专利名称：一种人脐带间充质干细胞分离培养方法
技术领域：
本发明涉及一种人脐带间充质干细胞分离培养方法，属于生物制品细胞分离培养技术领域。
背景技术：
间充质干细胞(MSCs)是一类来源于发育早期中胚层及外胚层的多能干细胞，具有能自我更新、多向分化的能力。目前研究的MSCs主要来源于成人骨髓以及脐带血。对于成人骨髓来源的间充质干细胞，由于其数量及增殖分化潜能随年龄的增大而下降，且病毒感染率较高，加之供者的骨髓采集需进行骨髓穿刺术，故其获取受到一定的限制；近年来，有大量研究表明人脐带中也存在大量间充质干细胞，且具有来源广泛、取材方便、相对纯净、含量丰富及免疫原性低等优点，正逐渐取代其他来源的间充质干细胞成为MSCs研究领 域的热点之一。脐带是连于胚胎脐部与胎盘间的索状结构，外覆羊膜，内含来自中胚层的胶样结缔组织。大量研究证实脐带中含有丰富的间充质干细胞，其来源主要分四种来源于Wharton’ s jelly ;来源于脐血管周围；来源于脐血；来源于脐静脉血管内皮下。由于人胳带间充质干细胞(humanumbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)具有自身独特的优点和特性，有望成为细胞移植治疗各种疾病的良好细胞来源。其优点主要体现在以下几个方面首先，hUCMSCs具有很强的粘附性，当进行低密度细胞培养时能迅速贴壁，且增殖速度快。在体外可被诱导为成骨细胞、成脂细胞、神经细胞等，具有多向分化潜能，；其次，hUCMSCs不表达主要组织相容性复合物(MHC) II类抗原，且不表达或低表达多种移植免疫排斥相关的共刺激因子，如⑶80、⑶40、⑶46、⑶40L，是一类免疫缺陷细胞，可被用于治疗急性移植物抗宿主反应(GCHD);再者，分娩后的脐带属于废弃物，取材十分便利，且不受伦理道德方面的限制；最后，hUCMSCs的含量十分丰富，有研究表明一根30厘米长的脐带中可以分离培养得到IO7原代细胞，且细胞分化能力强，生物学性能稳定，多次传代后仍能保持较强的增殖及分化能力，为科研工作及临床治疗提供了充足的细胞来源。综上所述，由于脐带间充质干细胞在各方面都展现出强有力的优势，故在细胞治疗领域具有十分广阔的应用前景。近年来，随着科研工作者对hUCMSCs研究兴趣的日益浓厚，以及应用范围的愈发广泛，hUCMSCs的分离培养方式也日益便利和完善，主要是以酶消化法，或植块法获得一定数量的脐带间充质干细胞。有关脐带间充质干细胞的分离培养方法的研究以及专利的申请集中于酶消化获取细胞的方法，主要区别在于酶的种类，如胰酶消化，胰酶及胶原酶联合消化，胶原酶、透明质酸酶及中性蛋白酶联合消化。但酶消化法分离脐带间充质干细胞的方法存在一些缺陷，首先，酶消化需要消耗一定时间，使分离时间延长；其次，使用动物源的酶制剂消化脐带，给脐带间充质干细胞的后期临床应用带来了一定影响；再次，酶消化法过程较为繁琐，且稳定性差。细胞分离之后多选用以间充质细胞培养基，即含有一定比例胎牛血清的DMEM系列培养基进行培养，且传代时选用胰酶-EDTA作为消化溶液。在上述处理过程中，需不断接触动物来源的各种生物制剂，如，胎牛血清，胰蛋白酶-EDTA，这些生物制剂的使用不利于间充质干细胞的临床应用安全性的保证，限制了脐带间充质干细胞研究及应用的进
ー步发展。
发明内容
本发明针对现有的脐带间充质干细胞分离培养中涉及到有关使用过多动物来源的生物制剂给其临床应用发展带了不利因素的问题，提供了ー种无血清、安全稳定、可以迅速得到大量安全无毒的脐带间充质干细胞、操作简单以及安全高效的人脐带间充质干细胞分离培养方法。本发明为实现技术目的采用的技术方案为ー种人脐带间充质干细胞分离培养方法，包括以下步骤
(I)取足月剖宫产胎儿脐带，无菌条件下用PBS冲洗，去除残留血迹；(2)在动物细胞培养基中用无菌剪刀将步骤(I)中洗净的脐带剪成组织块，去除组织块的血管并将组织块弄碎；(3)将步骤(2)中剪碎的组织块或绞碎的组织匀浆置于离心管中与动物细胞培养基充分混合振荡后离心，离心机速度为1600 2200转/分钟，离心5 10分钟弃去上清，重复2 4遍；(4)将离心沉淀部分与配置好的MesenCult-XF完全培养基混合震荡均匀种植于细胞培养皿中，并置于37°C，5% CO2培养箱中培养；(5)培养第5天，将组织块全部吸出弃去，补加MesenCult-XF完全培养基，且显微镜下观察到贴壁的梭形或多边形的细胞，之后每隔3天更换一次培养基，继续培养。