一种微生物发酵产苯丙氨酸的方法
【专利摘要】本发明涉及一种高效、安全的微生物发酵生产L-苯丙氨酸方法，属于生物工程【技术领域】。通过硫酸铵浓度和有机氮源种类优化，以及多阶段L-酪氨酸指数补料方法，显著提高发酵液中L-苯丙氨酸的浓度。L-苯丙氨酸产量达到56g/L左右。同时，硫酸铵、酵母粉和L-酪氨酸用量较普通发酵方法相比明显减少，大大降低了L-苯丙氨酸的生产成本。
【专利说明】一种微生物发酵产苯丙氨酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，涉及一种发酵制备L-苯丙氨酸的新方法，具体是对发酵生产L-苯丙氨酸的过程，进行了氮源的优化以及多阶段指数L-酪氨酸补料策略的提出。
【背景技术】
[0002]L-苯丙氨酸，又称L-苯基丙氨酸，是人体必需的但无法自行合成的八种必需氨基酸之一，广泛应用于医疗药品、化妆品、食品及其添加剂领域，特别的，作为合成甜味剂阿斯巴甜的原料之一。L-苯丙氨酸的传统生产方法是化学合成法和酶法，但是化学合成法具有环境污染、产物大多是消旋体，后续加工工艺复杂；酶法具有原料昂贵等缺点。考虑到环境和生产成本问题，最经济的同样也是被人们广泛使用的是微生物发酵法。
[0003]L-苯丙氨酸的生产菌株，大多数是L-酪氨酸营养缺陷型的。发酵过程中过量添加L-酪氨酸，则会造成细胞的大量生长，从而使得更少的碳流流向L-苯丙氨酸的合成；添加的L-酪氨酸过少，则会引起细胞生长缓慢甚至过少，从而没有足够的菌体产生更多的L-苯丙氨酸。目前，L-酪氨酸补料有进行恒定速度流加，有根据L-酪氨酸消耗速率流加，有根据发酵过程的OUR的相关公式流加，也有L-酪氨酸指数补料的。中国专利CN102212569A公开了一种提高L-苯丙氨酸生产强度的L-酪氨酸流加的方法。在初始培养基中L-酪氨酸消耗完毕后，其以25mg/h-100m g/h恒速流加至发酵结束。由此，本发明提出了多阶段指数流加L-酪氨酸的策略，从而达到提高L-苯丙氨酸，降低生物制备L-苯丙氨酸的生产成本，提闻经济效益的目的。
[0004]另外，发酵过程的氮源，不仅维持细胞的正常生长，而且在产L-苯丙氨酸的过程中起着重要的作用。由此，微生物发酵产L-苯丙氨酸过程中，进行氮源的优化，包括硫酸铵浓度和有机氮源种类的优化。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种发酵生产L-苯丙氨酸的方法，以达到产量提高，以及原料的减少。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0006]一种生产L-苯丙氨酸的发酵方法,包括菌种活化、种子培养、发酵培养,其特征在于，还包括多阶段指数L-酪氨酸补料策略。
[0007]进一步的，所述的方法还包括发酵培养基中氮源的优化。
[0008]进一步的，所述的发酵的菌株为大肠杆菌BL21 (pET/P-aspC)。
[0009]进一步的，所述的多阶段指数L-酪氨酸补料策略具体步骤如下:发酵12h后开始补加L-酪氨酸；12-32h维持菌体比生长速率在0.08h-1 ;32_52h，维持菌体比生长速率为0.05h-1 ；52-72h,维持菌体比生长速率为0.02h'
[0010]进一步的，初始L-酪氨酸浓度为0-2.4g/L，优选的为0.3_lg/L。
[0011]进一步的，所述的氮源优化包括对发酵培养基中硫酸铵浓度和有机氮源种类的优化。
[0012]进一步的，所述的硫酸铵的浓度为0_30g/L，优选的在5g/L以下。
[0013]进一步的，所述的有机氮氮源的优化为单一有机氮源优化，其种类及其浓度为酵母粉10g/L、玉米浆干粉11.5g/L、棉籽饼粉10g/L、豆饼浸粉7.9g/L、蛋白胨9.2g/L。
