玉米浆酶解液用于微生物油脂发酵的生产方法
【专利摘要】本发明的目的在于提供玉米浆酶解液代替玉米浆，用于微生物油脂发酵生产，以满足市场的需要。采用植酸酶和酸性蛋白酶对玉米浆进行酶解后离心得到的酶解液代替玉米浆作为培养基，有效降低了染菌风险，酶解液中无机磷/总磷含量为75-90%，微生物生物利用度提高，降低生产成本，且在微生物油脂发酵中，有利于不饱和脂肪酸快速积累，缩短发酵周期，降低微生物发酵成本。
【专利说明】玉米浆酶解液用于微生物油脂发酵的生产方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物油脂发酵领域，具体的说涉及玉米浆经酶解处理后的产物作为培养基，用于微生物油脂发酵。
【背景技术】
[0002]玉米浆是制备玉米淀粉的副产物，玉米粒先用亚硫酸浸泡，浸泡液经加热蒸发浓缩所制得的黄褐色液体，玉米浆中含有可溶性蛋白、生长素和一些前体物质，含大约40-50%的固体物质。玉米浆是微生物生长很普遍应用的有机氮源，由于其含有丰富的有机氮和微量元素，因此广泛应用于发酵工业，它还能促进青霉素等抗生素的生物合成。由于玉米浆中大部分的氨基酸以大分子的蛋白形式存在，不利于微生物对其的利用。为了保证微生物发酵正常进行，需要应用较大比例的玉米浆，随着玉米浆的应用量加大，发酵过程中大分子的蛋白以及其他胶体类物质产生较多泡沫，发酵罐的有效利用率下降，另外玉米浆中不溶性颗粒和部分不易高温杀灭的微生物芽孢增多，发酵染菌的风险加大。
[0003]微生物油脂(microbial oils)又称单细胞油脂(single cell oil, SCO),是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定条件下利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂为碳源、氮源、辅以无机盐生产的油脂。微生物油脂中含有某些特定的不饱和脂肪酸，如ARA、DHA, EPA、亚油酸、角鲨烯等，现在用于生产多不饱和脂肪酸的微生物主要为藻类、细菌和真菌，由于细菌产量低，所以目前主要集中在藻类和真菌。不饱和脂肪酸可以保持细胞膜的相对流动性，以保证细胞的正常生理功能。且使胆固醇酯化，降低血中胆固醇和甘油三酯。不饱和脂肪酸是合成人体内前列腺素和凝血恶烷的前体物质。能降低血液粘稠度，改善血液微循环。可以提高脑细胞的活性，增强记忆力和思维能力。
[0004]不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)对人类健康的重要作用已愈来愈受到人们的重视。随着微`生物油脂的工业化生产技术日益成熟，开发价格低廉、营养丰富的发酵原料是市场的需要。本发明旨在提高玉米浆的生物利用度，缩短发酵周期，降低微生物发酵成本。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供玉米浆酶解液代替玉米浆，用于微生物油脂发酵生产，以满足市场的需要，且采用玉米浆酶解液代替玉米浆作为培养基，有效降低了染菌风险，酶解液中无机磷/总磷含量为75-90%，微生物生物利用度提高，降低生产成本，且在微生物油脂发酵中，有利于不饱和脂肪酸快速积累，缩短发酵周期，降低微生物发酵成本。
[0006]本发明提供的玉米浆酶解液用于微生物油脂发酵的生产方法，其步骤如下:取玉米浆稀释后，调节PH至3.0-5.0,加入一定量的植酸酶和酸性蛋白酶进行水解，水解16h-20h后，加热使酶灭活，冷却后离心分离得到酶解液用于微生物油脂发酵。
[0007]玉米浆的浓度过高或过低，都会影响酶解率，所述的取玉米浆稀释后为固含量为40-50%的玉米浆，加水稀释到15%-20%固含量；玉米浆的大分子物质在酸性条件下，酶解更测底，所述的调节PH至3.0-5.0为0.2NHCL调稀释液PH至3.0-5.0。
[0008]水解时需要酸或碱作为催化剂，有时也用生物活性酶作为催化剂，本发明用植酸酶和酸性蛋白酶作为催化剂，所述加入一定量为植酸酶量占玉米浆中干物质的质量百分数为0.03%-0.035% ；酸性蛋白酶占玉米浆中干物质的质量百分数为1.5%-1.8%。
[0009]酶解温度是影响玉米浆水解的一个重要因素，温度过低，水解率变低，温度过高，副反应比例明显升高，所述的水解16h-20h为酶解温度控制升温至48°C，搅拌速度为200r/min-220r/min,水解 16h_20h ；
所述的使酶灭活为酶解后升温至85-90 V, 20min-25min,酶失活后酶解液降温至200C，加热离心，转速为4500rpm，15min-20min,取上清液用作微生物油脂发酵的培养基。
