专利名称：一种产电微生物酶的筛选及鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物酶，尤其是涉及一种产电微生物酶的筛选及鉴定方法。
背景技术：
在众多的再生性能源中，应用微生物进行有机废弃物生产再生电力称为“微生物燃料电池(MFC)”。微生物燃料电池在环境保护、生态平衡及能源危机都有正向帮助， 利用微生物处理污水并同时产电，掀起了环境及能源领域的研究热潮(BruceE. Logan. Simultaneouswastewater treatment and biological electricity generation[J]. Water Science&Technology, 2005, 52:31-37)。但目前微生物燃料电池仍未能商业化,主要的因素是微生物本身的性能、受分解的有机废弃物的种类、燃料电池的寿命及功率、操作方式等。过去大部分的MFC均采用混菌培养，但却面临混菌之间的竞争生长，在相互争夺营养物质或代谢产物易产生对抗作用；而且混菌中的厌氧微生物群在受到氧化还原产生的氧气影响，对其生长较不利。单一纯菌的微生物燃料电池是近年研究的热点。特别是染整业中常用的偶氮染料作为MFC的产电燃料，其性能及去色效果明显，不仅为有毒有害的偶氮有机物的处理提供了新思路，而且可以回收能量，实现高效低耗的运行。这对于资源和能源都较为短缺的我国具有重要的现实意义。
对于细菌进行偶氮染料的降解还没有确切的反应机制，但是对于兼性厌氧细菌来说，目前存在两种模型解释偶氮脱色过程。其一，是基于纯种菌株一鞘氨醇单胞菌的脱色机制在这个模型中，中介物或是特定偶氮染料的代谢物或是磺化的葱醒类物质、活性炭、 腐殖质等可促进的还原反应速率，这些还原当量通过中介物从细胞膜转移到电子供体，从而达至丨J偶氮键的断裂(Kudlieh, et al. Localization of the enzyme system involved in anaerobic reduction ofazo dyes by Sphingomonas sp.Strain BN6and effect of artificial redox mediators on the rate ofazo dye reduction. Appl Environ Microbiol 1997，63:3691-3694)，细胞膜在电子转移中起着重要的桥梁作用。同样地，对于微生物燃料电池微生物可以依靠其膜上的脱氢酶直接氧化小分子的有机酸，例如甲酸盐、 乙酸盐、乳酸盐等，从有机物中释放的电子传递给膜上的电子载体。另外产电微生物还可以氧化糖类等有机物生成还原力(NADH，FADH2),这些还原力与细胞膜上脱氢酶作用释放电子到电子传递链(洪义国，郭俊，孙国萍.产电微生物及微生物燃料电池最新研究进展[J]. 微生物学报，2007，47 (I) :173-177)。微生物细胞膜上蛋白质和酶担任着电子传递链的重要角色。
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，它能利用分子氧作为电子受体氧化多种类型的酚类化合物及非酚类的化合物，将分子氧还原为水。漆酶的底物范围很宽，被广泛应用于工业和生物技术方面，如去除含酚的污染物、染料脱色、有机物合成和废水脱色等，是一种新兴的生物修复剂。产漆酶的菌株通常筛选自林区土壤、污水处理厂的活性污泥、河流污水、含有机垃圾的表层土壤、油田的土壤、海水、水稻的根部、染料污染的土壤、纺织工业废水和木质纤维废水等(汪春蕾等.产漆酶细菌研究方法进展[J].生物技术，2010，20[4]:92、6)。利用细菌漆酶对染料的脱色研究早已报导HeldC等芽孢漆酶和固定化漆酶对常用的3种纺织染料DBPV200、DFB和靛红(终浓度均为50mg/L)进行脱色，两种芽孢均能非常有效地在90min内对染料进行脱色，并且发现用Cl反应橙70或Cl反应蓝对漂白的棉花纤维进行染色，漆酶能明显地干扰染色反应，染色效果不好。(Held C, et al.Biotransformation of phenolics withlaccase containing bacterial spores[J]. Environ Chem Lett, 2005, 3:74-77.)
