专利名称：具有天冬氨酸酶活性的新的蛋白和编码该蛋白的基因dna的制作方法
1、发明领域本发明涉及具有天冬氨酸酶活性的新的蛋白、编码该蛋白的基因DNA、包括该基因DNA的重组质粒、该重组质粒被导入其中的转化子和用该转化子制备L-天冬氨酸的方法。
L-天冬氨酸用作药品、食物添加剂等。最近，L-天冬氨酸也作为表面活性剂和生物可降解的螯合剂的原材料而受到重视。
2、背景技术的描述L-天冬氨酸主要通过酶学方法从延胡索酸和氨用天冬氨酸酶制备，作为编码天冬氨酸酶的基因，已知的有源自大肠杆菌的基因[普通微生物学杂志，130,1271-1278(1984)]和源自黄色短杆菌MJ-233的基因(日本未审查的专利公报NO.5-30977)。
寻找除了上述那些基因外的编码天冬氨酸酶的基因以更为有效地制备L-天冬氨酸是本发明的目的。
由于为了完成上述目的而进行深入广泛地研究，本发明者从红球菌属细菌中分离出一种具有天冬氨酸酶活性的新的蛋白和编码该蛋白的基因。这样，本发明得以完成。
本发明涉及:
(1)一种具有天冬氨酸酶活性的蛋白，其具有显示于SEQ ID NO:1中的氨基酸序列或具有显示于SED ID NO:1中氨基酸序列但具有一个或更多个氨基酸的缺失、替代或添加；(2)编码该蛋白的基因DNA；(3)通过连接该基因DNA与载体质粒而获得的重组质粒；(4)通过将重组质粒导入宿主微生物而获得的转化子；
(5)用于通过培养该转化子而制备上面(1)中蛋白的方法；和(6)在上面(4)中的转化子或(1)中的蛋白存在下通过将延胡索酸或其盐与氨或其盐起反应而制备L-天冬氨酸的方法。
图．1为重组质粒PAR002的限制性图谱。双线代表载体PUC118，且单线代表EA4菌株的DNA区域。EA4菌株DNA区域中的黑体箭头表示由本发明发现的天冬氨酸酶基因的位置和方向。
图．2为重组质粒PAR016的限制性图谱。双线代表源自质粒PSJ034的区域，且单线代表EA4菌株的DNA区域。EA4菌株DNA区域中的黑体箭头显示由本发明发现的天冬氨酸酶基因的位置和方向。
图．3为解释质粒PSJ034的图。
图．4显示构建质粒PSJ034的步骤。
作为产生具有天冬氨酸酶活性本发明蛋白及编码该蛋白基因DNA的微生物的具体实例，可给出红球菌SP·EA4(FERM BP-6231)。
用于本发明的宿主微生物没有特别的限制。具体地，可列举上述的EA4菌株及胭脂红分枝杆菌ATCC12674、ATCC17041、ATCC17895、ATCC19140及ATCC33258。
这些菌株中，EA4菌株以上述的许可号保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，且其细菌学特征在日本未审查的专利公报NO·4-304892中加以描述。菌株ATCC12674、ATCC17041、ATCC17895、ATCC19140及ATCC33258可容易地从美国典型培养物保藏中心获得。
下面，将参照下面的实施例对本发明加以更为详细的描述，这决不意味着限制本发明的范围。实施例1(1)从EA4菌株中制备染色体DNA将EA4菌株在30℃于100ml MY培养(0.5％聚胨，0.3％bacto-酵母提取物，0.3％bacto-malt提取物，1％葡萄糖)中振荡培养72小时。然后，收获细胞并悬浮于4ml含盐的EDTA溶液中(0.1M EDTA,0.15M Nacl(PH8.0))。向悬液中加入8mg溶菌酶并于37℃振荡1-2小时。然后，将得到的悬液冷冻。随后，向其中加入10ml Tris-SDS溶液(1％SDS,0.1M Nacl,0.1M Tris-Hcl(PH9.0))并同时轻轻振荡。此外向其中加入蛋白酶K(Merck)(终浓度0.1mg/ml)并于37℃振荡1小时。向得到的悬液中加入等体积TE-饱和的酚(TE:10mMTris-Hcl,1mM EDTA(PH8.0))，摇匀并离心。收集上层物并向其中加入2体积的乙醇。然后，用玻棒缠绕DNA。用90％、80％及70％的乙醇以该顺序去除酚。随后，将DNA溶解于3ml TE缓冲液中。向此溶液中加入核糖核酸酶A溶液(100℃预处理15分钟)以得到10μg/ml的浓度并且于37℃振荡30分钟。此外，向其中加入蛋白酶K并于37℃振荡30分钟，然后加入TE-饱和的酚。将得到的溶液离心以分成上层和下层。对上层重复两次相同的操作。然后，向其中加入等体积氯仿和异戊醇的混合液(24∶1)，并且重复相同的提取操作(之后，此操作称为“酚处理”)。随后，向得到的上层物中加入2体积的乙醇，并且将DNA缠绕到玻棒上以获得染色体DNA样品。