专利名称：编码高甜度莫奈灵的基因及其产物蛋白的应用的制作方法
技术领域：
本发明提供了采用基因工程技术提高莫奈灵(monellin)甜度和发酵生产高甜度莫奈灵([Asn66]monellin)的方法及其应用。
本发明还提供了人工合成编码高甜度莫奈灵的基因，以及携带该基因的表达载体和含有表达载体的重组细胞，及其由重组细胞高效生产的高甜度莫奈灵蛋白及其应用。
莫奈灵甜蛋白来源于西非一种热带植物(Dioscorephyllum cumminsii)的果实(Morris，.J.A.，Cagan，R.H.，Biochim.Biophys.Acta，261114-122，1972)，是一种天然蛋白质甜味剂。莫奈灵甜蛋白在许多方面优于蔗糖和其他甜味剂(1)莫奈灵不含碳水化合物(Morris，J.A.，The Journal of Biological Chemistry，241(2)534-539，1973)，代谢产生的热量低。(2)莫奈灵甜度高，按重量比其甜度是蔗糖的3000倍，按分子比计算则为蔗糖的10万倍(Kim，S.H.，deVos，A.M.，Trends in Biochem.Sci.1313-15，1988)，是现有甜味剂中甜度最高的一种。(3)莫奈灵是天然蛋白质，富含多种氨基酸(Morris，J.A.，TheJournal of Biological Chemistry，241(2)534-539，1973)，营养丰富，因对人体无任何毒副作用，不仅老幼正常人可直接食用，而且糖尿病人、肥胖病人、心脑血管病人和儿童龋齿病人皆可直接食用。(4)莫奈灵对细菌作用的稳定性高，不会导致龋齿。(5)莫奈灵是一种增香剂，尤其对天然香料，效果更明显。在食品、饮料、医疗保健等方面有广泛的应用前景，是一种很有前途的甜味剂。
但作为莫奈灵天然来源的植物正常结实所要求的生态环境非常苛刻，很难在其他地区引种成功另外，天然莫奈灵由A、B两条多肽链组成，稳定性较差，低pH或高温条件下，A、B两条多肽链易分开，而失去甜味活性。生物工程技术的迅速发展启发人们用基因工程的手段去改造和开发莫奈灵，实现其在生产和生活中的广泛应用。
1989年，Kim等人用一小段DNA序列将编码A、B链的基因连接起来，并使其成功的在大肠杆菌中表达，单链莫奈灵(single monellin)与天然莫奈灵相比，两者甜度接近，但前者稳定性和复性能力较后者都有显著提高(United States Patent 5264558)。1992年，Penanubia等得到转单链莫奈灵基因的番茄和莴苣，但莫奈灵表达效率较低(Penarrubia，L.，Kim，R.，Giovannoni，J.，Bio/Technology 10561-564，1992)。1995年，郭三堆等采用原核生物偏爱密码子合成单链莫奈灵基因，使其在大肠杆菌中得到高效表达，莫奈灵达菌体可溶性蛋白的20％，表达效率较低。1996年，Kondo.K.等使单链莫奈灵基因在酵母(Candida utilis)中表达，表达效率高达50％(Kondo，K.，Miura，Y.，Sone，H.，NatureBiotechnology 15453-457，1997)，为莫奈灵的规模生产和应用创造了条件。以上所涉及的人工改造的莫奈灵基因产物，甜度均为蔗糖重量甜度的3000倍。本发明人工合成的高甜度莫奈灵基因产物是蔗糖重量甜度的4500倍，在蛋白质结构上与上述人工改造的莫奈灵有所不同。
1990-1992年间，Kohmura对天然莫奈灵的结构和功能进行研究，用固定相合成法分别对莫奈灵分子中的Asp、Glu进行突变，将Asp变成Asn、Glu变成Gln。意外地发现AsnA16、Asn26monellin甜度与天然莫奈灵相比，分别由原来蔗糖重量甜度的3000倍提高到了5500倍和7500倍(Kohmura，M.，Nio，N.，Ariyoshi，Y.，BioSci.Biotech.Biochem.，56(3)472-476，1992)，由此可见，用固相合成法可以得到高甜度莫奈灵，但这种方法与本发明在细菌中生产高甜度莫奈灵的方法相比较成本太高。
本发明的目的是在前人工作的基础上，不仅要提高莫奈灵蛋白的甜度，同时要建立一种简便、快速、可大规模生产廉价高甜度莫奈灵的方法及其产物的应用。