研究产电微生物在产电的同时降解偶氮染料过程中蛋白质的产生和变化有助于理清微生物产电和降解染料的机理，同时也能弄清产电和偶氮染料降解二者之间的关系， 促进微生物燃料电池的应用。
奇异变形杆菌(Proteus hauseri, CGMCC No. 6746)是一株从台湾省宜兰县礁溪温泉筛选出来的全新菌株，具有很高的偶氮染料褪色能力，而且能应用在微生物燃料电池中(Bor-Yann Chen, Meng-Meng Zhang, et al. Assessment upon azo dye decolorization andbioelectricity generation by Proteus hauseri[J]. Bioresource Technology, 2010, 101:4737-4741.)。目前，在自然条件中分离的产电微生物主要是变形菌门和厚壁菌门的细菌，变形菌门的很多菌(如希瓦氏菌、铁还原红育菌、硫还原杆菌)都能用于直接微生物燃料电池(李颖等.微生物燃料电池中产电微生物的研究进展[J].微生物学通报，2009, 36(9) : 1404-1409)。奇异变形杆菌属于变形菌门的兼性厌氧细菌，是产电和厌氧褪色优势菌种。挖掘此株菌与产电和褪色相关蛋白、酶及探究其作用，对产电和降解偶氮染料机理研究有一定促进作用。发明内容
本发明的目的是提供一种产电微生物酶的筛选及鉴定方法。
本发明包括以下步骤
I)将奇异变形杆菌(Proteus hauseri)培养后,第I次离心,吸取部分上清得胞外蛋白，沉淀的菌体去离子水重新悬浮菌体后第2次离心，再悬浮，如此反复3次洗涤的菌体， 即得全细胞，取洗涤后的部分菌体经超声破碎后第3次离心，收集上清可得到胞内蛋白；
2)十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胞外蛋白和全细胞蛋白将 30 μ L样品与10 μ L四倍蛋白上样缓冲液，混合均匀后，于100°C加热5min，点样后进行电泳分析，以0. 025%考马斯亮蓝溶液染色lh，使用7%醋酸与40%甲醇溶液脱色洗涤二次，每次半小时，最后拍照记录实验数据；
3)切割蛋白电泳胶片上蛋白分子量介于3(T65kDa，胞外蛋白目的条带需肉眼能够清晰看到的胶条，胞内蛋白目的条带取颜色最深的胶条，置于干净的离心管中，加去离子水浸泡备用；
4)用胰酶酶解法处理目的胶条后，样品经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALTI-T0F-MS/MS)分析得到相应的肽质指纹图谱，然后搜索Mascot数据库鉴定蛋白质身份，将数据与美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库进行对比后确定蛋白身份；
5)将所得蛋白质信息及NCBI数据库设计漆酶和孔蛋白基因的引物
(I) 5，ATGCCGCTGTGGCTGGA ；
(2)5’ TTTAATCCAGATCAGGGTTGCC ；
(3) 5’ ATGATGAAACGCAATCTG ；
(4) 5’ TAATTGATAAGTCAGACCC ；
利用菌落PCR技术分别对两功能性基因进行扩增；
6)将所扩增的基因片段连接于PMD-19T载体，进行基因测序；
7)所得核酸序列利用VectorNTI 10. O软件翻译成氨基酸序列，与相近物种彭氏变形杆菌漆酶和孔蛋白氨基酸序列进行对比；
8)将经前培养的奇异变形杆菌接种于LB液体培养基培养，分别添加不同浓度的硫酸铜溶液进行诱导培养，培养至24h收获菌体，将菌体洗涤两次后，在pH 3. O以2mmol/ LABTS为底物，测全细胞及胞内漆酶酶活；
9)利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析添加硫酸铜诱导和未诱导奇异变形杆菌全细胞，经考马斯亮蓝溶液染色后，比较差异蛋白；
10)利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析比较添加硫酸铜诱导和未诱导奇异变形杆菌胞内蛋白条带，将30 μ L样品与10 μ L非变性蛋白上样缓冲液，混合均匀后，于冰上冰浴5min，点样后进行电泳分析，整个过程电泳槽置于冰水混合物中，将电泳完成后的凝胶取出，以2mmol/L，pH 3. O的ABTS溶液浸泡凝胶，放入37°C的反应槽中摇动IOmin取出，即可以见到有深绿色的条纹为漆酶酶活所在处，进行第I次拍照记录实验数据；再将胶片重新以O. 025%考马斯亮蓝溶液染色lh，使用7%醋酸与40%甲醇溶液脱色洗涤二次，每次半小时，进行第2次拍照记录实验数据。
