来自里氏木霉的具有微生物裂解活性的酶的制作方法

专利名称：来自里氏木霉的具有微生物裂解活性的酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有抗微生物活性的真菌多肽，及其使用方法。
背景技术：
溶菌酶(1，4_β -N-乙酰胞壁质酶(N-acetylmuraminidase))分布在活组织中，并 认为其在防御细菌感染中起作用。(Fleming(1922)Proc Royal Soc London B39 :306_317)， 溶菌酶通过β-葡糖苷酶活性水解细菌细胞壁中的多糖来行使功能。由此裂解细胞壁，导 致细胞死亡。这些酶起杀菌剂的作用，该性质解释了它们在哺乳动物的大部分生物液体中 的广泛存在。例如，在哺乳动物的血液、眼泪、唾液、乳等中发现了多种浓度水平的溶菌酶。 还在植物，例如木瓜中发现了溶菌酶。溶菌酶在鸡蛋清中以高浓度存在，从其中可相对容易 并高纯度地分离该溶菌酶。(Imoto等(1972)在The Enzymes (Boyer, P. D.，编辑)第3版， 7 :665_668, Academic Press, Orlando, FL)。向乳酪、香肠和海产品中加入溶菌酶用于防腐目的，并且在例如止血、抗炎症或 组织再生应用中其也用作药剂。其还可用于保藏奶成份用于儿科使用。(日本专利号 16780/70, 1970)在生物技术应用中，可在回收表达蛋白质的过程中向细菌培养物中加入溶 菌酶，促进蛋白质从细胞中释放。(Zukaite 等(2000)Lett Appl Microbiol 30:203-206)来自鸡蛋清的溶菌酶可在敏感个体中诱导变态反应，因此在某些应用如食品保藏 中限制了其使用。需要具有微生物裂解活性的新酶作为鸡蛋清溶菌酶的可选项。
发明简述本发明组合物和方法涉及来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的多肽(此处称 作“NSP38”，其具有抗微生物活性)、编码NSP38多肽的多核苷酸，及其使用方法。—方面，本发明提供来自里氏木霉的多肽(此处称为“NSP38”)，其具有抗微生物 活性。在一些实施方案中，抗微生物活性是细菌细胞壁裂解活性，例如1，4-β-Ν-乙酰胞壁 质酶活性。在一些实施方案中，抗微生物活性是对微生物细胞，例如细菌或真菌细胞生长的 抑制(即，部分或完全抑制)，包括延长的滞后期效应。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列，或从SEQ ID NO :4切割信号序列后产生的成熟蛋白质；由SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列，或从SEQ ID NO :4切割信号序列后产生的成熟蛋白质组成；或基 本上由SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列，或从SEQ ID NO :4切割信号序列后产生的成熟蛋 白质组成。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO :4的变体，或从SEQ ID NO :4切割信号 序列后产生的成熟蛋白质的变体，其具有如本文所述的抗微生物活性；由SEQ ID Ν0:4的 变体，或从SEQ ID NO :4切割信号序列后产生的成熟蛋白质的变体，其具有如本文所述的抗微生物活性组成；或基本上由SEQ ID NO 4的变体，或从SEQ ID NO 4切割信号序列后产 生的成熟蛋白质的变体，其具有如本文所述的抗微生物活性组成。NSP38多肽在酸性pH，例 如低于约6. 5的pH，例如约pH6处具有催化活性。另一方面，本发明提供编码如上述NSP38多肽或其变体的多核苷酸。多核苷酸可 处于表达载体的形式中，所述表达载体包含编码NSP38或其变体的多核苷酸。表达载体可 转化到宿主细胞中，以用于表达NSP多肽或其变体。另一方面，本发明提供用于表达NSP38多肽或其变体的方法，其包括在适合表达 的条件下培养已经转化了编码多肽的多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，该方法还 包括从宿主细胞和/或培养基中回收多肽。另一方面，本方面提供用于抑制细菌生长的方法，其包括使微生物细胞(例如细 菌或真菌细胞)与如本文所述的NSP38多肽或其变体接触，其中细胞的生长受到了抑制。在 一些实施方案中，该方法包括使微生物培养物与该多肽接触。在一些实施方案中，该方法在 酸性pH，例如低于约6. 