(2)探针的制备将10μl在步骤(1)中获得的染色体DNA(1/20稀释液)，10μl10×反应缓冲液，3μl 50mM MgCl2,2μl 10mM DNTP,1μl(相当于100pmol)每种显示于SEQ ID NO:4中的寡核昔酸作为引物#1及显示于SEQ ID NO:5中的寡核昔酸作为引物#2以及1μ1 Tag DNA聚合酶(GIBCO BRL)混合在一起以制备100μl的溶液。上面的每种引物根据在各种已知天冬氨酸酶中高度保守的区域加以设计。得到的溶液进行30轮孵育，每个循环由93℃变性30秒，55℃退火30秒及72℃延伸2分钟所组成。反应完成后，用氯仿抽提3次，接着通过乙醇沉淀回收扩增的DNA。用0.7％琼脂糖凝胶电泳分离该DNA以获得约600bp的DNA片段，该片段被认为是编码EA4菌株天冬氨酸酶基因的一部分。这样获得的DNA片段以DIG DNA标记试剂盒(宝灵曼)标记以制备探针。(3)DNA文库的制备向200mlEA4菌株染色体DNA中加入40μ110×限制酶缓冲液，145μl无菌水及15μl限制酶并于37℃反应6小时。然后，乙醇沉淀以回收DNA,并进行琼脂糖凝胶电泳。从凝胶中切下约8kb的DNA片段并且DNA PREP(DIAIATRON)进行回收。用连接试剂盒(Takara Shuzo)将此DNA片段插入到大肠杆菌载体PUC118的BamHI位点以制备重组DNA文库。
用于连接中的PUC118片段按如下制备。向10μl PUC118中，加入10μ110×限制酶溶液，77μl无菌水及2μl限制酶Bam HI并于37℃反应2小时。之后，进行酚处理和乙醇沉淀。将得到的DNA干燥且然后溶解于50μl无菌水中。向该溶液中加入1μl碱性磷酸酶，10μ110×缓冲液及39μl无菌水并于65℃反应。之后，进行酚处理和乙醇沉淀。将得到的DNA干燥并溶于无菌水中。(4)转化子的制备和重组DNA的筛选将大肠杆菌JM109菌株接种于1mlLB培养基(1％bacto-胰蛋白胨，0.5％bacto-酵母提取物，0.5％NoCl)并于37℃培养5小时。向100μl得到的培养物中加入50mlSOB培养基(2％bacto-胰蛋白胨，0.5％bacto-酵母提取物，10mM Nacl,2.5mM Kcl,1mM MgSO4lmM MgCl2)并于18℃培养20小时。然后，离心收获细胞。向该细胞中加入13ml冰凉的TF溶液(20mM PIPES-KOH(PH6.0),200mMKcl,10mM CaCl2,40mM MnCl2)，让其于0℃置10分钟并重新离心。去上清后，将沉淀的大肠杆菌悬于3-2ml的冰凉TF溶液中。向得到的悬液中加入0.22ml二甲基亚砜并让其于0℃放置10分钟。向200μl这样制备的感受总细胞中加入10μl含有上面步骤(3)中制备的重组质粒(即，DNA文库)溶液。然后，42℃热休克30秒，并将混合物于0℃冰凉2分钟。之后，向其中加入0.8ml SOC培养基(2％bacto-胰蛋白胨，0.5％bacto-酵母提取物，20mM葡萄糖，10MM NaCl,2.5MM KCl,1MM MgSO4,1MM MgCl2)。细胞于37℃振荡培养60分钟。将得到的培养物铺板于200μl等份的LB琼脂培养基上于30℃培养，培养基中含有100μl/ml氨苄青霉素。通过菌落杂交从生长于琼脂培养基一的转化子菌落中筛选具有天冬氨酸酶基因的转化子。简言之，将琼脂培养基上生长出的转化子菌落转移至尼龙膜(BIODYNEA；Nihm Pall有限公司)，接着裂解细胞并固定DNA。然后，以上面步骤(2)中制备的探针(约600kb片段)-处理膜。DIG发光检测试剂盒(宝灵曼)筛选含有感兴趣重组DNA的菌落。(5)重组质粒的制备将上面步骤(4)中筛选出的转化子于100ml LB培养基中于37℃培养过夜。收获细胞并以无菌水洗。向该细胞中加入5ml溶液Ⅰ(2mM葡萄糖，10mMEDTA,25mM Tris-Hcl(PH8.0))及25mg溶菌酶并让其于0℃放置30分钟。此外，加入10ml溶液Ⅱ(IN NaOH,5％SDS)并让其于0℃放置5分钟。之后，加入7.5ml溶液Ⅲ(3M醋酸钠(PH4.8))并让其于0℃放置30分钟。将得到的混合物离心。向上清中，加入50ml乙醇并再离心。然后，去上清。向沉淀中加入5ml溶液Ⅳ(10mM醋酸钠，50mMTris-Hcl(PH8.0))及2.5μl核糖核酸酶A溶液(10mg/ml)并让其于室温放置20分钟。向得到的混合物中，加入12ml乙醇。然后，离心回收质粒，以70％乙醇冲洗，干燥并溶解于0.4ml无菌水中。酚处理后，通过乙醇沉淀回收质粒，干燥并溶于0.4ml无菌水中。这样获得的重组质粒命名为PAR002。该重组质粒PAR002，已作为转化于大肠杆菌JM109/PAR002，以许可号FERM BP-6233保藏于日本通商产生省工业技术院生命工学工业技术研究所。(6)限制性图谱的制备和探针杂交区域的测定通过以几种限制酶消化在上面步骤(5)中获得的质粒PAR002而制备限制性图谱(