在步骤I)中，所述奇异变形杆菌(Proteus hauseri)已于2012年10月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No. 6746，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；所述奇异变形杆菌 (Proteus hauseri)筛选自台湾省宜兰县礁溪温泉；所述培养的时间可为16h,所述第I次离心的条件可为8000rpm离心IOmin ;所述第3次离心的条件可为14000rpm离心5min。
在步骤2)中，所述四倍蛋白上样缓冲液的配方可为(O. 8 l)g十二烷基磺酸钠， (2.5 2.6)mL β -巯基乙醇，(2 2. 2)mL Tris-HCl 缓冲液(pH 6. 8)，5mL 甘油，5mg 溴酚蓝。
在步骤8)中，所述前培养的时间可为12h，所述接种的条件可为按1%接种量接种， 150rpm，30°C培养2h ;所述不同浓度的硫酸铜溶液的浓度分别为O、I、I. 5、2、2. 5、3mmol/L。
在步骤10)中，所述非变性蛋白上样缓冲液的配方可为(2.5 2. 6)mL β-巯基乙醇，(2. 0 2· 2) mLTris-HCl 缓冲液(pH 6. 8)，5mL 甘油，5mg 溴酚蓝。
本发明从自然环境中筛选出一株高效降解偶氮染料的奇异变形杆菌(Proteus hauseri)(筛选自台湾省宜兰县礁溪温泉),并且从中发现二个全新的蛋白质对应最高相似度的蛋白身份为彭氏变形杆菌ATCC 35198的漆酶(氨基酸相似度87. 8%)及彭氏变形杆菌 ATCC35198的孔蛋白F(氨基酸相似度84. 4%)。在加入2. 5mmol/L硫酸铜诱导后生产出的漆酶具有最高活性为269. 2U/g-DCff,比较添加和未加硫酸铜诱导的奇异变形杆菌胞内蛋白电泳图谱，发现在120kDa位置多出一条条带，经质谱鉴定此蛋白质为铜诱导型的运输ATP酶， 在非变性蛋白电泳图上硫酸铜诱导的奇异变形杆菌胞内蛋白的泳道出现绿色活性条带，而未经诱导的样品在其泳道没有显示活性条带。
图I为实施例2中对奇异变形杆菌胞外及全细胞的蛋白质电泳分析。在图I中，泳道I为胞外蛋白，泳道M为标记蛋白质(分子量分别为170、130、100、70、55、40及35kDa)， 泳道2为全细胞蛋白。
图2为实施例9及实施例10中在铜离子诱导下奇异变形杆菌全细胞或胞内蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
图3为实施例9及实施例10中在铜离子诱导下奇异变形杆菌全细胞或胞内蛋白的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
图4为实施例9及实施例10中在铜离子诱导下奇异变形杆菌全细胞或胞内蛋白的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳酶谱分析，红色箭头是铜诱导型的运输ATP酶与漆酶的位置。
在图2 4中，泳道1，7，10为未添加铜离子诱导的胞内蛋白分析；泳道2，3，6，9为添加2. 5mmol/L铜离子诱导的胞内蛋白分析,泳道4，5，8为蛋白质分子量标准品。
具体实施方式
为了易于进一步理解本发明，下列实施例将对本发明作进一步的阐述。
实施例I :奇异变形杆菌(Proteus hauseri)培养
I)固体培养
LB培养基组成胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L及琼脂15g/L， PH7. 0，将分离及筛选所得的奇异变形杆菌划线接种于固体培养基以30°C培养16h。
2)液体培养
首先以接种环自LB琼脂平板中勾取单一菌落接种于含50mL，LB培养液的250mL 锥形瓶中以30°C，150rpm下进行培养12h。
3)干重分析