[0010]微生物油脂发酵生产通常采用裂壶藻(Schizochytrium sp.)、吾肯氏壶藻(Ulkenia amoeboida)、寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)、高山被抱酶(Mortierellaalpina)等微生物发酵培养，所用培养基可含有适当的碳源、氮源、无机盐和维生素。所述的培养基是以葡萄糖或甘油或果糖为碳源，以酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、谷氨酸、玉米浆、大豆蛋白中一种或混合物为氮源。无机盐为氯化钠、硫酸镁、氯化钙、氯化钾、磷酸二氢钾。维生素为维生素B1、维生素B6、维生素B12 —种或多种。
[0011]本发明玉米浆酶解液用于微生物油脂发酵的生产方法的优点在于:以玉米浆酶解液代替玉米浆作为培养 基，有效降低了染菌风险，酶解液中无机磷/总磷含量为75-90%，微生物生物利用度提高，降低生产成本，且在微生物油脂发酵中，有利于不饱和脂肪酸快速积累，缩短发酵周期，降低微生物发酵成本。
[0012]玉米浆被酶解后,所得的酶解液的营养价值比酶解前大大提高,玉米浆大部分蛋白质水解为小分子氨基酸，淀粉会水解成麦芽糖、葡萄糖等，微生物生物利用度大大提高，且酶解后，发酵培养基灭菌更彻底，且泡沫减少，提高发酵罐罐容有效利用率。玉米浆酶解时PH值为3.0-5.0,强酸性的环境可保证无杂菌及芽孢滋生，可避免玉米浆灭菌不彻底导致的染菌风险，为实现本发明目的。
【具体实施方式】
[0013]实施例一:
玉米浆酶解液的准备:
取固含量为48%的玉米浆5000g，加水稀释到19%固含量，用0.2N盐酸调节PH至3.8。在稀释液中分别加入植酸酶和酸性蛋白酶，所述植酸酶量占玉米浆中干物质的质量百分数为0.032%，所述酸性蛋白酶占玉米浆中干物质的质量百分数为1.8%。保持酶解温度为480C _50°C，搅拌速度为200r/min，时间为18h。酶解后升温至90°C，时间25min，进行灭酶。灭酶反应后降温至20°C，进行离心分离，离心转速为4500rpm，离心时间15min，取上清液备用。
[0014]培养基配方(g/100ml):
氯化钠1.24g，氯化钾0.07g,氯化钙0.035g,
硫酸镁0.7g，磷酸二氢钾0.2g，谷氨酸钠4.2g,
玉米浆或玉米浆酶解液3.5g，葡萄糖7.5g，维生素B1 0.003g维生素B60.005g,
加水至所需体积，PH自然。
[0015]用上述配方进行对比实验，采用裂壶藻(Schizochytrium sp.)斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养和三级发酵培养，玉米浆组IOOh时测定发酵液中残糖含量为0.16g/100ml，得到总油为3.2g/100ml, DHA含量为37.05%,玉米浆酶解液组78h时测定发酵液中残糖含量为0.25g/100ml,得到总油为3.lg/100ml, DHA含量为37.5%。实验数据显示，玉米浆酶解液组较玉米浆组缩短发酵时间22h，总油和DHA含量相当。测得该酶解液中无机磷/总磷为89%。
[0016]实施例二:
玉米浆酶解液的准备:
取固含量为47.5%的玉米浆5000g，加水稀释到20%固含量，用0.2N盐酸调节PH至
3.7。在稀释液中分别加入植酸酶和酸性蛋白酶，所述植酸酶量占玉米浆中干物质的质量百分数为0.03%,所述酸性蛋白酶占玉米浆中干物质的质量百分数为1.6%。保持酶解温度为50°C，搅拌速度为200r/min，时间为18h。酶解后升温至90°C，时间20min，进行灭酶。灭酶反应后降温至20°C，进行离心分离，离心转速为4500rpm，离心时间15min，取上清液备用。
[0017]培养基配方(g/100ml):
氯化钠1.35g，氯化钾0.065g,氯化钙0.04g,
硫酸镁0.7g，磷酸二氢钾0.3`g，谷氨酸钠4.3g,
玉米浆或玉米浆酶解液4.0g,葡萄糖8.0g,维生素B1 0.005g 维生素B60.006g,
加水至100ml。
[0018]采用吾肯氏壶藻(Ulkenia amoeboida)斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养和三级发酵培养，得到海藻细胞。玉米浆组96h时测定发酵液中残糖含量为0.18g/100ml，得到总油为3.5g/100ml, DHA含量为38.05%，玉米浆酶解液组76h时测定发酵液中残糖含量为0.15g/100ml，得到总油为3.7g/100ml，DHA含量为37.9%。实验数据显示，玉米浆酶解液组较玉米浆组缩短发酵时间20h，总油和DHA含量相当。测得该酶解液中无机磷/总磷为90%。