5的pH，例如约pH 6处进行。另一方面，本发明提供回收微生物产生的蛋白质的方法，其包括使表达蛋白质的 微生物培养物与如本文所述的NSP38多肽或其变体接触，由此从微生物细胞中释放蛋白 质。另一方面，本发明提供在清洗过程中减少织物上微生物负荷的组合物，在清 洁组合物中包含NSP38多肽或其变体。在一些实施方案中，该组合物还包含一种或更 多溶素、蛋白酶、过水解酶(perhydrolase)、脂肪酶、磷脂酶、氧化酶、内切糖苷酶、糖酶 (carohydrase)，和其他微生物细胞壁降解酶。在一些实施方案中，与不包含NSP38多肽或 其变体的相同组合物相比，该组合物产生更少的恶臭。另一方面，本发明提供用于食品保藏的组合物。下文阐明了组合物和方法的特定方面和实施方案一方面，提供来自里氏木霉的重组多肽(NSP38)，所述多肽具有抗微生物活性。在 一些实施方案中，抗微生物活性是细菌细胞壁裂解活性。在一些实施方案中，抗微生物活性 是1，4-β-Ν-乙酰胞壁质酶活性。在一些实施方案中，抗微生物活性的特征在于部分或完 全抑制微生物细胞的生长。在一些实施方案中，抗微生物活性的特征在于微生物生长中的 延长滞后期效应。在特定实施方案中，具有抗微生物活性的多肽对抗的微生物细胞是细菌 或真菌细胞。在一些实施方案中，多肽在酸性ΡΗ，例如低于ρΗ6. 5，例如低于pH 6处具有抗 微生物活性。在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO :4所示的多肽，或从所述多肽切割信 号序列后产生的成熟蛋白质具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中， 多肽基本上由与SEQ ID NO :4所示的多肽，或从所述多肽切割信号序列后产生的成熟蛋白 质具有至少85%的序列同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽和SEQ ID NO 4之间的同一性是至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少 91%,至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至 少99%。在特定实施方案中，多肽具有SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列。另一方面，提供编码上述多肽的分离的多核苷酸。在相关方面，提供包含这种多核 苷酸的载体。在相关方面，提供包含这种载体的宿主细胞。
另一方面，提供用于在清洗过程中减少在织物上的微生物负荷的组合物，其包含 如上述多肽。组合物还包含一种或更多溶素、蛋白酶、过水解酶、脂肪酶、磷脂酶、氧化酶、内 切糖苷酶、糖酶，和另一种微生物细胞壁降解酶。该组合物比不包含该多肽或其变体的相同 组合物产生更少的恶臭。另一方面，提供用于食品保藏的组合物，其包含如上述多肽。相关 方面包括NSP38多肽或其变体在制备如上述组合物中的用途。另一方面，提供表达NSP38多肽或其变体的方法，其包括在适合表达的条件下在 培养基中培养已经转化了编码NSP38多肽的多核苷酸的宿主细胞。该方法还包括从宿主细 胞或培养基中回收多肽。在一些实施方案中，多肽(或其变体)包含与SEQ ID N0:4所示 的多肽，或从所述多肽切割信号序列后产生的成熟蛋白质具有至少85%序列同一性的氨基 酸序列。另一方面，提供抑制微生物生长的方法，其包括使微生物细胞与NSP38多肽或其 变体接触，由此抑制细胞的生长。在一些实施方案中，该方法在酸性PH下进行。在一些实 施方案中，多肽(或其变体)包含与SEQ ID NO :4所示的多肽，或从所述多肽切割信号序列 后产生的成熟蛋白质具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。另一方面，提供回收微生物产生的蛋白质的方法，其包括使表达该蛋白质的微生 物细胞与NSP38多肽或其变体接触，由此引起细胞裂解并回收微生物细胞表达的蛋白质。 在一些实施方案中，多肽(或其变体)包含与SEQ ID NO :4所示的多肽，或从所述多肽切割 信号序列后产生的成熟蛋白质具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。组合物和方法的这些特征和其他特征将从说明书和附图中显而易见。
附图简述