本发明提供的高甜度莫奈灵蛋白，将天然莫奈灵的A链和B链合并成一条单链，其间加入了具有弹性弯曲特性的氨基酸，并将第66位Asp设计为Asn，从而既维持了与天然莫奈灵相似的空间结构，又提高了所表达甜蛋白的效率、稳定性和甜度。
本发明提供了高甜度莫奈灵的氨基酸序列SEQ ID No.1及其功能等同物，DNA序列SEQ IDNo.2及其功能等同物以及特别适于在大肠杆菌中高效表达的DNA序列SEQ ID No.3及其功能等同物。以SEQ ID No.2及其功能等同物为基础，根据所选宿主细胞对密码子的偏爱性，可以得到适于在真核和原核生物不同宿主中表达的高甜度莫奈灵DNA序列。本文所用的述语“功能等同物”指编码具有甜度功能蛋白质的DNA序列。
本发明中人工合成的高甜度莫奈灵基因可以通过DNA重组技术，连接到适当的表达载体中，以构建本发明的重组表达载体。
在本发明的一个优选实施方案中，提供了适于在大肠杆菌中表达的高甜度莫奈灵的DNA序列，并借助原核生物高效表达载体pBV221，构建了含有该序列的重组表达质粒pGB[Asn66]m.。含有该重组表达质粒的菌株已按照布达佩斯条约的规定，于1998年6月9日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏登记号为CGMCCNO.0352。
本发明提供了用于发酵的基因工程菌B121-GB[Asn66]m.，实现了高甜度莫奈灵在大肠杆菌中的高效表达，高甜度莫奈灵达菌体可溶性蛋白的40％以上，并建立了简便有效分离纯化表达产物高甜度莫奈灵的方法，因此本发明具有大规模生产的意义。
本发明的高甜度莫奈灵与天然莫奈灵相比，稳定性明显提高，甜度由原来蔗糖重量甜度的3000倍提高到4500倍；相对蔗糖分子甜度由原来的10万倍提高到15万倍。
本发明提供的高甜度莫奈灵作为甜味剂可以代替蔗糖和其他甜味剂用于食品、饮料的生产，尤其适用于低卡保健食品、饮料、医药的生产，另外，还可以作为增香剂生产香烟、口香糖、饲料等，有十分广阔的应用前景。
本发明中带有SEQ ID No.2序列及其功能等同物的重组表达载体可使用任何已知的转化方法转化到相应的宿主细胞中，获得带有上述重组表达载体的重组细胞。可供选择的宿主包括微生物、植物、动物。其中微生物包括大肠杆菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、链霉菌等各种革兰氏阳性和阴性菌；灵芝、猴头、食用霉菌等各种真菌；啤酒酵母、甲醇酵母等各种真核微生物。植物包括各种瓜、果、蔬菜、粮食作物等植物反应器。动物包括各种昆虫，例如家蚕等昆虫反应器。各种哺乳动物，例如小鼠、兔、猪、羊、牛等动物反应器。凡涉及本发明高甜度莫奈灵基因的各种生物，均属本发明权利要求范围之内。
本发明的
如下图1适于在大肠杆菌中表达的高甜度莫奈灵([Asn66]monellin)基因10个小片段的合
成序列。
图2高甜度莫奈灵([Asn66]monellin)基因的组装示意图。
图3高甜度莫奈灵([Asn66]monellin)基因克隆载体pG[Asn66]m.的构建。
图4高甜度莫奈灵([Asn66]monellin)基因表达质粒pGB[Asn66]m.的构建。
图5高甜度莫奈灵([Asn66]monellin)在大肠杆菌中的温度诱导表达。
Lane1.GB[Asn66]m.42℃诱导表达的可溶性蛋白。
Lane2.GB[Asn66]m.30℃培养表达的可溶性蛋白。
Lane3.低分子量蛋白标准。
图6高甜度莫奈灵([Asn66]monellin)在优化发酵条件下的诱导表达。
Lane1.在优化发酵条件下GB[Asn66]m.诱导表达的可溶性蛋白。
Lane2.低分子量蛋白标准。
图7在优化发酵条件下GB[Asn66]m.诱导表达可溶性蛋白的黑度扫描。
注PEAK No.18为高甜度莫奈灵([Asn66]monellin)。
图8高甜度莫奈灵([Asn66]monellin)纯化结果的SDS-PAGE检测。
Lane1.低分子量蛋白标准。
Lane2.GB[Asn66]m.42℃诱导表达的可溶性蛋白。
Lane3.纯化的高甜度莫奈灵([Asn66]monellin)。