ー种人脐带间充质干细胞分离培养方法，所述步骤(2)中所用的动物细胞培养基为RPMI MEDIUM 1640培养基或者DMEM培养基。ー种人脐带间充质干细胞分离培养方法，所述步骤(2)中将组织块弄碎的方法为剪碎或者使用组织块匀浆机直接绞碎。ー种人脐带间充质干细胞分离培养方法，所述步骤(3)中所用的动物细胞培养基为RPMI MEDIUM 1640培养基或者DMEM培养基。ー种人脐带间充质干细胞分离培养方法，所述步骤⑷和步骤(5)中的MesenCult-XF 完全培养基组成为 20 MesenCult-XF Supplement+80 % MesenCult-XFBasal Medium+2mM L-Glutamine。ー种人脐带间充质干细胞分离培养方法，其特征在干在所述步骤(5)之后，还包括步骤(6):培养第12 15天，细胞约80 %融合，以MesenCult-XF EnzymaticDissociation Solution 消化，并以MesenCult-XF Enzymatic InhibitionSolution终止消化，按I : 3传代，之后每3天传一代，最終得到充足的间充质干细胞。本发明的优点和有益效果在于I.胎儿脐带是剖宫产后残留的废弃组织，一般情况下将其直接丢弃，本发明对脐带组织进行处理，获得大量有一定医学价值的脐带间充质干细胞，属于良好的废物利用，节约成本，且有效避免了伦理上的障碍。2.应用彻底将去除血管的脐带组织剪碎或直接使用电动组织块匀浆机绞碎的方法分离间充质干细胞，使得脐带组织华尔通胶体中包裹的脐带间充质干细胞充分暴露，操作简单高效，成本低廉。3.将通常用于骨髓间充质干细胞的MesenCult-XF Mediums试剂盒用于培养人脐带间充质干细胞，避免了传统人脐带间充质干细胞分离培养中的动物血清的使用，稳定性高，细胞生长旺盛，剂量适用于多次传代，对于临床应用脐带间充质干细胞治疗各种适应症提供了安全保障。
图I :培养出的脐带间充质干细胞的镜检照片。图2 :流式细胞仪检测脐带间充质干细胞特征表面标记。
具体实施例方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步说明。实施例I :取足月剖宫产胎儿脐带约15ml，无菌条件下用PBS反复冲洗，去除残留血迹。在RPMI MEDIUM 1640培养基中用无菌剪刀将其剪成长约I. Ocm的组织块，去除其血管并尽量剪碎，组织块置于50ml离心管中以RPMI MEDIUM 1640培养基充分混合振荡后离心，离心机速度为2000转/分钟，离心5分钟弃去上清，重复3遍，离心后得到约20ml的脐带组织碎块沉淀，将离心沉淀部分与MesenCult-XFMediums完全培养基混合震荡均匀种植于细胞培养皿中，并置于37°C，5% CO2培养箱中。培养第5天，将组织块全部吸出弃去，补加培养基，且显微镜下观察到贴壁的梭形或多边形的细胞，之后每隔3天更换一次培养基。培养第15天左右，细胞约80%融合，按I : 3传代，之后每3天传一代，最终得到充足的间充质干细胞。(培养基的配置方法及细胞培养中相关操作注意事项均严格参照MesenCult-XFMedium试剂盒说明书)实施例2 取足月剖宫产胎儿脐带约30ml，无菌条件下用PBS反复冲洗，去除残留血迹。在DMEM培养基中用无菌剪刀将其剪成长约I. 5cm的组织块，去除其血管并尽量剪碎，组织块置于50ml离心管中以DMEM培养基充分混合振荡后离心，离心机速度为1600转/分钟，离心10分钟弃去上清,重复4遍,得到脐带组织碎块约30ml,将离心沉淀部分与MesenCult-XFMediums完全培养基混合震荡均匀种植于细胞培养皿中，并置于37°C，5% CO2培养箱中。培养第5天，将组织块全部吸出弃去，补加培养基，且显微镜下观察到贴壁的梭形或多边形的细胞，之后每隔3天更换一次培养基。培养第15天左右，细胞约80%融合，按I : 3传代，之后每3天传一代，最终得到充足的间充质干细胞。(培养基的配置方法及细胞培养中相关操作注意事项均严格参照MesenCult-XF Medium试剂盒说明书)实施例3 取足月剖宫产胎儿脐带约15ml，无菌条件下用PBS反复冲洗，去除残留血迹。在RPMI MEDIUM 1640培养基中用无菌剪刀将其剪成长约I. 