图1是pTrex3g_DEST里氏木霉(T. reesei)目的载体的示意图。图2是用于NSP38的Trlysl表达载体的示意图。图3是在里氏木霉中表达的NSP38的SDS-PAGE凝胶。图4描述了来自里氏木霉的NSP38基因的核苷酸序列(SEQ IDNO 3)。图5描述了 NSP蛋白质的推导氨基酸序列(SEQ ID NO :4)。
发明详述除非另有说明，本发明的实践将使用本领域技术人员已知的分子生物学(包括重 组技术)、微生物学、细胞生物学和生物化学的常规技术。在文献，例如Molecular CloninR A Laboratory Manual,第二版(Sambrook 等，1989) ；Oligonucleotide Synthesis(Μ. J. Gait,编辑，1984 Current Protocols in Molecular BioIory (F. M. Ausubel 等，编辑， 1994) ;PCR :The Polymerase Chain Reaction(Mullis1994)禾口 Gene Transfer and Expression :A Laboratory Manual (KrieRler, 1990)中详细解释了此类技术。除非本文另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明隶属领域的技术 人员通常理解的相同意思。SingIeton，等，Dictionary of Microbiology and Molecular BioloRy,第二版,John Wiley and Sons, New York (1994),禾口 Hale & Markham, The Harper Collins Dictionary of BioIory, Harper Perennial, NY (1991)提供了本发明使用的许 多术语的常用词典。与本发明描述的那些类似或等同的方法和材料可用于实践或检测本发明。本文提供的数值范围包括定义范围的数值。除非另有说明，分别以5'到3'方向从左到右书写核酸；以氨基到羧基方向从左 到右书写氨基酸序列。
定义如本文所用，术语“多核苷酸”指任何长度和任何三维结构和单链或多链(例如 单链、双链、三股螺旋等)的核苷酸的聚合形式，其含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸，和/ 或脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的类似物或修饰形式，包括修饰的核苷酸或碱基或其类 似物。因为遗传密码是减并的，多于一个密码子可用于编码特定的氨基酸，并且本发明包 括编码特定氨基酸序列的多核苷酸。可使用任何类型的修饰核苷酸或核苷酸类似物，只 要所述多核苷酸在使用条件下保留想要的功能，包括增加核酸酶抗性的修饰(例如脱氧、 2' -Ο-Me、硫代磷酸等)。也可掺入标记，用于检测或捕获目的，例如放射性或非放射性标 记或锚，例如生物素。术语多核苷酸也包括肽核酸(PNA)。多核苷酸可以是天然发生的或非 天然发生的。术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”在本文中互换使用。多核苷酸可含有 RNA、DNA，或两者，和/或其修饰形式和/或类似物。非核苷酸组分可中断连续核苷酸。可 选的连接基团可取代一个或多个磷酸二酯键。这些可选连接基团包括但不限于以下实施方 案，其中磷酸取代为 P(O)S( “thioate”)、P(S)S( “dithioate”)、(0)NR2( “酰胺化物”)、 P (0) R、P (0) OR，、⑶或CH2 ( "formacetal ”)，其中各R或R，独立地是H，或取代或非取代的 烷基(1-20C)，其任选地含有醚(-0-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或araldyl。多核苷酸 中并非所有的键需要均相同。多核苷酸可以是线性的或环形的或包含线性和环形部分的组