实施例1、高甜度莫奈灵([Asn66]monellin)基因片段的合成及完整基因的组装A、基因的设计高甜度莫奈灵由94个氨基酸组成(SEQ ID No.1)，为了得到甜度较天然莫奈灵(monellin)高的蛋白产物，将第66位的氨基酸设计为Asn(相应于天然莫奈灵A链第16位的Asp)，其基因有282bp，所有氨基酸的密码子均选用大肠杆菌偏爱的密码子，加上起始密码子ATG、终止密码子TAA及5′和3′末端克隆时用的限制性内切酶酶切点及保护碱基共298bp。将它分为10个小片段来合成，10个片段的序列见图1。
B、小片段的合成及完整高甜度莫奈灵([Asn66]monellin)基因的组装小片段的合成由北京赛百盛公司完成。
每个小片段取1nmol，用T4多核苷酸激酶分别加5′-P，然后混合加5′-P后的10个片段，进行退火反应100℃5min，然后缓慢冷却至室温。再用T4DNA连接酶连接成完整的高甜度莫奈灵基因([Asn66]monellin)(图2)。
实施例2、高甜度莫奈灵([Asn66]monellin)基因的克隆及鉴定克隆步骤按常规方法进行(Sambrook，J.et al，Molecular Cloning-A LaboratoryManual，2nd ed，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)。
如图3所示，先用限制性内切酶HincII水解克隆载体pUC19，并用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)脱去其5′-P，然后用T4DNA连接酶将高甜度莫奈灵([Asn66]monellin)基因(约0.3Kb)与脱磷的pUC19/HincII(约2.7Kb)载体相连接，连接后转化Ecoli.DH5α受体菌。用NcoI和BamHI酶切克隆子质粒，筛选有外源DNA片断插入的克隆子。碱法提取重组克隆的质粒pG[Asn66]m.(约3.0Kb)，用Pharmacia公司的T7 Sequencing Kit测序(操作按Kit说明书进行)，证明高甜度莫奈灵([Asn66]monellin)基因序列准确无误。
实施例3、表达质粒pGB[Asn66]m的构建为了保证高甜度莫奈灵[Asn66]monellin基因在大肠杆菌中的高效表达，我们选择了pBV221为表达载体。其技术特征是串联强启动子PRPL，含有温度敏感的PRPL启动子阻碍蛋白基因CIts857，PMBI复制基因，rrnβ强转录终止信号，氨苄青霉素抗性基因等高效表达所需的调控元件。
用限制性内切酶NcoI和BamHI水解pG[Asn66]m.，电泳回收[Asn66]monellin基因片段(约0.3Kb)，与用同样两种限制性内切酶水解的pBV221大片段(约3.7Kb)连接并转化大肠杆菌BL21感受态细胞。挑取单菌落提质粒，同样用NcoI和BamHI进行双酶切鉴定，得到已有[Asn66]monelliin基因插入的重组质粒pGB[Asn66]m.(约4.0Kb)(图4)，含重组质粒的大肠杆菌BL21-GB[Asn66]m.即为[Asn66]monellin基因工程菌。
实施例4、[Asn66]monellin在大肠杆菌中的诱导表达基因工程菌GB[Asn66]m.在30℃，用加Amp100mg/L LB(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％氯化钠，pH7.2)培养基振荡培养过夜后，以1％比例接种于加Amp100mg/L LB培养基中，30℃培养约2小时后，将温度升至42℃诱导培养5小时。以未经42℃诱导表达的培养物作对照，SDS-PAGE检测结果如图5所示，经高温诱导的基因工程菌表达了分子量大小与[Asn66]monellin一致且有甜味活性的特异蛋白。