图1)。此外，PAR002以限制酶KpnⅠ、BgⅠⅡ、PstⅠ、SalⅠ等消化并进行琼脂糖凝胶电泳。然后，进行Southern杂交以确定探针杂交的片段。(7)核苷酸序列的测定在上面步骤(6)中确定区域的侧翼区核昔酸序列及确定区域本身的核昔酸序列用发码西亚荧光测序议ALFⅡ加以测定。结果，获得如SEQ ID NO:3中显示的核昔酸序列。其中发现了一个开放阅读框，其具有显示于SEQ ID NO:1中的氨基酸序列。与氨基酸序列数据库NBRF(国立生物医学研究基地)比较，发现目的基因与已知的天冬氨酸酶在氨基酸序列水平有50-60％的同源性；并且目的多肽也在已知天冬氨酸酶高度同源区具有高度同源性。因此，认为此多肽可能为一种新的天冬氨酸酶。此开放阅读框的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:2中。实施例2(1)质粒PAR016的制备将10μl PAR002(1/20稀释液)，10μl 10×反应缓冲液，3μ1 50mMMgCl2,2μl 10mM 4NTP,1μl(相当于100pmol)显示于SEQ ID NO:6中的每种寡核昔酸作为引物#3和显示于SEQ ID NO:7中的寡核昔酸作为引物#4以及1μl Tag DNA聚合酶(GIBCO BRL)混合到一起以制备100μl溶液。设计引物是为了扩增出含有EA4天冬氨酸酶ORF的片段。将这样制备的溶液进行30轮PCR循环，每个循环由93℃变性30秒，55℃退火30秒及72℃延伸2分钟所组成。反应完成后，氯仿抽提3次，接着通过乙醇沉淀以回收扩增的DNA，随后，将回收的DNA以限制酶×baI和Sse838I消化，且然后通过0.7％琼脂糖凝胶电泳分离。从凝胶中回收1.2kb的条带并插入到红球属细菌具有强启动子活性质粒pSJ034的×baI-Sse8387I位点(图3)中以制备重组质粒PAR016(图·2)．根据图4显示的步骤根据质粒pSJ023(在日本专利申请说明书NO.9-65616中描述过)制备质粒pSJ034。质粒pSJ023作为转化子紫红红球菌ATCC12674/pSJ023以许可号FERM BP-6232保藏于日本通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所。(2)红球菌属细菌的转化及在得到转化子中的天冬氨酸酶活性离心收集对数生长期的紫红红球菌ATCC12674菌株的细胞，以冰凉的无菌水洗3次并悬于无菌水中。将10μl该细胞悬液与1μl质粒pAR016混合且使之冰凉。将该DNA和细胞的混合物置于小杯中。然后，且基因脉冲仪(伯乐)，向其中应用2.0kv及200Ω的电脉冲。将这样处理的液体冰凉静置10分钟，且然后37℃热休克10分钟。之后，加入500ml MYK培养基(0.5％聚胨，0.3％bacto-酵母提取物，0.3％bacto-malt提取物，0.2％K2HPO4,0.2％KH2PO4)并于30℃静置5小时。然后，将得到的混合物铺板于含有50μg/ml卡那霉素的MYK琼脂培养基上并于30℃培养3天。
将这样制备的红球菌属细菌转化子接种到10ml MYK培养基上(含有50μg/ml卡那霉素)并于30℃培养72小时作为预培养物。将1％的预培养物接种到10ml MYK培养基(含50μg/ml卡那霉素)上并于30℃培养96小时。然后，离心收获细胞，以100mM磷酸缓冲液(PH8.0)洗并悬浮于少量的缓冲液中。将该细胞悬液在冰凉条件下超声粉碎并离心以获得粗酶溶液，检测其中的天科氨酸酶活性。作为对照，使用没有添加卡那霉素培养而获得的ATCC12674菌株。
按下述检测天冬氨酸酶活性。简言之，将1.0M的延胡索酸铵(ammoniumfumrate)/1mM氯化镁(PH8.8)与该粗酶溶液接触。然后，用ODS柱通过HPLC定量检测于30℃ 60分钟产生的天冬氨酸。结果，发现天冬氨酸活性在导入质粒的转化子中增加。
产生的L-天冬氨酸(mM)ATCC 12674/PAR 016322ATCC 126740.1实施例3(1)按实施例2中相同的方式将质粒PAR016导入ATCC17895和ATCC19140以制备红球菌属细菌的转化子。这些转化子中的每种接种至10ml MYK培养基(含50μg/ml卡那霉素)于30℃培养72小时作为预培养物。将1％的该预培养物接种至100ml GGPK培养基(1.5％葡萄糖，1％谷氨酸钠，0.1％bacto-酵母提取物，0.5％K2HPO4,0.5％KH2PO4,0.5％MgSO4.7H2O,PH7.2)(含有50％μg/ml卡那霉素)并于30℃培养96小时。离心收获细胞，以100mM磷酸缓冲液(PH8.0)洗并悬浮于少量的缓冲液中。用得到的细胞悬液，进行天冬氨酸制备反应。简言之，将该细胞悬液添加到100ml 1.0M延胡索酸铵/1mM氯化镁(PH8.8)中并于30℃搅拌20小时。作为对照，使用没有添加卡那霉素而培养的ATCC12674菌株。用ODS柱通过HPLC定量测定上面反应(30℃20小时)中产生的天冬氨酸而测定天冬氨酸酶活性。结果，发现天冬氨酸酶活性在导入质粒的转化子中增加。