I=I O如本文所用，“多肽”指包含氨基酸并为本领域技术人员认为是蛋白质的组合物。 本文使用氨基酸残基的常规单字母或三字母密码。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中互换 用于指任何长度氨基酸的聚合物。聚合物可以是线性的或分支的，其可包含修饰的氨基酸， 并且非氨基酸可中断所述聚合物。该术语还包括已经经过天然修饰或干涉(例如二硫键形 成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化，或任何其他操作或修饰，如与标记成分的缀合)的氨 基酸聚合物。该定义中还包括，例如含有一个或多个氨基酸的类似物(包括例如，非天然氨 基酸等)，以及本领域已知的其他修饰的多肽。如本文所用，“载体”指设计用于将核酸引入一个或多个细胞类型中的多核苷酸序 列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、表达盒等。如本文所用，术语“表达”指在基因的核酸序列基础上产生多肽的过程。该过程包 括转录和翻译。如本文所用，“表达载体”指含有DNA编码序列(例如基因序列)的DNA构建体，所 述DNA编码序列有效连接能够在宿主中引起编码序列表达的一个或多个合适的控制序列。 此类控制序列包括引起转录的启动子、控制该转录的任选的操作子序列、编码合适的mRNA 核糖体结合位点的序列、和控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒，或 简单的可能的基因组插入片段。一旦转化到合适的宿主中，载体可独立于宿主基因组，或在 一些情况下整合到基因组中进行复制并行使功能。质粒是最常用的表达载体形式。然而，本发明旨在包括这类其他形式的表达载体，其行使等同功能，并且为本领域已知或变得为 本领域所知。“启动子”指参与结合RNA聚合酶以起始基因转录的调节序列。启动子可以是诱 导型启动子或组成型启动子。可用于本发明的诱导型启动子的非限制性实例来自里氏木霉 cbhl基因，其为诱导型启动子。“诱导型启动子”是在环境或发育调节条件下有活性的启动 子。术语“有效连接”指特定元件的并列或排列，其允许它们一致进行产生影响。例如， 如果启动子控制编码序列的转录，那么其有效连接编码序列。“在转录控制下”是本领域理解透彻的术语，其表示多核苷酸序列的转录取决于其 有效连接的促进转录起始或促进转录的元件。“在翻译控制下”是本领域理解透彻的术语，其表示在已经形成mRNA后发生的调节 过程。“基因”指参与产生多肽的DNA区段，并包括编码区之前和之后的区域，以及各编码 区段(外显子)之间的间隔序列(内含子)。如本文所用，术语“宿主细胞”指细胞或细胞系，向其中转染产生多肽的重组表达 载体用于表达多肽。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然、意外或刻意的突 变，所述后代与初始亲本细胞不必完全相同(在形态或总的基因组DNA互补物上)。宿主细 胞包括体内用表达载体转染或转化的细胞。术语“重组的”指如通过突变编码序列产生改变的多肽、将编码序列与另一基因的 编码序列融合、将基因置于不同启动子控制下、在异源生物中表达基因、以减少或升高水平 表达基因、以不同于其天然表达谱的方式有条件地或组成型地表达基因等修饰，以改变其 序列或表达特征的遗传物质(即，核酸、它们编码的多肽，和包含此类多核苷酸的载体和细 胞)。一般地，人为操作重组核酸、多肽和基于其上的细胞，使得它们不同于在自然界中发现 的相关核酸、多肽和细胞。“信号序列”指结合蛋白质N末端部分的氨基酸序列，其促进成熟形式的蛋白质从 细胞的分泌。成熟形式的细胞外蛋白质缺少在分泌过程中切掉的信号序列。术语“选择标记”或“选择性标记”指能够在宿主细胞中表达的基因，其允许方便 选择那些含有引入核酸或载体的宿主。选择性标记的实例包括但不限于抗微生物物质(例 如潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢优势，如营养优势的基因。术语“来自，，包括术语“起源于”、“获得”、“从中获得”、“分离自，，和“产生自”，一般 表示一种特定材料在另一特定材料中发现其起源，或具有另一特定材料描述的特征。术语“丝状真菌”指细分真菌亚门(Eumycotina)的所有丝状体形式(参阅， Alexopoulos, C. J. (1962)，Introductory MycoIory, Wiley, New York)。这些真菌的特征 在于营养菌丝体具有由壳多糖、纤维素和其他复合糖组成的细胞壁，并且在形态上、生理上 和遗传学上不同于酵母。丝状真菌的营养生长是通过菌丝伸长，并且碳代谢是完全需氧 的。丝状真菌亲本细胞可以是木霉属(Trichoderma)物种(例如里氏木霉(之前分类为 T. Iongibrachiatum,现在也禾尔为 Hypocrea jecorina)、绿色木霉(Trichoderma viride)、 i氏^Κβ (Trichoderma koningii)、哈茨(Trichoderma harzianum)等)白勺细Ifi0如本文所用，术语“木霉(属)”或“木霉属物种(Trichoderma sp.) ”指先前或目前分类为木霉属的任何真菌属。