专利名称：制备具有天然n-末端序列的重组抑肽酶和重抑肽酶变异体的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备具有天然N-末端序列的重组抑肽酶和重组抑肽酶变异体的方法，其中生产出的重组抑肽酶和/或重组抑肽酶变异体是经过均匀加工过的分泌蛋白质。
抑肽酶也称为“牛胰蛋白酶抑制剂”(BPTI).属于Kunitz-型抑制剂簇。其抑制的丝氨酸蛋白酶的范围包括，例如，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，纤维蛋白溶酶和血浆激肽释放酶(W.Gebhard，H.Tschesche and H.Fritz，Proteinase Inhibitors，Barrett andSalvesen(eds.)，Elsevier Science Publ.BV 375-387，1986)。
抑肽酶由58个氨基酸组成。利用X-射线结构分析法和NMR分光镜检查已阐明了该蛋白质的三维空间结构(Wlodawer et al.，J.Mol.Biol.198(3)，69-480，1987Wagner et al.，J.Mol.Biol.196(1)，227-231，1987Berndr et al.，Biochemistry 32(17)，4564-4570，1993)。
商品名为Trasylol的天然抑肽酶用于治疗胰腺炎，直至今日，在开放性心脏外科手术中也使用Trasylol，因为临床研究已经证实用抑肽酶治疗可显著地降低这类手术中血液损失并可使手术后出血减少(Bistrup et al.，Lancet 1，366-367，1988)。
在第15位具有不同氨基酸的抑肽酶变异体对胰腺和白细胞产生的弹性硬蛋白酶以及蛋白酶组织胰蛋白酶G具有很强的抑制活性(Tschesche et al.，U.S.Patent 4,595,674)。
在第15位含有精氨酸的抑肽酶变异体比天然抑肽酶具有更高的对血浆激肽释放酶的亲合性。
已经有人报导了重组抑肽酶在大肠杆菌K12中的表达(Auerswaldet al.，Biol.Chem.Hoppe Seyler 369，27-35，1988)以及在酵母中的表达(EP 0419878)。
在酵母系统中，已将酵母分泌蛋白的信号序列，例如α-交配因子的信号序列连接到抑肽酶变异体的N-末端。前原-α因子/抑肽酶融合蛋白的加工需要两种不同的蛋白水解酶活性。定位于内质网膜上的所谓的信号肽酶首先在融合蛋白的19和20位氨基酸之间切割。由此产生的前-α因子/抑肽酶已在原位被糖苷化，再用能特异性识别二碱性氨基酸对Lys-Arg的蛋白内切酶将其切割。该蛋白内切酶是KexII基因的产物。KexII蛋白酶的切割作用导致抑肽酶的释放和分泌(A.J.Brake，Metbods in Enzymology 185，408-421，1990；Das et al.，Biotechn.Progress 3，43-48，1987)。
但是，就重组抑肽酶和抑肽酶变异体而言，发现KexII蛋白酶不能切割具有天然N-末端序列“Arg-Pro-Asp”的抑肽酶。因此表达一种被均匀地、正确地加工的分泌抑肽酶是不可能的。
通过改变抑肽酶的N-末端序列可能解决该加工问题(EP0419878)，即通过在第2位缺失脯氨酸或通过在2和1位插入丙氨酸和谷氨酰胺。由这些改变所产生的抑肽酶被正确处理的比例很高。
但是，为了在酵母系统中实现正确的加工作用而改变抑肽酶或抑肽酶变异体的N-末端并不令人满意。因为任何一种N-末端改变的抑肽酶会激发免疫反应。
因此本发明的目的是提供一种制备具有天然N-末端序列“Arg-Pro-Asp”的重组抑肽酶或重组抑肽酶变异体的方法，其中产生的重组抑肽酶和/或重组抑肽酶变异体是已经过均匀加工的分泌蛋白质。
令人惊奇的是，通过从前原-α因子/抑肽酶融合构建体中缺失整个α因子原序列可以达到该目的。因此，在这种情况下，直接将因子前序列连接到抑肽酶序列。该构建体的加工仅需要信号肽酶。很大比例的重组抑肽酶和/或重组抑肽酶变异体被正确地加工并被分泌到培养基中。当使用具有缺失α因子原序列的如本发明所述的构建体时，不包含这种酵母系统中的分泌蛋白质的经典途径，即需要KexII蛋白酶活性的途径。