产生的L-天冬氨酸(mM)ATCC 17895/pAR016990ATCC 17895 5ATCC 19140/pARO16985ATCC 19140 8根据本发明，提供了一种编码具有天冬氨酸酶活性新蛋白的基因。通过用具有多拷贝该基因的转化子生物，可从延胡索酸和氨有效地制备L-天冬氨酸。
序列表(2)SEQ ID NO:1信息(ⅰ)序列特征(A)长度477个氨基酸(8)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型蛋白(ⅵ)最初来源(A)有机体红球菌属(B)菌株EA4(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:Met Thr Met Arg Ile Glu His Asp Leu Leu Gly Asp Arg Glu Val Pro1 5 10 15Ala Glu Ala Tyr Tyr Gly Ile His Thr Leu Arg Ala Leu Glu Asn Phe20 25 30Pro Ile Thr Gly Ile Pro Leu Ser Val His Pro Asp Met Val Ser Ala35 40 45Leu Ala Ala Val Lys Gln Ala Ala Ala Arg Ala Asn Ala Asp Leu Gly50 55 60Ile Leu Ser Pro Glu His Ala Ala Ala Ile Glu Gln Ala Cys Lys Glu65 70 75 80Ile Arg Ala Gly Arg Phe Thr Asp Gln Phe Val Val Asp Val Ile Gln85 90 95Gly Gly Ala Gly Thr Ser Ser Asn Met Asn Ala Asn Glu Val Val Ala100 105 110Asn Arg Ala Leu Glu Ile Leu Gly Gly Glu Arg Gly Gln Tyr Gln Phe115 120 125Leu His Pro Leu Glu His Val Asn Met Ser Gln Ser Thr Asn Asp Val130 135 140Tyr Pro Thr Ala Ile Lys Ile Gly Leu Gln Gly Ala Val Thr Arg Leu145 150 155 160Arg Gly Ala Met Asp Glu Leu Ala Gly Ala Phe Ala Glu Lys Ala Ala165 170 175Glu Phe Ser His Val Leu Lys Val Gly Arg Thr Gln Leu Gln Asp Ala180 185 190Val Pro Met Thr Leu Gly Gln Glu Ile Val Thr Phe Ala Val Met Ile195 200 205Lys Glu Asp Ser Gln Arg Leu Glu Glu Ala Ala Arg Leu Ile Ser Glu210 215 220Ile Asn Leu Gly Gly Thr Ala Ile Gly Thr Gly Leu Asn Ala His Pro225 230 235 240Glu Tyr Ala Arg Arg Val Arg Glu His Leu Val Ser Ile Thr Gly Leu245 250 255Asp Ile Ser Thr Ala Ser Asp Leu Ile Glu Ala Thr Gln Asp Val Gly260 265 270Ala Phe Val Gln Leu Ser Gly Val Leu Lys Arg Thr Ala Val Lys Leu275 280 285Ser Lys Ile Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu Ser Ser Gly Pro Arg Ala290 295 300Gly Leu Gly Glu Ile Asn Leu Pro Ala Val Gln Ala Gly Ser Ser Ile305 310 315 320Met Pro Gly Lys Val Asn Pro Val Ile Pro Glu Val Val Asn Gln Ile