[0014]进一步的，所述的有机氮氮源的优化为复合有机氮源优化，其种类及其浓度为酵母粉5g/L和玉米浆干粉5.75g/L，蛋白胨4.6g/L和玉米浆干粉5.75g/L，酵母粉5g/L和蛋白胨4.6g/L，优选的，为酵母粉和玉米浆干粉复合有机氮源。
[0015]进一步的，所述有机氮源的总氮量是相当，并且复合有机氮源中两个单一有机氮源是按其含氮量1:1添加
[0016]本发明的有益效果在于:
[0017]本发明通过对氮源的优化设计，减少硫酸铵用量和利用一些廉价的有机氮源替代一些昂贵的有机氮源，同时通过多阶段指数L-酪氨酸补料策略的提出减少了 L-酪氨酸的流加量，从而达到提高L-苯丙氨酸产量，降低生物制备L-苯丙氨酸的生产成本，提高经济效益，有利于L-苯丙氨酸生物法的工业制备。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为不同浓度的硫酸铵条件下大肠杆菌BL21 (pET/P-aspC)发酵制备L-苯丙氨酸的趋势图图2为不同种类的有机氮源条件下大肠杆菌BL21 (pET/P-aspC)发酵制备L-苯丙氨酸的趋势图(注:YE酵母粉，CSP玉米浆干粉，CP棉籽饼粉，SP豆饼浸粉，T蛋白胨，CSPYE酵母粉和玉米浆干粉，CSPT蛋白胨和玉米浆干粉，YET酵母粉和蛋白胨)。
[0019]图3为不同初始酪氨酸条件下，大肠杆菌BL21 (pET/P-aspC)的不同比生长速率对应的比合成L-苯丙氨酸的合成速率的趋势图
[0020]图4 (a)和(b)为大肠杆菌BL21 (pET/P-aspC)采用多阶段指数L-酪氨酸补料策略，(a)是不同L-酪氨酸流加速率、设定的比生长速率和真实的比生长速率的时间趋势，(b)细胞干重、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸浓度的时间趋势。注:FtK为酪氨酸流加速度，μ为比生长速率，Uset为设定的比生长速率
【具体实施方式】
[0021 ] 下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。
[0022]本实施例采用菌株为大肠杆菌BL21 (pET/P-aspC)，(宫长斌等，过程工程学报，2007年第7卷第3期，254-258)。该出发菌株系 申请人:拥有的在先公开文献公开的菌株，由 申请人:自行保藏， 申请人:在此声明从本专利申请日起免费发送该出发菌株。
[0023]实施例1本实施例说明利用大肠杆菌BL21产L-苯丙氨酸的方法，由本实验室保存。(大肠杆菌BL21购自北京全式金生物技术有限公司)
[0024]具体包括以下步骤:
[0025](I)菌种活化:斜面培养时，菌株在斜面培养基中进行平板划线后，在恒温培养箱中培养，温度30-40°C，活化培养时间l-2d，用于种子培养基接种和菌株保存；
[0026] (2)种子培养:向500mL三角瓶中加入种子培养基50mL，高压蒸汽121°C灭菌20min,冷却后接入斜面培养基菌株，培养温度30-40°C，摇床转速培养时间l_2d ;[0027](3)发酵培养:1L发酵罐中发酵培养基体积0.5-0.8L,接种量5% -10% (v/v)，温度30-40°C，搅拌速度200-500rpm，通气量是0.5-0.8vvm。发酵过程中通过添加氨水和2mol/L盐酸控制pH在7.0左右，发酵时间72h。
[0028]所述斜面培养基/种子培养基配方为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaC15g/L,pH7.0,固体培养基加琼脂15g/L ；