将培养12h的菌体悬浮液倾入装有O. 22 μ m滤膜的玻璃过滤组，安装前对50°C干燥滤膜秤重，将抽气管连接抽气过滤机，过滤组盖上培养皿盖防灰尘入侵，连续抽气直到菌液部份脱水，再加入去离子水至菌液中以溶去非生物质，而后刮取滤膜上的菌体至玻璃培养皿并置入110±5°C烘箱中干燥。干燥过程中每24h样品秤重一次，直到重量不再变化为止。奇异变形杆菌的干菌重为O. 973±0. 035g-DCW/L。
实施例2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
于小烧杯中配制10%分离胶，小心将凝胶溶液加入模具内，避免气泡产生，在室温聚合30min。再配制5%积层胶溶液，混合均匀后加入已配制好的分离胶上方，马上插入梳子于积层凝胶内，在室温放置Ih聚合，拔出梳子形成样品孔。将整组胶体放入电泳槽内，加入电泳缓冲液(O. 025mol/L三羟甲基氨基甲烷、O. 192mol/L甘氨酸、O. 1%十二烷基磺酸钠， pH 8. 3)，将30 μ L样品与10 μ L四倍蛋白上样缓冲液混合均匀后，于100°C加热5min，小心加入到样品孔中进行电泳分析。调电压至120V，进行电泳分离约1.5h，取出胶片以O. 025% 考马斯蓝染色lh，再用7%醋酸与40%甲醇溶液脱色脱色液洗涤二次，每次半小时。结果如附图1，其中选定蛋白A、B、C、D，切割胶条放入I. 5mL离心管中进行下一步实验。
实施例3 :串联式质谱鉴定蛋白质身份
I)胰酶酶解
脱色向离心管中加100 μ L50mmol/L NH4HCO3/乙睛(I I)考染胶脱色液，37°C 保温20min，再移去其中的溶液，重复洗涤直至胶条变为无色透明状。
干胶用移液器将离心管中的NH4HCO3和乙睛吸尽后，再加入100 μ L 100%乙腈， IOmin后移去乙腈，然后放入37°C烘箱中5 10min确保完全干胶。
酶解加入5 10 μ L浓度为12. 5mg/L的胰酶溶液，4°C冰箱中约30min，以确保胶粒能很好地吸收酶液，取出后在37°C烘箱中酶解过夜。
肽段提取加入60 μ L 50%乙腈和O. 1%三氟乙酸混合液，3(T40min后，将溶液转移到新的96孔板内，重复加样2 3次，最后将肽段溶液在N2流下吹干浓缩，以备用于质谱鉴定。
2)串联式质谱分析
以质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-T0F-T0F)分析得各小片段之分子量及氨基酸进行由N端至C端之定序，最后将所有小片段的数据，包括分子量及序列，与现有蛋白质数据库进行比对，获得目的蛋白质的鉴定结果(见表I)。
表IMascot蛋白质身份鉴定与性质分析
权利要求
1.一种产电微生物酶的筛选及鉴定方法，其特征在于包括以下步骤 1)将奇异变形杆菌(Proteushauseri)培养后,第I次离心,吸取部分上清得胞外蛋白，沉淀的菌体去离子水重新悬浮菌体后第2次离心，再悬浮，如此反复3次洗涤的菌体，即得全细胞，取洗涤后的部分菌体经超声破碎后第3次离心，收集上清可得到胞内蛋白； 2)十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胞外蛋白和全细胞蛋白将30μ L样品与10 μ L四倍蛋白上样缓冲液，混合均匀后，于100°C加热5min，点样后进行电泳分析，以O. 025%考马斯亮蓝溶液染色lh，使用7%醋酸与40%甲醇溶液脱色洗涤二次，每次半小时，最后拍照记录实验数据； 3)切割蛋白电泳胶片上蛋白分子量介于3(T65kDa，胞外蛋白目的条带需肉眼能够清晰看到的胶条，胞内蛋白目的条带取颜色最深的胶条，置于干净的离心管中，加去离子水浸泡备用; 4)用胰酶酶解法处理目的胶条后，样品经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALTI-TOF-MS/MS)分析得到相应的肽质指纹图谱，然后搜索Mascot数据库鉴定蛋白质身份，将数据与美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库进行对比后确定蛋白身份； 5)将所得蛋白质信息及NCBI数据库设计漆酶和孔蛋白基因的引物(1)5，ATGCCGCTGTGGCTGGA ；(2)5’TTTAATCCAGATCAGGGTTGCC ；(3)5’ATGATGAAACGCAATCTG ；(4)5’TAATTGATAAGTCAGACCC ； 利用菌落PCR技术分别对两功能性基因进行扩增； 