术语“培养”指在适合生长的条件下，在液体或固体培养基中培养微生物细胞群。术语“异源的”指多核苷酸或蛋白质时指特定宿主细胞中非天然发生的多核苷酸 或蛋白质。期望该术语包括天然发生的基因、突变基因和/或合成基因编码的蛋白质。相 反，术语“同源的”指多核苷酸或蛋白质时指宿主细胞中天然发生的多核苷酸或蛋白质。在向细胞中插入核酸序列的上下文中，术语“引入”包括“转染”、“转化”或“转导”， 并且指向真核或原核细胞中掺入核酸序列，其在所述真核或原核细胞中核酸序列可掺入细 胞的基因组内(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，转化成自主复制子或瞬时表达。“转染”或“转化”指外源多核苷酸插入宿主细胞中。外源多核苷酸可维持为非整 合载体，例如质粒，或可整合到宿主细胞的基因组中。术语“转染”旨在包括向宿主细胞中 引入核酸的所有常规技术。转染技术的实例包括但不限于，磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖-介 导的转染、脂质转染、电穿孔和显微注射。如本文所用，术语“转化”、“稳定转化”和“转基因”指具有非天然(例如异源)核 酸序列整合到其基因组内或作为通过多代维持的游离型质粒的细胞。如本文所用，术语“回收”、“分离”、“纯化”和“分离”指从其天然结合的至少一种 组分中回收的材料(例如蛋白质、核酸或细胞)。例如，这些术语可指这样的材料，其大体上 或基本上没有其天然状态中，例如完整的生物系统中发现的通常伴随的组分。如本文所用，“溶菌酶”指催化肽聚糖中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰-D-葡糖胺残基 和壳糊精中N-乙酰-D-葡糖胺残基之间的1，4- β键水解的酶(即，具有催化活性的多肽)。 溶菌酶通过水解连接N-乙酰胞壁酸与N-乙酰葡萄糖胺第四个碳原子的糖苷键攻击肽聚糖 (在细菌，特别是革兰氏阳性菌的细胞壁中发现)。“信号序列”(也称为“前序列”、“信号肽”、“前导序列”或“前导肽”)指在将多肽
靶向分泌途径的新生多肽氨基末端的氨基酸序列，并且一旦转运到内质网膜上就从新生多 肽上切割掉。相关(和衍生)蛋白质包括“变体”蛋白质。变体蛋白质通过小数量的氨基酸残 基不同于亲本蛋白质和/或其他蛋白质。在一些实施方案中，不同氨基酸残基的数量是大 约1、2、3、4、5、10、20、25、30、35、40、45或50中的任何一个。在一些实施方案中，变体通过 大约1到大约10个氨基酸而不同。或者或另外，如使用序列比对工具，如BLAST、ALIGN和 CLUSTAL(见下文)测定，变体与参照蛋白质或核酸可具有一定程度的序列同一性。例如，变 体蛋白质或核酸与参照序列可具有至少约35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、 75%,80%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%, 98%、99%、或甚至99.5%的氨基酸序列同一性。术语“同源性”和“同一性”不区分使用。如本文所用，术语“类似序列”指提供与参照蛋白质功能、三级结构和/或保守残 基类似的蛋白质中的多肽序列。例如，在含有α螺旋或β折叠结构的表位区域中，类似序 列内取代氨基酸维持相同的结构元件。在一些实施方案中，提供类似序列，其产生变体酶， 所述变体酶显示与变体来源的亲本蛋白质类似或改善的功能。如本文所用，“同源蛋白质”指与参照蛋白质(例如来自不同来源的溶菌酶)具有 相似功能(例如酶活性)和/或结构的蛋白质(例如过水解酶的酶)。同源物可来自进化 相关的或不相关的物种。在一些实施方案中，同源物具有与参照蛋白质类似的四级、三级和
9/或一级结构，由此潜在允许用来自同源物的类似区段或片段取代参照蛋白质的区段或片 段，与用来自非同源蛋白质的序列取代区段或片段相比减少对参照蛋白质的结构和/或功 能的破坏。如本文所用，“野生型”、“天然的”和“天然发生的”蛋白质是在自然界中发现的那 些蛋白质。术语“野生型序列”指在自然界中发现的或天然发生的氨基酸或核酸序列。在 一些实施方案中，野生型序列是蛋白质改造工程，例如产生变体蛋白质的出发点。在至少两个核酸或多肽的上下文中，短语“基本类似”和“基本相同”通常表示多 核苷酸或多肽包含这样的序列，其与参照序列(例如野生型)多核苷酸或多肽相比具有 至少约 35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或甚至 99. 