以及卫生等领域的害虫防治。自从1961年Ciordia等首次发现Bt对牛肠道蛇形毛圆线虫(thichostrongylus colubriformis)卵和幼虫有杀灭作用以来，Bt的杀线虫作用才逐渐引起人们的关注。国内外已报道的具有杀线虫活性的Bt菌株主要包括Bt苏云金亚种(B.t.subsp. thuringiensis)、以色列亚种(B. t. subsp. Israelensis)、库斯塔克亚种(B. t. subsp. Kurstaki)和莫里斯亚种(B.t.subsp. Morris)。这些菌株对多种植物线虫具有生物活性， 如酸酱线虫(Panagrellus redivivus)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)禾口大豆抱囊线虫(Heterodera glycines)等(Schnepf, 1998)。1985年Bone等首次证实了 Bt伴胞晶体蛋白(δ-内毒素)对线虫的作用活性， 2003年Wei等研究了不同基因产生的伴胞晶体对几种自由生活线虫的毒性，从两个主要的 B. t.晶体蛋白亚家族中表达出了 7种不同的晶体毒素蛋白，通过测试这些晶体毒素蛋白对自由生活的线虫毒性，证实了其中4种晶体毒素蛋白(Cry5B、Cry6A、Cryl4A、Cry21A)对多种线虫种类均有活性，所测试的线虫至少对一种晶体毒素蛋白敏感，从而明确提出Bt晶体毒素蛋白具有杀线虫能力(Wei JZ, 2003) 0 B. t.晶体毒素蛋白是由毒素蛋白基因(cry基因)编码的，不同苏云金芽胞杆菌亚种或菌株所具有的cry基因不同。1988年以来，美国 Mycogen公司分离到一些对秀丽新小杆线虫、短体线虫、捻转血矛线虫等有毒性的苏云金芽胞杆菌，并从这些菌株中克隆了一些杀线虫毒素蛋白基因(参见http://appft.USpt0. gov/netacgi)。到目前为止，全世界从B. t.菌株中已分离到的杀线虫基因主要有cryl、 cry5、cry6、cryl2、cry 13以及cry21几大类，但数量十分有限，而且这些菌株、伴胞晶体蛋白及伴胞晶体蛋白基因几乎都以专利的形式加以保护，所涉及的菌株也多使用代号。因此， 分离鉴定新的苏云金芽胞杆菌杀线虫菌株引起国内外科学家的广泛重视。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种对植物寄生线虫特异、高效的苏云金芽胞杆菌菌株及其伴胞晶体，还提供一种简单、易行的该伴胞晶体的提取方法，同时还提供一种高效、低毒、生态环保、且能有效减少农药残留的前述菌株或伴胞晶体在植物线虫病害防治中的应用。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种苏云金芽胞杆菌菌株，所述苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株的保藏名称为苏云金芽胞杆菌YC-10，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO =M 2010023，保藏日期2010年1月21日。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种伴胞晶体，该伴胞晶体是上述的苏云金芽胞杆菌菌株在形成芽孢时所产生的(棱形或不规则形)伴胞晶体蛋白。上述菌株的特征主要有a.该菌株发酵液呈碱性，产棱形伴胞晶体；b.组成伴胞晶体的杀线虫晶体蛋白为分子量包括30KDa、55KDa、80KDa等多个组分。作为一个总的技术构思，本发明还提供上述伴胞晶体的提取方法，包括以下步骤 将上述保藏的苏云金芽胞杆菌菌株进行活化后得到的菌液接入到发酵培养基中，在25°C 37°C温度、125r/min 225r/min下振荡培养72h 120h，待所述菌株的菌体破裂后，离心收集培养得到的胞晶混合物；然后分别用食盐水和灭菌水对该胞晶混合物进行洗涤，再用含β-巯基乙醇的缓冲液悬浮，在37°C温度下作用lh(使蛋白质溶解)，再离心取上清，加入乙酸钠溶液并置于冰上沉淀，沉淀后的蛋白用灭菌水洗涤，并用缓冲液溶解，再经离心除杂后将上清液进行透析过夜，所得透析液中即含有分离提纯得到的伴胞晶体。