实施例5、[Asn66]monellin的发酵生产基因工程菌GB[Asn66]m.在30℃，用加Amp100mg/L LB(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％氯化钠，pH7.2)培养基振荡6小时培养后，以1％比例接种于补充0.1％葡萄糖，初始pH6.5的加Amp 100mg/L 2YT(1.6％胰蛋白胨、1％酵母提取物、0.5％氯化钠)培养基中，30℃培养约2小时后，将温度升至42℃诱导培养6小时。在上述优化发酵条件下，[Asn66]monellin表达的SDS-PAGE检测结果如图6所示。对图6中的Lanel进行黑度扫描，PEAK No.18代表的[Asn66]monellin占菌体可溶性蛋白的40％以上(图7)，说明这一表达质粒的表达效率较高。
实施例6、基因工程菌的保存及稳定性基因工程菌BL21-GB[Asn66]m.保存于15％甘油中，-70℃。传代培养基为固体LB培养基，固体平板菌在4℃保存。为检查工程菌的稳定性，每传10代作一次酶切图谱分析，结果与原始菌种相同，在50代时进行的[Asn66]monellin基因序列分析与原始设计基因相同，证明本发明构建的基因工程菌是十分稳定的。
实施例7、[Asn66]monellin的分离纯化发酵后，5000rpm离心10min收集菌体，用溶液A(0.01mol/L磷酸钠缓冲液，PH7.2)洗涤后，以每克湿菌体用2ml溶液B(溶液A+2mmol/LEDTA)的比例悬浮菌体。用超声波破碎菌体后，离心去除细胞碎片，然后用70％饱和度的硫酸钠沉淀蛋白，离心收集蛋白用溶液B重新溶解后，用溶液A于4℃透析过夜，其间换3次透析液。透析后的蛋白溶液上用溶液A平衡的CM Sephadex C-25柱，用溶液C(溶液+0.1mmol/LNaCl)洗脱，收集与[Asn66]monellin蛋白相应位置的峰，所得产品用15％的SDS-PAGE(J.萨姆布鲁克等著，金冬雁等译，分子克隆-实验指南第二版880-886，科学出版社，1995)检测为单一条带(图8 Lane3)，证明本发明采用的纯化方法十分可靠。
实施例8、[Asn66]monellin相对(蔗糖)甜度的测定首先配制0.02％(W/V)的[Asn66]monellin水溶液，然后将此溶液分别稀释成10、15、20等不同稀释倍数的溶液，通过品尝确定甜度与2％(W/V)蔗糖溶液相当的稀释溶液。相对甜度(W/W)＝100×稀释倍数，稀释45倍的0.02％(W/V)的[Asn66]monellin溶液甜度与2％(W/V)蔗糖溶液相当，因此[Asn66]monellin相对(蔗糖)甜度为4500倍，明显高于天然莫奈灵(monellin)的甜度(3000倍)。
上面的实施例进一步举例详细说明了本发明，但不能认为是对本发明的限制。上面的许多实验方法和步骤都可以用其他常规方法替代，这样的替代和本领域技术人员所熟悉的改动和变化，应落入本发明权利要求范围内。
序列表1、序列编号(SEQ ID No.)1(1)序列特征A.序列长度94个氨基酸B.序列类型氨基酸C.拓扑学直链状(2)分子类型蛋白质(3)假设序列是(4)反意序列不是(5)序列描述Gly Glu Trp Glu Ile Ile Asp Ile Gly Pro Phe Thr Gln Asn Leu15 10 15Gly Lys Phe Ala Val Asp Glu Glu Asn Lys Ile Gly Gln Tyr Gly20 25 30Arg Leu Thr Phe Asn Lys Val Ile Arg Pro Cys Met Lys Lys Thr35 40 45Ile Tyr Glu Asn Glu Arg Glu Ile Lys Gly Tyr Glu Tyr Gln Leu50 55 60Tyr Val Tyr Ala Ser Asn Lys Leu Phe Arg Ala Asp Ile Ser Glu65 70 75Asp Tyr Lys Thr Arg Gly Arg Lys Leu Leu Arg Phe Asn Gly Pro80 85 90Val Pro Pro Pro2.序列编号(SEQ ID No.)2(1)序列特征A.序列长度282个碱基B.序列类型核酸C.拓扑学直链状D.