5% 的序列同一 性。可使用已知算法如BLAST、ALIGN和CLUSTAL，使用标准参数测定序列同一性。(参阅 例如 Altshul 等(1990)J. Mol. Biol. 215 :403-410 ；Henikoff 等(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. 89 10915 ；Karin 等(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. 90 5873 ；和 Higgins 等(1988)Gene 73:237)。从 National Center for Biotechnology Information 中可公开获得用于进行 BLAST分析的软件。同样，可使用FASTA搜索数据库(Person等(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. 85 =2444-2448.)。在一些实施方案中，基本相同的多肽仅通过一个或多个保守氨基酸 取代而不同。在一些实施方案中，基本相同的多肽是免疫上交叉反应的。在一些实施方案 中，基本相同的核酸分子在严格条件(例如在中等到高度严格范围内)下彼此杂交。术语“抗微生物活性”指对微生物(例如细菌或真菌细胞)生长的部分或完全抑 制，和/或对微生物细胞的裂解。缩写“MIC”指最小抑制浓度。“ATCC”指位于Manassas，Va. 20108 (www. atcc. org)的美国典型培养物保藏中心。"NRRL，，指 Agricultural Research Service Culture Collection, National Center for Agricultural Utilization Research(之前禾尔为)USDA Northern Regional Research Laboratory), Peoria,111。“一个” “该”和“所述”包括复数参考，除非上下文清楚地另有说明。 NSP38多肽和多核苷酸本发明的一方面提供来自里氏木霉的本文称为“NSP38”的多肽，其具有抗微生物 活性。在图4中显示了编码该蛋白质的里氏木霉多核苷酸序列(SEQ ID NO :3)，并且在图5 中显示了推导的氨基酸序列(SEQ IDNO :4)。使用将该序列与其他已知信号序列相关联的 软件模型预测了信号序列(图5中粗体所示)。推导的氨基酸序列包括228个氨基酸残基， 包括预测的20个氨基酸信号序列。剩余的序列是成熟多肽的序列。图4中所示的多核苷酸序列在下文实施例1中所述表达载体背景中转化到里氏木 霉中，并如图3中所示进行表达。推导的成熟多肽的分子量是22，246道尔顿，并且基于氨 基酸组成预测的等电点是5. 60。如上述实例中所详细描述的，显示该多肽显示细菌裂解活 性，并在酸性PH处而非中性pH处具有最高活性。本发明的另一方面提供SEQ ID NO 4的变体或从SEQ IDNO 4切割信号序列后 产生的成熟蛋白质的变体，其中所述变体与野生型NSP38多肽具有相同的抗微生物活性，或比其高的抗微生物活性。变体相对于SEQ ID NO :4的多肽可包括取代、缺失、插 入或化学修饰。变体中包括的示例性取代是保守氨基酸取代，如在下表中列出的那些取
原始氣基酸 残基密 码可接受的取代丙氨酸AD-Ala、Gly、P-Ala、L-Cys、D-Cys精氨酸RD-Arg、Lys、D-Lys、高精氣酸、D-高精 氣酸、Met、lie、D-Met, D-Ile、Orn, D-Orn天冬酰胺ND-Asn、Asp、D-Asp、Glu、D-Glu、 Gin、D-Gln天冬氨酸DD-Asp、D-Asn、Asn、Glu、D-Glu、 Gln、D-Gln半胱氨酸CD-Cys、S-Me-Cys、Met、D-Met, Thr、 D-Thr谷氨醜象QD-Gln, Asn、D-Asn, Glu、D-Glu、 Asp、D-Asp谷氨酸ED-Glu、D-Asp、Asp、Asn、D-Asn、 Gin, D-Gln甘氨酸GAla、D-Ala、Pro、D-Pro、b-Ala、Acp异亮氨酸ID-Ile、Val、D-Val、Leu, D-Leu、 Met、D-Met亮氨酸LD-Leu, Val, D-Val、Leu、D-Leu, Met、D-Met赖氨酸KD-Lys、Arg、D-Arg、高精氛酸、D-高精 氨酸、Met、D-Met, lie、D-Ile、Orn、 D-Orn甲硫氨酸MD-Met、S-Me-Cys、lie、D-Ile、Leu, D-Leu, Val, D-Val笨丙氨酸FD-Phe、Tyr、D-Thr、L-Dopa、His、 D-His、Trp、D-Trp、反式-3，4 或 5-苯基 脯氨酸、顺式-3,4，或5-苯基脯氨酸脯氨酸PD-Pro > L-I-意唑烷(thioazolidine ) -4-羧 酸、D-或L-1-嘌唑烷-4-欺酸丝氨酸SD-Ser、Thr、D-Thr、allo-Thr、Met、 D-Met, Met(O)、 D-Met(O)、L-Cys、 D-Cys