6)将所扩增的基因片段连接于PMD-19T载体，进行基因测序； 7)所得核酸序列利用VectorNTI10. O软件翻译成氨基酸序列，与相近物种彭氏变形杆菌漆酶和孔蛋白氨基酸序列进行对比； 8)将经前培养的奇异变形杆菌接种于LB液体培养基培养，分别添加不同浓度的硫酸铜溶液进行诱导培养，培养至24h收获菌体，将菌体洗涤两次后，在pH 3. O以2mmol/LABTS为底物，测全细胞及胞内漆酶酶活； 9)利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析添加硫酸铜诱导和未诱导奇异变形杆菌全细胞，经考马斯亮蓝溶液染色后，比较差异蛋白； 10)利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析比较添加硫酸铜诱导和未诱导奇异变形杆菌胞内蛋白条带，将30 μ L样品与10 μ L非变性蛋白上样缓冲液，混合均匀后，于冰上冰浴5min，点样后进行电泳分析，整个过程电泳槽置于冰水混合物中，将电泳完成后的凝胶取出，以2mmol/L，pH 3. O的ABTS溶液浸泡凝胶，放入37°C的反应槽中摇动IOmin取出，即可以见到有深绿色的条纹为漆酶酶活所在处，进行第I次拍照记录实验数据；再将胶片重新以O. 025%考马斯亮蓝溶液染色lh，使用7%醋酸与40%甲醇溶液脱色洗涤二次，每次半小时，进行第2次拍照记录实验数据。
2.如权利要求I所述的一种产电微生物酶的筛选及鉴定方法，其特征在于在步骤I)中，所述奇异变形杆菌(Proteus hauseri)已于2012年10月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo. 6746。
3.如权利要求I所述的一种产电微生物酶的筛选及鉴定方法，其特征在于在步骤I)中，所述培养的时间为16h。
4.如权利要求I所述的一种产电微生物酶的筛选及鉴定方法，其特征在于在步骤I)中，所述第I次离心的条件为8000rpm离心lOmin。
5.如权利要求I所述的一种产电微生物酶的筛选及鉴定方法，其特征在于在步骤I)中，所述第3次离心的条件为14000rpm离心5min。
6.如权利要求I所述的一种产电微生物酶的筛选及鉴定方法，其特征在于在步骤2)中，所述四倍蛋白上样缓冲液的配方为(0. 8 l)g十二烷基磺酸钠，(2. 5 2. 6) mL β-巯基乙醇，(2 2. 2) mL Tris-HCl缓冲液，Tris-HCl缓冲液的pH 6. 8，5mL甘油，5mg溴酚蓝。
7.如权利要求I所述的一种产电微生物酶的筛选及鉴定方法，其特征在于在步骤8)中，所述前培养的时间为12h。
8.如权利要求I所述的一种产电微生物酶的筛选及鉴定方法，其特征在于在步骤8)中，所述接种的条件为按1%接种量接种，150rpm，30°C培养2h。
9.如权利要求I所述的一种产电微生物酶的筛选及鉴定方法，其特征在于在步骤8)中，所述不同浓度的硫酸铜溶液的浓度分别为0、1、1. 5、2、2. 5、3mmol/L。
10.如权利要求I所述的一种产电微生物酶的筛选及鉴定方法，其特征在于在步骤10)中，所述非变性蛋白上样缓冲液的配方为(2. 5 2. 6) mL β-巯基乙醇，(2. (Γ2. 2)mLTris-HCl缓冲液，Tris-HCl缓冲液的pH 6. 8，5mL甘油，5mg溴酚蓝。
全文摘要
一种产电微生物酶的筛选及鉴定方法，涉及一种微生物酶。由蛋白质组学分析获得基因组讯息，并设计随机引物进行基因克隆，从而获得两个全新的蛋白质，经比对为彭氏变形杆菌ATCC 35198的漆酶与孔蛋白F，其氨基酸相似度分别为87.8%与84.4%。报道了产电变形杆菌的漆酶及其酶活特征，以及漆酶与孔蛋白基因；并发现以2.5mmol/L的硫酸铜对漆酶的诱导生产可得269.2U/g-DCW的酶活，是未诱导的30.6倍。该发明提供产电微生物的新颖酶的筛选及蛋白质鉴定方法，有望应用于缓解石化燃料日渐短缺的危机及减少二氧化碳排放。
文档编号C12Q1/34GK102925535SQ20121048890
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月26日 优先权日2012年11月26日
发明者吴意珣, 陈博彦, 卢英华, 郑雪松, 池小琴 申请人:厦门大学