WO 89/01968也描述了一种基于α-交配因子的信号序列并且可以在酵母系统中表达具有天然N-末端的抑肽酶的方法。但是，由于该方法明显地使用了KexII蛋白酶的水解活性，因而并不适合于制备具有经过正确加工的天然N-末端序列的重组抑肽酶和重组抑肽酶变异体。
下面介绍在具有天然N-束端序列的重组抑肽酶和重组抑肽酶变导体的克隆、发酵和纯化过程中使用的方法。
方法酶所使用的酶(限制性核酸内切酶，小牛肠道碱性磷酸酶，T4多核苷酸激酶和T4 DNA连接酶)购自于Boehringer Mannheim和GIBCO-BRL并按照制造商的说明使用。
分子生物学技术常规的克隆操作，例如从大肠杆菌分离质粒DNA(所谓的小制剂)以及用质粒DNA转化大肠杆菌，按照Sambrook et al.所述进行(Holecular Cloning，Cold Spring Harbor，1989)。大肠杆菌菌株SURE(Stratagene)是主要的用于转化的宿主生物体。使用Quiagen柱(Diagen)分离较大量的质粒DNA。按照制造商(Genomed)的说明使用Jetsorb从琼脂糖凝胶上提取DNA片段。
使用Applied Biosystems生产的380A DNA合成仪制备用于位点特异性诱变的寡核苷酸(缺失α因子原序列)以及用于测序的引物。使用Amersham-Buchler生产的试剂盒(寡核苷酸特异的体外诱变系统，版本2.1)以及根据Eckstein的方法(Taylor et al.，Nucl.Acids Res.13，8764-8785，1985)进行诱变试验。通过对单链或双链DNA进行测序来验证所有载体构建及诱变试验。为了该目的使用US Biochemical Corporation生产的试剂盒(测序酶，版本2.1)。
啤酒酵母的转化在10ml YEPD(2％葡萄糖2％蛋白胨1％ Difco酵母提取物)中生长酵母细胞，例如SC 125A菌株(MATa，ura 3-52，suc2)并当OD600nm值为0.6至0.8时收集细胞。用5ml溶液A(1M山梨醇；10mM N-二(羟乙基)甘氨酸，pH8.353％乙二醇)洗涤细胞，重悬于0.2ml溶液A中并贮存于-70℃。
将质粒DNA(5μg)以及载体DNA(50μg的鲱鱼精子DNA)加到冷冻细胞中。然后在37℃振动5分钟而将细胞融化。在加入1.5ml溶液B(40％PEG 1000200mM N-二(羟乙基)甘氨酸)以后，将细胞在30℃保温60分钟，并用1.5ml溶液C(0.15M NaCl10mM N-二(羟乙基)甘氨酸，pH8.35)洗涤并重悬于100μl溶液C中。然后将在含有2％琼脂的选择培养基平皿上铺开培养。在30℃培养3天后得到转化体。
酵母细胞发酵营养液为了表达具有正确N-末端氨基酸序列的抑肽酶或抑肽酶变异体，将下列营养液用于发酵酵母细胞
将所述成分在蒸馏水中混合并将pH调至5.5。将该溶液在121℃灭菌20分钟。将葡萄糖溶于1/5所需体积的蒸馏水中并将该溶液单独灭菌，待冷却后，将其加到剩下的营养液中。
菌株原液用2ml的等分量预培养液装到贮存小瓶中制备所有酵母转化体的菌原液，并将菌原液贮存于液氮中。
预培养物在装有200ml SD2营养液的1升摇瓶中进行预培养发酵。用菌原液或从SD2琼脂平板上得到的单个克隆接种到摇瓶中。在26-30℃温度下将培养物连续振荡培养2-3天。
主培养物发酵主培养发酵是利用10升带搅拌装置的发酵罐在Sc6营养液中完成。用占3-5％体积的预培养物接种发酵罐。该接种预培养物是将预培养得到的菌液离心后得到的沉淀并在接种前重悬于Sc6培养基中得到的生物质。10升主培养的发酵条件如下温度 26-30℃搅拌器旋转速率600rpm通气速率 0.5vvmpH固定点 5.5(用5N NaOH和5N H2SO4校正)当已发酵5小时时，培养物连续供应葡萄糖和酵母提取物。根据培养物的呼吸商(RQ值)调节加料速率。RQ固定点为1.0。加料溶液具有下列组分葡萄糖 500g/lDifco酵母提取物 75g/l将各个组分分别溶解于蒸馏水中并在121℃灭菌20分钟。一旦冷却后将两种溶液合并。