上述的伴胞晶体的提取方法中，所述发酵培养基优选包含以下质量分数的组分 牛肉膏 0. 3% 0. 5%、蛋白胨0. 5% 2. 0%、葡萄糖0. 1% 0. 3%,NaCl 0. 2% 1. 0%、 MgSO4 · 7Η200· 01 % 0. 03 %、K2HPO4O. 005% 0.03% 和 MnSO4O. 003 % 0. 005 %，所述发酵培养基的PH值为5. 5 8. 5。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的苏云金芽胞杆菌菌株或伴胞晶体在植物线虫病害防治中的应用。上述的应用中，可以优选将所述苏云金芽胞杆菌菌株制成发酵滤液后，用于植物线虫病害的防治，该发酵滤液可按以下制备方法制得将所述苏云金芽胞杆菌菌株接种到发酵培养基中，然后在25°C 37°C、125r/min 225r/min条件下震荡培养72h 120h得到发酵液，发酵液再经离心分离后取上清液，即得到发酵滤液。上述的应用中，所述植物线虫优选包括了根结线虫或大豆孢囊线虫。所述根结线虫优选为南方根结线虫J2幼虫及卵。所述大豆孢囊线虫优选为大豆孢囊线虫J2幼虫及卵 (根结线虫、大豆孢囊线虫J2为它们的侵染期虫龄，所以做生测时一般选用该龄期幼虫做试验)。与现有技术相比，本发明的优点在于本发明从烟草中筛选到了一株对线虫高活性的苏云金芽胞杆菌菌株YC-10，生物活性测定结果显示该菌株的发酵滤液及其所产生的伴胞晶体蛋白对包括南方根结线虫J2幼虫、大豆孢囊线虫J2幼虫等在内的植物线虫都具有较强的生物活性，并能显著抑制南方根结线虫与大豆孢囊线虫卵的孵化。经过我们的测试发现，本菌株的发酵滤液Mh内可使南方根结线虫与大豆孢囊线虫J2全部死亡。同时本发明菌株产生的伴胞晶体蛋白对南方根结线虫J224h的LC5tl可达5. 86 μ g -πιΓ1 (LC50为致死中量)，对大豆孢囊线虫J224h的LC5tl可达4. 87μ g · mL—1。而且，本发明的菌株及其产物还能显著抑制线虫卵的孵化，对南方根结线虫与大豆孢囊线虫卵的孵化抑制率分别达到71. 7%和62. 1%。总的来说，本发明开拓了植物寄生线虫生物防治的新途径，扩大了适用于植物寄生线虫的生物农药资源，本发明的产品不仅高效低毒，而且可以有效减少化学农药的使用，降低化学农药对环境的污染，并能减少线虫抗药性的产生，进而有利于环境保护，减少农产品上的农药残留，具有广阔的推广应用前景。上述本发明的技术方案中，所述苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株的保藏名称为苏云金芽胞杆菌YC-10，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)， 保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期2010年1月21日，保藏号为CCTCC NO =M 2010023。
图1为本发明实施例1中筛选得到的苏云金芽胞杆菌YC-10的菌落形态照片。图2为本发明实施例1中筛选得到的苏云金芽胞杆菌YC-10的菌株形态扫描电镜照片。图3为本发明实施例1中筛选得到的苏云金芽胞杆菌YC-10所产的芽孢形态照片。图4为本发明实施例1中透射电镜下观察到的苏云金芽胞杆菌YC-10伴胞晶体形状。图5为本发明实施例1中透射电镜下观察苏云金芽胞杆菌YC-10菌体中芽孢及伴胞晶体。图6为本发明实施例1中扫描电镜下观察到的苏云金芽胞杆菌YC-10伴胞晶体形状。图7为本发明实施例1中苏云金芽胞杆菌YC-10的伴胞晶体蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图。