1权利要求
来自里氏木霉并具有抗微生物活性的重组多肽(NSP38)。
2.权利要求1的多肽，其中所述抗微生物活性是细菌细胞壁裂解活性。
3.权利要求1的多肽，其中所述抗微生物活性是1，4-β-N-乙酰胞壁质酶活性。
4.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述抗微生物活性的特征在于部分或完全抑制 微生物细胞的生长。
5.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述抗微生物活性的特征为在微生物生长中的 延长滞后期效应。
6.前述权利要求中任一项的多肽，其中具有抗微生物活性的多肽对抗的微生物细胞是 细菌或真菌细胞。
7.权利要求1-6中任一项的多肽，其包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO :4所示的多肽，或从所述多肽切割信号序列后产生的成熟蛋白质具有至少85%序列同一性。
8.权利要求1-6中任一项的多肽，其基本上由与SEQID NO :4所示的多肽，或从所述 多肽切割信号序列后产生的成熟蛋白质具有至少85%序列同一性的氨基酸序列组成。
9.权利要求1-6中任一项的多肽，其具有SEQID NO :4所示的氨基酸序列。
10.前述权利要求中任一项的多肽，其在酸性PH处具有抗微生物活性。
11.分离的多核苷酸，其编码前述权利要求中任一项的多肽。
12.载体，其包含权利要求11的多核苷酸。
13.宿主细胞，其包含权利要求12的载体。
14.用于在清洗过程中减少织物上微生物负荷的组合物，其包含权利要求1-10中任一 项的多肽。
15.权利要求14的组合物，其还包含一种或更多溶素、蛋白酶、过水解酶、脂肪酶、磷脂 酶、氧化酶、内切糖苷酶、糖酶，和其他微生物细胞壁降解酶。
16.权利要求14或15的组合物，其中与不包含所述多肽或其变体的相同组合物相比， 所述组合物产生更少的恶臭。
17.用于食品保藏的组合物，其包含权利要求1-10中任一项的多肽。
18.用于表达NSP38多肽或其变体的方法，其包括在适合表达的条件下，在培养基中培 养已经转化了编码所述NSP38多肽的多核苷酸的宿主细胞。
19.权利要求18的方法，其还包括从所述宿主细胞或培养基中回收所述多肽。
20.权利要求18的方法，其中所述多肽包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO 4所示的多肽，或从所述多肽切割信号序列后产生的成熟蛋白质具有至少85%序列 同一性。
21.用于抑制微生物生长的方法，其包括使微生物细胞与NSP38多肽或其变体接触，由 此抑制所述细胞的生长。
22.权利要求21的方法，其中所述方法在酸性ρΗ处进行。
23.权利要求21或22的方法，其中所述多肽包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列与 SEQ ID NO :4所示的多肽，或从所述多肽切割信号序列后产生的成熟蛋白质具有至少85% 序列同一性。
24.回收微生物产生的蛋白质的方法，其包括使表达蛋白质的微生物细胞与NSP38多肽或其变体接触，由此引起细胞裂解，并回收所述微生物细胞表达的蛋白质。
25.权利要求24的方法，其中所述多肽包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO 4所示的多肽，或从所述多肽切割信号序列后产生的成熟蛋白质具有至少85%序列 同一性。
全文摘要
本发明提供来自里氏木霉的具有抗微生物活性的真菌多肽、编码该多肽的多核苷酸、包含该多肽和多核苷酸的组合物及其使用方法。
文档编号C12N15/56GK101945996SQ200980104764
公开日2011年1月12日 申请日期2009年2月11日 优先权日2008年2月11日
发明者A·范齐蒙耐德, J·姚, P·范索林格恩 申请人:丹尼斯科美国公司