如果使用诱导型Gal 10启动子，或Gal 10启动子的衍生物时，通过将加料溶液中的碳水化合物由葡萄糖(500g/l)更换为半乳糖(500g/l)时可实现诱导作用。此后，不再用RQ值调节加料速率。将加料速率手工调节至诱导时加料速率的二倍。在发酵48小时后一般可诱导Gal 10启动子。
细胞收集发酵完成后(80-120小时)，将发酵罐内物质冷却到10-15℃，并通过标准离心技术(例如桶式离心机)或利用横向流动微过滤(例如Filtron Minisette系统)将酵母细胞与培养液分离开。如果必要，洗涤细胞，通过过滤将培养液灭菌。如果有异源蛋白分泌，则从无细胞培养液中纯化产物；如果表达是细胞内进行，则将生物质用于纯化。
分析方法按照US-PS 5,164,482描述的方法进行N-末端序列测定，氨基酸分析和弹性硬蛋白酶及胰蛋白酶抑制试验。
下列的实施例，附图及序列资料对本发明作更详细解释
图1显示大肠杆菌/酵母穿梭载体pA228的限制性图谱，并绘制了该载体的主要成分。
图2显示了在α因子原序列缺失之前或之后，前原-α因子/抑肽酶融合构建体的关键序列(核苷酸和氨基酸)。还指出了限制性核酸内切酶HindIII的识别位点以及信号肽酶和KexII蛋白酶的切割位点。
实施例实施例1用于分泌具有天然N-末端序列“Arg-Pro-Asp”的重组Arg-15抑肽酶的酵母表达载体的制备以大肠杆菌/酵母穿梭载体pA228(图1)作为起始材料用于构建酵母分泌载体，其中Arg-15抑肽酶序列直接连接到α因子前序列上。
pA228载体携带一个氨苄青霉素抗性基因(bla)和URA3基因，分别作为大肠杆菌和酵母的选择性标记基因。该载体的其他主要成分是Col E1和2μ的复制原点(ori)。REP3位点也定位于2μ-区1300bp EcoRI/HindIII片段携带了GAPDH启动子和酵母α因子前体蛋白的N-末端前原序列(Kurjan and Herskowitz，Cell 30，933-943，1982)。通过插入HindIII/BamHI片段形式的经修饰的Arg-15抑肽酶cDNA而在α因子前原序列中恢复了KexII蛋白酶的识别位点(“Lys-Arg”)(EP 0419878)。
在Arg- 5抑肽酶序列的3′末端，该载体携带了来自酵母URA3基因的BamHI/SalI片段，该片段在该位点作为转录终止信号起作用(Yarger et al.，Mol.Cell.Biol.6，1095-1101，1986)。
用限制性核酸内切酶EcoRI和BamHI切割pA228载体。得到的1500-bp DNA片段携带了GAPDH启动子，α因子前原序列以及Arg-15抑肽酶基因的序列信息，将该片段克隆到另用EcoRI和BamHI切割的M13mp19载体上。利用下列寡核苷酸制备单链DNA并用于进行缺失诱变。5’GCAGCATCCTCCGCATTAGCTCGTCCGGACTTCTGCCTCGAG 3’利用双链M13 RF DNA(复制型)以限制性分析方法来筛选噬菌斑。借助于利用HindIII限制性酶消化可以鉴别阳性克隆，因为缺失α-因子原序列的结果是HindIII切割位点消失。还可以通过测序来验证α因子原序列的缺失以及α因子前序列与Arg-15抑肽酶基因的正确连接(图2)。利用EcoRI和BamHI从选择出的M13mp19克隆中切除1300bpDNA片段，并通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化，再克隆到另用EcoRI和BamHI切割的pA228载体上，然后凝胶纯化。用该克隆操作中产生的pAPO2载体转化酵母细胞(SC 125A)。
可以同样方式制备其他的具有不同启动子，例如组成型MFα1或诱导型GAL 10启动子的大肠杆菌/酵母穿梭载体，并也导致分泌出具有天然N末端的抑肽酶以及抑肽酶变异体。
另外，也可以使用具有不同酵母复制原点，例如，染色体自复制片段(ars)的穿梭载体。
除URA3基因以外的合适的选择性标记基因是那些帮助自养型突变酵母变为异养型的基因，例如LEU2，HIS3或TRP1基因。当然，也可以使用其产物能介导对各种抗生素具有抗性的基团，例如氨基糖苷G418。