链数双链(2)分子类型寡核苷酸(3)假设序列是(4)反意序列不是(5)序列描述GGN GAR TGG GAR ATH ATH GAY ATH GGN CCN TTY CAN CAR AAY YTN45GGN AAR TTY GCN GTN GAY GAR GAR AAY AAR ATH GGN CAR TAY GGN90MGN YTN CAN TTY AAT AAR GTN ATH MGN CCN TGY ATG AAR AAR CAN 135ATH TGG GAR AAY GAR MGN GAR ATH AAR GGN TAY GAR TAY CAR YTN180TAY GTN TAY GCN WSN AAY AAR YTN TTY MGN GCN GAY ATH WSN GAR225GAY TAY AAR CAN MGN GGN MGN AAR YTN YTN MGN TTY AAY GGN CCN270GTN CCN CCN CCN282R＝A or G Y＝C or T M＝A or C K＝G or T S＝C or G W＝A or TH＝A or C or T V＝A or C or G D-A or G or T N＝A or C or G or T3.序列编号(SEQ ID No.)3(1)序列特征A.序列长度282个碱基B.序列类型核酸C.拓扑学直链状D.链数双链(2)分子类型寡核苷酸(3)假设序列是(4)反意序列不是(5)序列描述GGT GAA TGG GAA ATC ATC GAC ATC GGT CCG TTC ACC CAG AAC CTG45GGC AAA TTC GCT GTT GAC GAA GAA AAC AAA ATC GGT CAG TAC GGT90CGT CTG ACC TTC AAC AAA GTT ATC CGT CCG TGC ATG AAG AAA ACC 135ATC TAC GAA AAC GAA CGT GAA ATC AAA GGT TAC GAA TAC CAG CTG 180TAC GGT TAC GCT TCC AAC AAA CTG TTC CGT GCT GAC ATC TCC GAA 225GAC TAC AAA ACC CGA GGT CGT AAA CTG CTG CGT TTC AAC GGT CCG 270GTT CCG CCG CCG 28权利要求
1.一种蛋白质，它包含氨基酸序列SEQ ID No.1及其功能等同物。
2.一种编码权利要求1的蛋白质的核苷酸序列。
3.根据权利要求2的核苷酸序列，其中所述序列是DNA序列。
4.根据权利要求3的DNA序列，包含SEQ ID No.2及其功能等同物。
5.根据权利要求4的DNA序列，适用于各种原核和真核生物。
6.根据权利要求3的DNA序列，所述序列包含适于在原核细胞中高效表达的高甜度莫奈灵([Asn66]monellin)的DNA序列SEQ ID No.3及其功能等同物。
7.根据权利要求6的DNA序列及功能等同物，其基本上由原核生物偏爱密码子组成。
8.根据权利要求7的DNA序列及其功能等同物，其中所说的原核生物偏爱密码子选自大肠杆菌，并适用于各种原核生物。
9.根据权利要求8的DNA序列及其功能等同物，其中所说的原核生物是大肠杆菌。
10.包含根据权利要求1至7中任一项的DNA序列的重组表达载体。
11.由根据权利要求10的重组表达载体转化的重组细胞。
12.根据权利要求11的重组细胞，其为重组原核细胞。
13.根据权利要求12的重组细胞，其为重组大肠杆菌。
14.根据权利要求13的重组细胞，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC NO.0352。
15.一种制备高甜度莫奈灵([Asn66]monellin)蛋白的方法，包括从重组细胞培养物中分离该甜蛋白。
16.根据权利要求15的方法，其中所说的高甜度莫奈灵蛋白([Asn66]monellin)是由权利要求6中DNA序列所编码。
17.根据权利要求15的方法，其中所说的重组细胞是重组大肠杆菌。
18.根据权利要求15的方法，其中所说的重组细胞是大肠杆菌BL21-GB[Asn66]m.。
全文摘要
本发明提供了人工合成编码高甜度莫奈灵([Asn
文档编号C12N15/70GK1202495SQ98102420
公开日1998年12月23日 申请日期1998年6月12日 优先权日1998年6月12日
发明者郭三堆, 李敏 申请人:中国农业科学院生物技术研究中心