325 330 335Ala Tyr Arg Val Val Gly Asn Asp Leu Thr Ile Thr Met Ala Ala Glu340 345 350Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Ala Phe Glu Pro Val Ile Ala His Ser355 360 365Leu Phe Glu Thr Ala Glu Leu Leu Thr Arg Gly Cys Thr Val Leu Arg370 375 380Glu Arg Cys Val Ile Gly Ile Thr Ala Asn Val Glu His Leu Glu Arg385 390 395 400Thr Val Ala Ala Ser Ile Gly Val Val Thr Ala Leu Asn Pro Tyr Ile405 410 415Gly Tyr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Ala Ala Asp Ala Leu Ala Ser Gly420 425 430Arg Thr Val Val Glu Leu Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu Gly Lys Glu435 440 445Asp Leu Asp Ala Ile Met Glu Pro Ala Asn Leu Ala Arg Thr Ala Ile450 455 460Val Ser Ala Pro Asp Phe Asp Pro Leu Val Pro Ser Thr465 470 475(2)SEQ ID NO:2信息(ⅰ)序列特征(A)长度1434个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅵ)最初来源(A)有机体红球菌属(B)菌株EA4(ⅸ)特征(A)名字/关键CDS(B)位置1…1431(ⅹⅰ)序列描述SED ID NO:2ATG ACG ATG CGC ATC GAG CAC GAC CTG CTC GGT GAT CGC GAA GTG CCT 48Met Thr Met Arg Ile Glu His Asp Leu Leu Gly Asp Arg Glu Val Pro1 5 10 15GCG GAG GCC TAC TAC GGC ATC CAC ACG CTG AGA GCA CTG GAG AAC TTC 96Ala Glu Ala Tyr Tyr Gly Ile His Thr Leu Arg Ala Leu Glu Asn Phe20 25 30CCG ATC ACC GGT ATT CCT CTC TCG GTC CAC CCG GAC ATG GTA TCG GCG 144Pro Ile Thr Gly Ile Pro Leu Ser Val His Pro Asp Met Val Ser Ala35 40 45TTG GCT GCG GTC AAG CAG GCC GCT GCT CGG GCG AAC GCC GAC CTC GGA 192Leu Ala Ala Val Lys Gln Ala Ala Ala Arg Ala Asn Ala Asp Leu Gly50 55 60ATC CTC TCG CCC GAG CAT GCA GCG GCG ATC GAG CAA GCT TGC AAG GAG 240Ile Leu Ser Pro Glu His Ala Ala Ala Ile Glu Gln Ala Cys Lys Glu65 70 75 80ATT CGT GCG GGC AGG TTC ACC GAC CAG TTC GTC GTC GAC GTC ATT CAG 288Ile Arg Ala Gly Arg Phe Thr Asp Gln Phe Val Val Asp Val Ile Gln85 90 95GGT GGT GCC GGC ACG TCA TCG AAC ATG AAC GCC AAC GAA GTG GTC GCG 336Gly Gly Ala Gly Thr Ser Ser Asn Met Asn Ala Asn Glu Val Val Ala100 105 110AAC CGC GCG CTC GAA ATT CTC GGC GGC GAA CGG GGG CAG TAC CAA TTC 384Asn Arg Ala Leu Glu Ile Leu