不仅在啤酒酵母中可以表达具有天然N-末端序列的抑肽酶和抑肽酶变异体。其他酵母，例如，粟酒裂殖糖酵母或甲基营养型酵母巴斯德华赤氏酵母和多形汉逊氏酵母，也适用于此目的。
除前α-因子信号序列外，也可应用其它信号序列，例如磷酸酶(PHO1和PHO5)以及转化酶信号序列，因为在加工过程中所需的仅是信号序列。
实施例2利用组成型启动子表达具有天然N-末端氨基酸序列的抑肽酶和抑肽酶变异体在28℃，以10升规模培养携带pAPO2载体或具有组成型启动子(例如α-交配因子(MFα1)启动子，GAPDH启动子或TPI启动子)的该载体类似物的酵母转化体。在发酵期间，利用弹性硬蛋白酶抑制试验(如果表达的是Val 15抑肽酶，Val 15-Leu 17抑肽酶或Val 15-Leu 17-Arg 19抑肽酶)或利用胰蛋白酶抑制试验(如果表达的是抑肽酶，Arg 15抑肽酶或Arg 15-Ala 17抑肽酶)来定量分析产物。发酵持续96小时，在发酵结束时生物质浓度是31克干重/升。产物的浓度是约10mg/l。在离心分离细胞(15分钟，6500×g，4℃)以及过滤灭菌后，从无细胞培养液中纯化产物。
实施例3利用诱导型启动子表达具有天然N-末端氨基酸序列的抑肽酶的抑肽酶变异体在28℃，以10升规模培养携带了具有诱导型启动子(例如Gal 10启动子或Gal 10启动子衍生物)的pAPO2载体类似物的酵母转化体。在发酵48小时后，通过将加料溶液中使用的碳水化合物由葡萄糖改变为半乳糖而进行诱导。在发酵期间，利用弹性硬蛋白酶抑制试验(如果表达的是Val 15抑肽酶，Val 15-Leu 17抑肽酶或Val 15-Leu 17-Arg 19抑肽酶)或利用胰蛋白酶抑制试验(如果表达的是抑肽酶，Arg 15抑肽酶或Arg 15-Ala 17抑肽酶)定量分析产物。发酵持续96小时。在发酵结束时获得的生物质浓度是24克干重/升；获得的产物浓度是约15mg/l。在分离细胞及过滤灭菌之后，从无细胞培养液中纯化产物。
类似于上述方法，也可以用其他诱导型启动子表达具有天然N-末端氨基酸序列的抑肽酶或抑肽酶变异体。但必需采用适当的诱导技术，这取决于所选择的启动子的特性。
实施例4重组抑肽酶变异体的纯化通过加入150ml柠檬酸将5升发酵上清液调整至pH3.0。加入200ml用50mM柠檬酸钠pH3.0平衡的SP-Sepharose-FF凝胶(Pharmacia)，并将整个混合物在室温下搅拌45分钟。用50mM拧檬酸钠，pH3.0，洗涤凝胶，并用于填充层析柱。用50mM柠檬酸钠，pH3.0，50mM TRIS，pH9.0，和20mM HEPES，pH6.0，连续洗涤该柱。利用溶于20mM HEPES，中pH6.0的0.25M、0.55M、和1M NaCl溶液分批洗脱结合的物质。将具有胰蛋白酶抑制活性的组分合并并用柠檬酸将pH调至3.0。加入冰以降低导电性(最终值≤17.5mS/cm)。然后将该物质加样到100ml的S-Sepharose-HP柱(Pharmacia)，该柱已用50mM柠檬酸钠，pH3.0进行平衡。用线性NaCl梯度溶液(溶于20mM HEPES，pH6.0中的0-1M1 NaCl溶液)洗脱该产物。将具有胰蛋白酶抑制活性的组分合并，在50mM NH4HCO3中渗析，然后冻干。
实施例5分离的抑肽酶变异体特性通过测定N-末端氨基酸(图3)以及通过分析氨基酸组分(图4)来分析冻干物质的特征。除具有正确加工过的N-末端的抑肽酶变异体外未检测到其他抑肽酶序列。
表具有正确加工过的天然N-末端的纯化Arg-15抑肽酶变异体的氨基酸组分