[0019]实施例三:
玉米浆酶解液的准备:
取固含量为40-50%的玉米浆5000g，加水稀释到18%固含量，用0.2N盐酸调节PH至
3.5。在稀释液中分别加入植酸酶和酸性蛋白酶，所述植酸酶量占玉米浆中干物质的质量百分数为0.03%,所述酸性蛋白酶占玉米浆中干物质的质量百分数为1.5%。保持酶解温度为48°C,搅拌速度为210r/min,时间为16h。酶解后升温至90°C,时间20min,进行灭酶。灭酶反应后降温至20°C，进行离心分离，离心转速为4500rpm，离心时间15min，取上清液备用。
[0020]( I)菌种活化培养 斜面培养基配方如下:
马铃薯30g,葡萄糖2-4g,琼脂1.5-2g,水100ml ；
高山被孢霉菌株活化采用斜面菌种培养，培养温度28-30°C，培养时间7-10天；
(2)摇瓶培养摇瓶培养基配方体积浓度如下:
葡萄糖20-40g/L，酵母粉2.5-5g/L ；
采用斜面菌种进行液体摇瓶培养，培养温度28-30°C，转速140-200rpm，培养时间7_10
天;
(3)发酵培养基体积浓度如下:
葡萄糖30-60g/L，玉米浆或玉米浆酶解液50-60g/L ；
①一级发酵培养:将步骤(2)中的摇瓶菌种转接入一个装有一级种子培养基的发酵罐中，接种量为0.1-1 %，培养温度28-30°C，罐压控制在0.015-0.05MPa,转速140_200rpm，时间2-5天；
②二级发酵培养:将一级种子罐中的菌种转接入一个装有二级种子培养基的发酵罐中，接种量为1-10%，培养温度28-30°C，罐压控制在0.015-0.05MPa,转速140_200rpm，时间2-5天；
③三级发酵培养:将二级种子罐种的菌种转接入一个装有三级发酵培养基的发酵罐中，接种量为1-10 %，培养温度28-30 V，罐压控制在0.015-0.05MPa,转速140_200rpm，进行发酵。玉米浆组168h时测定发酵液中残糖含量为0.07g/100ml，得到生物量为2.65g/100ml，干菌体中总油为47.5%，ARA含量为46.8%，玉米浆酶解液组140h时测定发酵液中残糖含量为0.03g/100ml，得到生物量为2.8g/100ml，干菌体中总油为47%，ARA含量为47.5%。实验数据显示，玉米浆酶解液组较玉米浆组缩短发酵时间28h，生物量、总油和ARA含量相当。测得该酶解液中无机磷/总磷为89.5%。
【权利要求】
1.玉米浆酶解液用于微生物油脂发酵的生产方法，其特征在于:取玉米浆稀释后，调节PH至3.0-5.0，加入一定量的植酸酶和酸性蛋白酶进行水解，水解16h-20h后，加热使酶灭活，冷却后离心分离得到酶解液用于微生物油脂发酵。
2.根据权利要求1所述的玉米浆酶解液用于微生物油脂发酵的生产方法，其特征在于:所述的取玉米浆稀释后为取固含量为40-50%的玉米浆，加水稀释到15%-20%固含量。
3.根据权利要求1所述的玉米浆酶解液用于微生物油脂发酵的生产方法，其特征在于:所述的调节PH至3.0-5.0为用稀释液0.2N盐酸调节PH至3.0-5.0。
4.根据权利要求1所述的玉米浆酶解液用于微生物油脂发酵的生产方法，其特征在于:所述的加入一定量的植酸酶和酸性蛋白酶为植酸酶量占玉米浆中干物质的质量百分数为0.03%-0.035% ;酸性蛋白酶占玉米浆中干物质的质量百分数为1.5%-1.8%。
5.根据权利要求1所述的玉米浆酶解液用于微生物油脂发酵的生产方法，其特征在于:所述的水解16h-20h为酶解温度控制升温至48°C，搅拌速度为200r/min-220r/min，水解 16h-20h。
6.根据权利要求1所述的玉米浆酶解液用于微生物油脂发酵的生产方法，其特征在于:所述的使酶灭活为酶解后升温至85-90°C，20min-25min.酶失活后酶解液降温至20°C，加热离心，转速为4500rpm，15min_20min，取上清液用作微生物油脂发酵的培养基。
【文档编号】C12P7/64GK103642857SQ201310391393
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年9月2日 优先权日:2013年9月2日
【发明者】简晓红, 刘真茂, 李金龙, 邱顺江 申请人:福建贝辰生物科技有限公司