Gly Gly Glu Arg Gly Gln Tyr Gln Phe115 120 125CTC CAT CCG CTC GAA CAC GTC AAC ATG AGT CAG AGC ACC AAC GAC GTC 432Leu His Pro Leu Glu His Val Asn Met Ser Gln Ser Thr Asn Asp Val130 135 140TAC CCC ACC GCG ATC AAA ATC GGC TTG CAA GGT GCC GTC ACC AGG CTT 480Tyr Pro Thr Ala Ile Lys Ile Gly Leu Gln Gly Ala Val Thr Arg Leu145 150 155 160CGA GGT GCG ATG GAC GAA CTT GCA GGC GCA TTC GCG GAG AAA GCA GCC 528Arg Gly Ala Met Asp Glu Leu Ala Gly Ala Phe Ala Glu Lys Ala Ala165 170 175GAG TTC TCC CAC GTG CTC AAG GTC GGG CGG ACT CAG TTG CAA GAC GCG 576Glu Phe Ser His Val Leu Lys Val Gly Arg Thr Gln Leu Gln Asp Ala180 185 190GTC CCG ATG ACT CTC GGT CAA GAG ATT GTC ACG TTC GCC GTG ATG ATC 624Val Pro Met Thr Leu Gly Gln Glu Ile Val Thr Phe Ala Val Met Ile195 200 205AAG GAG GAC TCT CAG AGA CTG GAA GAG GCC GCT CGG TTG ATC TCG GAG 672Lys Glu Asp Ser Gln Arg Leu Glu Glu Ala Ala Arg Leu Ile Ser Glu210 215 220ATC AAC CTG GGA GGG ACG GCG ATA GGT ACC GGT CTC AAT GCG CAC CCG 720Ile Asn Leu Gly Gly Thr Ala Ile Gly Thr Gly Leu Asn Ala His Pro225 230 235 240GAG TAC GCC AGA CGT GTG CGT GAG CAT CTG GTG TCG ATC ACC GGT CTC 768Glu Tyr Ala Arg Arg Val Arg Glu His Leu Val Ser Ile Thr Gly Leu245 250 255GAC ATC TCG ACG GCA TCG GAT CTC ATC GAA GCA ACC CAG GAC GTC GGG 816Asp Ile Ser Thr Ala Ser Asp Leu Ile Glu Ala Thr Gln Asp Val Gly260 265 270GCC TTC GTT CAG CTG TCG GGA GTG CTC AAG CGT ACC GCG GTC AAA CTG 864Ala Phe Val Gln Leu Ser Gly Val Leu Lys Arg Thr Ala Val Lys Leu275280 285TCC AAG ATC TGC AAC GAT CTG AGA TTG CTG TCC TCA GGC CCA CGA GCA 912Ser Lys Ile Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu Ser Ser Gly Pro Arg Ala290 295 300GGT CTG GGT GAG ATC AAT TTA CCT GCG GTG CAG GCA GGT TCG TCG ATC 960Gly Leu Gly Glu Ile Asn Leu Pro Ala Val Gln Ala Gly Ser Ser Ile305 310 315 320ATG CCC GGA AAG GTC AAT CCG GTC ATT CCG GAA GTG GTC AAT CAG ATT 1008Met Pro Gly Lys Val Asn Pro Val Ile Pro Glu Val Val Asn Gln Ile325 330 335GCC TAC CGG GTG GTG GGA AAC GAT CTG ACC ATC ACC ATG GCT GCC GAG 1056Ala Tyr Arg Val Val Gly Asn Asp Leu