具体实施例方式以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步描述。实施例1 一种本发明的苏云金芽胞杆菌菌株，该菌株的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期2010年1月21日，保藏名称为苏云金芽胞杆菌 YC-10，保藏号为 CCTCC NO :M 2010023。本实施例的菌株主要是采用平板稀释分离法，利用营养琼脂培养基培养，从烟草中分离后获得，具体的分离筛选步骤如下1.配制营养琼脂培养基，包含以下质量分数的组分牛肉膏0.5%、蛋白胨1.0%、 NaCll. 0%，调 pH 值至 7. 2 左右，121°C灭菌 30min。2.分离菌株从根结线虫发病田中采集健康烟草植株36份，在自来水下冲洗干净，用的次氯酸钠消毒lOmin，无菌水洗3次，在无菌水中捣碎研磨，将液体用无菌水稀释后80°C处理15min，再涂布在上述配制的NA培养基中；然后于温度下培养48h，挑取形态相异菌落，重复在新的平板培养基上划线纯化培养。将上述分离获得的菌株活化后，再以1 %的接种量接入营养琼脂液体培养基中，在 30°C、220r/min震荡培养48h，取发酵液稀释成菌悬液(菌液浓度> IO9CfumL-1)；取ImL菌悬液，加入50 μ 1线虫悬浮液(内含50条以上南方根结线虫J2)，于25°C的恒温箱中培养， 4 后观察南方根结线虫的死亡情况，筛选获得杀线虫的高活性菌株，本发明的苏云金芽胞杆菌YC-IO是其中活性最高的菌株。3.菌种的培养、继代和保藏在NA液体培养基中培养后，加入甘油保存于-80°C 超低温冰箱中，作为原始菌种，生产科研用菌种从原始菌种中转接，营养琼脂培养基活化培养。本实施例筛选得到的苏云金芽胞杆菌YC-IO的生物学特性如下所示该菌株在营养琼脂培养基上生长良好，30°C下恒温培养2d，菌落直径可达 0.2cm 0. 5cm，菌落乳白色、圆形或椭圆形，不透明，边缘不齐呈毛玻状(参见图1)；该菌株的菌体扫描电镜观察呈短杆状，无鞭毛，大小为(1. O 1. 2) X O. O 4. 0) μ m(参见图 2)；该菌株产椭圆形芽孢、近中生(参见图3)；该菌株G+，过氧化氢酶反应、V. P.反应均为阳性，能水解淀粉、明胶、卵磷脂，不能水解酪氨酸，不能将苯丙氨酸氧化脱氨，葡萄糖发酵产酸，含有脲酶，振荡培养后PH值呈碱性；该菌株耐高温，对氨苄青霉素、卡那霉素等抗生素抗性强，最适生长温度为30°C，最高生长温度45°C，最低生长温度10°C，温度过高或过低都不利于菌株的生长；PH范围在pH4. 5 9. 5、5. 5 8. 5为其适宜的生长条件，pH值小于 5. 5或大于8. 5生长受到明显抑制；在营养琼脂液体培养基中30°C培养，O 池处于延滞期，对数生长期为2 16h，16h后为稳定期。对本实施例筛选得到的苏云金芽胞杆菌YC-IO进行菌株中晶体蛋白的观察将该菌株接种到营养琼脂培养基中，30°C、220r/min摇床培养3d，电镜观察，可见到该菌株有芽孢及伴胞晶体生成，伴胞晶体形状为棱形或不规则形(参见图4 图6)。对本实施例筛选得到的苏云金芽胞杆菌YC-IO进行菌株中晶体蛋白的提取和检测利用等电点法提取上述的伴胞晶体蛋白，具体提取方法为先将菌株培养液离心后收集菌体，用lmol/LNaCl和灭菌水各洗涤3次，用含2% β-巯基乙醇的50mmol/ LNa2CO3 (pH9. 5)缓冲液悬浮，37°C作用Ih ；离心取上清，加入1/20体积的4mol/L乙酸钠 (pH4. 0)，冰上沉淀，沉淀的蛋白用灭菌水洗涤两次后，再用50mmol/L Na2CO3(pH9. 5)缓冲液溶解，离心除去不溶物，将上清液装入透析袋，在100倍体积的pH7. 4的0. 01mol/L PBS中， 4°C透析过夜，透析液即为提取的伴胞晶体蛋白溶液。利用12.5% SDS-PAGE凝胶电泳进行检测，SDS-PAGE凝胶电泳分析结果表明，本发明的菌株苏云金芽胞杆菌YC-10的晶体蛋白由分子质量主要由30KDa、55KDa、80KDa等多个组分组成(参见图7)。实施例2 苏云金芽胞杆菌YC-10制作成发酵滤液在线虫防治中的应用利用实施例1中筛选得到的苏云金芽胞杆菌YC-10制备发酵滤液，具体的制备方法为将实施例1中分离获得的苏云金芽胞杆菌YC-10接种到发酵培养基中，发酵培养基包含以下质量分数的组分牛肉膏0. 3% 0. 5%、蛋白胨0. 5% 2. 0%、葡萄糖0. 0.3%, NaCl 0. 2% 1. 0%、MgSO4 · 7Η20 0. 01 % 0. 03 %、K2HPO4O. 005 % 0. 03 % 禾口MnSO4O. 003% 0. 005 %，所述发酵培养基的 pH 值为 7. 