序列清单(1)一般资料(i)申请人(A)姓名Bayer AG(B)街道Bayerwerk(C)城市Leverkusen(E)国家德国(F)邮编D-51519(G)电话0214/3061455(H)传真0214/303482(ii)申请书题目制备具有天然N-末端序列的重组抑肽酶以及重组抑肽酶变异体(iii)序列数量4(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPA)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度42个碱基对(B)类型核酸(C)股数单(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设类型无(iii)反意义链不是(xi)序列描述SEQ ID NO1GCAGCATCCT CCGCATTAGC TCGTCCGGAC TTCTGCCTCG AG 42(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度234个碱基对(B)类型核酸(C)胶数单(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设类型无(iii)反意义链不是(vi)来源(A)生物体啤酒酵母和牛(xi)序列描述SEO ID NO2ATGAGATTTC CTTCAATTTT TACTGCAGTT TTATTCGCAG CATCCTCCGC ATTAGCTCGT60CCGGACTTCT GCCTCGAGCC GCCGTACACT GGGCCCTGCA GAGCTCGTAT CATCCGTTAC 120TTCTACAATG CAAAGGCAGG CCTGTGTCAG ACCTTCGTAT ACGGCGGCTG CAGAGCTAAG 180CGTAACAACT TCAAATCCGC GGAAGACTGC ATGCGTACTT GCGGTGGTGC TTAG 234(2)SEQ ID NO3的资料(i)序列特征
(A)长度77个氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假设类型无(v)片段类型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO3Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser1 5 10 15Ala Leu Ala Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro20 25 30Cys Arg Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu35 40 45Cys Gln Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe50 55 60Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala65 70 75(2)SEQ ID NO4的资料(i)序列特征(A)长度19个氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(iii)假设类型无
(v)片段类型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO4Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Arg Ala1 5 10 15Arg Ile Ile
权利要求
1.用于表达具有正确N-末端的抑肽酶和抑肽酶变异体的载体，它包括有(a)抑肽酶或其变异体的基因和(b)由信号肽酶加工的一个前体序列的核苷酸序列，该序列正好位于该基因上游，作为引导序列。
2.根据权利要求1所述载体，其中引导信号序列来源于前α因子PHO1、PHO5或转化酶。
3.制备具有正确N-末端的抑肽酶和抑肽酶变异体的方法，它包括培养微生物并从培养物上清液中分离抑肽酶或其变异体，其特征在于该微生物含有权利要求1或2所述的载体。
全文摘要
本发明涉及一种制备具有天然N-末端序列的重组抑肽酶以及重组抑肽酶变异体的方法，其中提供的重组抑肽酶和/或重组抑肽酶变异体是均匀加工过的分泌蛋白质。
文档编号C12N15/09GK1123325SQ9510604
公开日1996年5月29日 申请日期1995年5月15日 优先权日1994年5月18日
发明者H·阿皮勒, J·博伊尼克, M·德斯松, U·戈沙尔克 申请人:拜尔公司