Thr Ile Thr Met Ala Ala Glu340 345 350GCG GGT CAA CTG CAG CTC AAC GCA TTC GAA CCG GTC ATT GCA CAC AGC 1104Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Ala Phe Glu Pro Val Ile Ala His Ser355 360 365TTG TTC GAG ACT GCA GAA CTC CTC ACG CGG GGC TGC ACT GTG TTG CGC 1152Leu Phe Glu Thr Ala Glu Leu Leu Thr Arg Gly Cys Thr Val Leu Arg370 375 380GAG CGA TGC GTG ATC GGC ATT ACC GCC AAC GTC GAG CAT CTC GAA CGA 1200Glu Arg Cys Val Ile Gly Ile Thr Ala Asn Val Glu His Leu Glu Arg385 390 395 400ACG GTC GCG GCT TCG ATC GGT GTC GTG ACC GCG CTC AAT CCC TAC ATC 1248Thr Val Ala Ala Ser Ile Gly Val Val Thr Ala Leu Asn Pro Tyr Ile405 410 415GGC TAC ACA GCC GCG ACG GAA TTG GCG GCG GAC GCG CTT GCT TCC GGT 1296Gly Tyr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Ala Ala Asp Ala Leu Ala Ser Gly420 425 430CGT ACC GTC GTG GAG TTG GTG CTC GAA CGC GGG TTG TTG GGC AAG GAG 1344Arg Thr Val Val Glu Leu Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu Gly Lys Glu435 440 445GAT TTG GAC GCG ATC ATG GAG CCT GCG AAT TTG GCA CGA ACT GCG ATC 1392Asp Leu Asp Ala Ile Met Glu Pro Ala Asn Leu Ala Arg Thr Ala Ile450 455 460GTG TCG GCT CCC GAT TTC GAT CCA CTC GTC CCG TCG ACC TGA1434Val Ser Ala Pro Asp Phe Asp Pro Leu Val Pro Ser Thr465 470 475(2)SED ID NO:3信息(ⅰ)序列特征(A)长度1912个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅵ)最初来源(A)有机体红球菌属(B)菌株EA4(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:TTCGAAGCCA CGCCCGTTCA GGTGACCTGC GTGCGGCGAA GTTCGGTGGA GCCGAACTAC 60CGTGGGGCGA GATCCCGGTG GCGGCAAACC TCAAATGACG ATGCGCATCG AGCACGACCT120GCTCGGTGAT CGCGAAGTGC CTGCGGAGGC CTACTACGGC ATCCACACGC TGAGAGCACT180GGAGAACTTC CCGATCACCG GTATTCCTCT CTCGGTCCAC CCGGACATGG TATCGGCGTT240GGCTGCGGTC AAGCAGGCCG CTGCTCGGGC GAACGCCGAC CTCGGAATCC TCTCGCCCGA300GCATGCAGCG GCGATCGAGC AAGCTTGCAA GGAGATTCGT GCGGGCAGGT TCACCGACCA360GTTCGTCGTC GACGTCATTC AGGGTGGTGC CGGCACGTCA TCGAACATGA ACGCCAACGA420AGTGGTCGCG AACCGCGCGC TCGAAATTCT CGGCGGCGAA CGGGGGCAGT ACCAATTCCT480CGATCCGCTC GAACACGTCA ACATGAGTCA GAGCACCAAC GACGTCTACC CCACCGCGAT540CAAAATCGGC