0，25°C 37°C、125r/min 220r/ min摇床培养72h 120h，获得细菌发酵液，再以lOOOOr/min的转速离心IOmin取上清液即为发酵滤液。利用制得的发酵滤液按以下步骤进行应用，据此观察苏云金芽胞杆菌YC-IO对线虫的作用活性及其在植物线虫病害防治中的效果。1.发酵滤液对南方根结线虫J2幼虫的毒力测定本实施例制得的发酵滤液对南方根结线虫J2幼虫的毒力测定结果如下表1所示， 由表1可见，当发酵滤液稀释倍数小于或等于10倍处理南方根结线虫J2时，24h的致死率可达到100%;而40倍的稀释液在96h内也能使南方根结线虫全部死亡。与空白对照相比， 本发明的应用效果明显，与对照差异极显著(P ^ 0. 01)。表1 发酵滤液对南方根结线虫活性的毒力测定结果
权利要求
1.一种苏云金芽胞杆菌菌株，其特征在于所述苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株的保藏名称为苏云金芽胞杆菌YC-10，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO =M 2010023。
2.一种伴胞晶体，其特征在于该伴胞晶体是权利要求1所述的苏云金芽胞杆菌菌株在形成芽孢时产生的伴胞晶体蛋白。
3.—种如权利要求2所述的伴胞晶体的提取方法，包括以下步骤将权利要求1所述的苏云金芽胞杆菌菌株进行活化后得到的菌液接入到发酵培养基中，在25°C 37°C温度、 125r/min 225r/min下振荡培养7 120h，待所述菌株的菌体破裂后，离心收集培养得到胞晶混合物；然后分别用食盐水和灭菌水对该胞晶混合物进行洗涤，再用含巯基乙醇的缓冲液悬浮，在37°C温度下作用lh，再离心取上清，加入乙酸钠溶液并置于冰上沉淀， 沉淀后的蛋白用灭菌水洗涤，并用缓冲液溶解，再经离心除杂后将上清液进行透析过夜，所得透析液中即含有分离提纯得到的伴胞晶体。
4.根据权利要求3所述的伴胞晶体的提取方法，其特征在于所述发酵培养基包含以下质量分数的组分牛肉膏0.3% 0.5%、蛋白胨0.5% 2.0%、葡萄糖0. 0.3%, NaCl 0. 2% 1. 0%、MgSO4 · 7Η20 0. 01 % 0. 03 %、K2HPO4O. 005 % 0. 03 % 禾口 MnSO4O. 003% 0. 005%，所述发酵培养基的pH值为5. 5 8. 5。
5.一种如权利要求1所述的苏云金芽胞杆菌菌株或如权利要求2所述的伴胞晶体在植物线虫病害防治中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于将所述苏云金芽胞杆菌菌株制成发酵滤液用于植物线虫病害的防治，该发酵滤液的制备方法为将所述苏云金芽胞杆菌菌株接种到发酵培养基中，然后在25 V 37°C、125r/min 225r/min条件下震荡培养72h 120h 得到发酵液，发酵液再经离心分离后取上清液，即得到发酵滤液。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于所述植物线虫包括根结线虫或大豆孢囊线虫。
全文摘要
本发明公开了一种苏云金芽胞杆菌菌株，该菌株的保藏名称为苏云金芽胞杆菌YC-10，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NOM2010023。该苏云金芽胞杆菌菌株在形成芽孢时能产生伴胞晶体蛋白其提取方法是将菌株活化后的菌液接入到发酵培养基中，振荡培养待菌体破裂后得到胞晶混合物；然后进行洗涤、缓冲液悬浮，离心取上清，沉淀，溶解，再经离心除杂后透析过夜，透析液中即含有伴胞晶体。上述的苏云金芽胞杆菌菌株或其所产生的伴胞晶体能有效应用于植物线虫病害防治。本发明的菌株及其应用具有高效、低毒、生态环保、且能有效减少农药残留等优点。
文档编号C12N1/20GK102311936SQ20111026167
公开日2012年1月11日 申请日期2011年9月6日 优先权日2011年9月6日
发明者何明远, 刘勇, 张德咏, 张松柏, 成飞雪, 戴建平, 朱春晖, 杨春晓, 王忠勇, 程菊娥, 罗源华, 罗香文, 谭新球 申请人:湖南省植物保护研究所