5cm的组织块，去除其血管并使用组织块匀浆机将其充分彻底绞碎，绞碎后组织匀浆置于50ml离心管中以RPMI MEDIUM1640培养基充分混合振荡后离心，离心机速度为2200转/分钟，离心10分钟弃去上清，重复2遍,得到脐带组织碎块约40ml,将离心沉淀部分与MesenCult-XF Mediums完全培养基混合震荡均匀种植于T-75cm2培养瓶中，并置于37°C，5% CO2培养箱中。培养第5天，将组织块全部吸出弃去，补加培养基，且显微镜下观察到贴壁的梭形或多边形的细胞，之后每隔3天更换一次培养基。培养第15天左右，细胞约80%融合，按I : 3传代，之后每3天传ー代，最終得到充足的间充质干细胞。(培养基的配置方法及细胞培养中相关操作注意事项均严格參照MesenCult-XF Medium试剂盒说明书)将培养出的脐带间充质干细胞进行镜检及流式细胞仪检测特征表面标记，图I为镜检照片，图2为特征表面标记的流式图，检测结果显示为⑶34+，⑶105-，⑶45-，⑶44+，证明所获得的细胞为间充质干细胞。
以上对本发明结合实施例做了具体说明，但本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗g前提下做出各种变化。
权利要求
1.ー种人脐带间充质干细胞分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)取足月剖宫产胎儿脐带，无菌条件下用PBS冲洗，去除残留血迹； (2)在动物细胞培养基中用无菌剪刀将步骤(I)中洗浄的脐带剪成组织块，去除组织块的血管并将组织块弄碎； (3)将步骤(2)中弄碎的组织块置于离心管中与动物细胞培养基充分混合振荡后离心，离心机速度为1600 2200转/分钟，离心5 10分钟弃去上清，重复2 4遍； (4)将离心沉淀部分与配置好的MesenCult-XF完全培养基混合震荡均匀种植于细胞培养皿中，并置于37°C，5% CO2培养箱中培养； (5)培养第5天，将组织块全部吸出弃去，补加MesenCult-XF完全培养基，且显微镜下观察到贴壁的梭形或多边形的细胞，之后每隔3天更换一次培养基，继续培养。
2.根据权利要求I所述的人脐带间充质干细胞分离培养方法，其特征在于所述步骤(2)中所用的动物细胞培养基为RPMI MEDIUM 1640培养基或者DMEM培养基。
3.根据权利要求I所述的人脐带间充质干细胞分离培养方法，其特征在于所述步骤(2)中将组织块弄碎的方法为剪碎或者使用组织块匀浆机直接绞碎。
4.根据权利要求I所述的人脐带间充质干细胞分离培养方法，其特征在于所述步骤(3)中所用的动物细胞培养基为RPMIMEDIUM 1640培养基或者DMEM培养基。
5.根据权利要求I所述人脐带间充质干细胞培养方法，其特征在于所述步骤(4)和步骤(5)中的 MesenCult-XF 完全培养基的组成为 20% MesenCult-XFSupplement+80 %MesenCult-XF Basal Medium+2mM L-Glutamine。
6.根据权利要求I所述人脐带间充质干细胞分离培养方法，其特征在于在所述步骤(5)之后，还包括步骤(6):培养第12 15天，细胞约80%融合，以MesenCult-XFEnzymatic Dissociation Solution 治化，并以 MesenCult-XFEnzymatic InhibitionSolution終止消化，按I : 3传代，之后每3天传一代，最終得到充足的间充质干细胞。
全文摘要
本发明提供了一种人脐带间充质干细胞分离培养方法，包括以下步骤取足月剖宫产胎儿脐带，无菌条件下用PBS冲洗，去除血迹；在动物细胞培养基中用无菌剪刀将洗净的脐带剪成组织块，去除其血管并弄碎，然后与动物细胞培养基充分混合振荡后离心，将离心所得的沉淀与MesenCult-XF完全培养基混合震荡均匀种植于细胞培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；培养第5天，将组织块全部吸出弃去，补加MesenCult-XF完全培养基，之后每隔3天更换培养基继续培养，获得脐带间充质干细胞。本发明不使用动物血清，操作简单，重复性好，安全性高，所获细胞经多次传代后稳定。
文档编号C12N5/0775GK102965336SQ20111026154
公开日2013年3月13日 申请日期2011年8月30日 优先权日2011年8月30日
发明者姚惟琦, 武栋成 申请人:姚惟琦, 武栋成, 武汉康苑生物医药科技有限公司