TTGCAAGGTG CCGTCACCAG GCTTCGAGGT GCGATGGACG AACTTGCAGG600CGCATTCGCG GAGAAAGCAG CCGAGTTCTC CCACGTGCTC AAGGTCGGGC GGACTCAGTT660GCAAGACGCG GTCCCGATGA CTCTCGGTCA AGAGATTGTC ACGTTCGCCG TGATGATCAA720GGAGGACTCT CAGAGACTGG AAGAGGCCGC TCGGTTGATC TCGGAGATCA ACCTGGGAGG780GACGGCGATA GGTACCGGTC TCAATGCGCA CCCGGAGTAC GCCAGACGTG TGCGTGAGCA840TCTGGTGTCG ATCACCGGTC TCGACATCTC GACGGCATCG GATCTCATCG AAGCAACCCA900GGACGTCGGG GCCTTCGTTC AGCTGTCGGG AGTGCTCAAG CGTACCGCGG TCAAACTGTC960CAAGATCTGC AACGATCTGA GATTGCTGTC CTCAGGCCCA CGAGCAGGTC TGGGTGAGAT 1020CAATTTACCT GCGGTGCAGG CAGGTTCGTC GATCATGCCC GGAAAGGTCA ATCCGGTCAT 1080TCCGGAAGTG GTCAATCAGA TTGCCTACCG GGTGGTGGGA AACGATCTGA CCATCACCAT 1140GGCTGCCGAG GCGGGTCAAC TGCAGCTCAA CGCATTCGAA CCGGTCATTG CACACAGCTT 1200GTTCGAGACT GCAGAACTCC TCACGCGGGG CTGCACTGTG TTGCGCGAGC GATGCGTGAT 1260CGGCATTACC GCCAACGTCG AGCATCTCGA ACGAACGGTC GCGGCTTCGA TCGGTGTCGT 1320GACCGCGCTC AATCCCTACA TCGGCTACAC AGCCGCGACG GAATTGGCGG CGGACGCGCT 1380TGCTTCCGGT CGTACCGTCG TGGAGTTGGT GCTCGAACGC GGGTTGTTGG GCAAGGAGGA 1440TTTGGACGCG ATCATGGAGC CTGCGAATTT GGCACGAACT GCGATCGTGT CGGCTCCCGA 1500TTTCGATCCA CTCGTCCCGT CGACCTGACC AGGTCTTCAG GGCGGTTGAC ACCGCACATG 1560TGGGCGGTAT CGTTTAGTGA TACGTATAAC TACTTGCAGT CCTGTTGTGT 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1.一种蛋白质，它具有天冬氨酸酶活性且具有显示于SED ID NO:1中的氨基酸序列或具有显示于SED ID NO:1中的，具有一个或更多个氨基酸缺失、替代或添加的氨基酸序列。
2.编码权利要求1的蛋白质的基因DNA。
3.权利要求2的基因DNA，其中的DNA具有显示于SED ID NO:2中的核苷酸序列。
4.权利要求2的基因DNA，其中的DNA源自红球菌属细菌。
5.权利要求4的基因DNA，其中的红球菌属细菌为红球菌EA4菌株。
6.约600bp大小的DNA片段，其可用由SEQ ID NO:4和5分别代表的合成DNA扩增。
7.通过将权利要求2的基因DNA与载体质粒连接而获得的重组质粒。
8.通过将权利要求2的基因DNA和能在红球菌属细菌中复制和扩增的DNA区域连接到载体质粒而获得的重组质粒。
9.通过将重组质粒导入权利要求7和8的宿主微生物中而获得的转化子。
10.权利要求9的转化子，其中的宿主微生物为红球菌属细菌。
11.通过培养权利要求10的转化子而制备权利要求1的蛋白质的方法。
12.用于通过在权利要求10的转化子或权利要求1的蛋白质存在下将延胡索酸或其盐与氨或其盐反应而制备L-天冬氨酸的方法。
全文摘要
本发明提供了一种具有天冬氨酸酶活性的新蛋白、编码该蛋白的基因DNA、包括该基因DNA的重组质粒、导入有该重组质粒的转化子、及用该转化子制备L－天冬氨酸的方法。通过使用具有多拷贝上述基因的本发明转化子微生物,可从延胡索酸和氨有效地制备L－天冬氨酸。
文档编号C12R1/01GK1211619SQ98102480
公开日1999年3月24日 申请日期1998年6月6日 优先权日1997年6月6日
发明者渡辺文昭, 汤不二夫 申请人:日东化学工业株式会社