[0029]所述发酵培养基配方为葡萄糖25g/L、(NH4)2S045g/L、KH2P043g/L、MgS043g/L、NaCllg/L、柠檬酸钠 1.5g/L, CaCl2.2Η200.015g/L、FeSO4.7Η200.1125g/L、L-Tyr0.3g/L、酵母粉 10g/L、维生素 10.0758/1、TESL 5mL/L ;其中 TES 组成为:Al2 (SO4)3.18H202g/L、CoSO4.7H200.75g/L、CuSO4.5H200.25g/L、H3BO30.5g/L、MnSO4.7H2024g/L、Na2MoO4.2H203g/L、NiSO4.6H202.5g/L、ZnSO4.7H2015g/L ;当葡萄糖耗完后，补加700g/L的葡萄糖，并控制葡萄糖浓度在5g/L左右；当发酵12-18h后，以0.06g/h的速度进行L-酪氨酸补料，
[0030]产L-苯丙氨酸含量在2.8g/L左右。
[0031]实施例2本实施例说明大肠杆菌BL21 (pET/P-aspC)制备L-苯丙氨酸的优化方法，主要涉及硫酸铵浓度的优化
[0032]本实施例采用菌株为大肠杆菌BL21 (pET/P-aspC)，发酵培养基中的硫酸铵浓度(g/L)分别为0、5、10、20、30，其他的培养和发酵方法与实施例1相同。
[0033]本实施例中，采用不同浓度的硫酸铵发酵制备L-苯丙氨酸，结果如图1所示。硫酸铵含有菌体生长和氨基酸生产所需的氮，但是铵根离子的过量供应会导致竞争性抑制问题。有研究表明，超过3-5g/L的铵浓度往往会引起抑制作用。如图1所示初始10g/L的硫酸铵就对菌体生长和产L-苯丙氨酸起抑制作用。在产L-苯丙氨酸的发酵培养基中添加硫酸铵的最优浓度是0-5g/L，此时产L-苯丙氨酸含量在20g/L左右。
[0034]实施例3本实施例说明大肠杆菌BL21 (pET/P-aspC)制备L-苯丙氨酸的优化方法，主要涉及有机氮源种类的优化
[0035]本实施例采用菌株为大肠杆菌BL21 (pET/P-aspC)，发酵培养基中的有机氮源的种类改变，其他的培养和发酵方法与实施例1相同。
[0036]上述的有机氮源分别为单一的有机氮源和复合的有机氮源，并且添加的有机氮源的总氮量是相当；复合的有机氮源中两个单一有机氮源是按其含氮量1:1添加的；单一的有机氮源的种类及其浓度为酵母粉10g/L、玉米浆干粉11.5g/L、棉籽饼粉10g/L、豆饼浸粉
7.9g/L、蛋白胨9.2g/L ;复合的有机氮源及其浓度为酵母粉5g/L和玉米浆干粉5.75g/L，蛋白胨4.6g/L和玉米浆干粉5.75g/L，酵母粉5g/L和蛋白胨4.6g/L。
[0037]本实施例中，采用不同种类的有机氮源发酵制备L-苯丙氨酸，结果如图2所示。有机氮源中含有多种氨基酸、核酸、微量元素等，有利于细胞的生长和L-苯丙氨酸的发酵。如图2所示，玉米浆和酵母粉混合氮源是最优的有机氮源，对菌体生长和产L-苯丙氨酸起着重要的作用，此时产L-苯丙氨酸达28.lg/L。
[0038]实施例4本实施例说明大肠杆菌BL21 (pET/P-aspC)制备L-苯丙氨酸的优化方法，主要涉及初始酪氨酸浓度的优化
[0039]本实施例采用菌株为大肠杆菌BL21 (pET/P-aspC)，发酵培养基的初糖浓度和初始L-酪氨酸浓度改变以及不进行葡萄糖和L-酪氨酸的补料，其他的培养和发酵方法与实施例I相同；初始L-酪氨酸的浓度分别为O, 0.3，I, 1.7，2.4g/L ；以及初糖浓度为65g/L。[0040]本实施例中，采用不同初始L-酪氨酸浓度发酵制备L-苯丙氨酸，结果如表1所示。采用在不同初始酪氨酸浓度条件下，不同比生长速率对应的比合成L-苯丙氨酸的合成速率的趋势如图3所示。如表1所示，随着L-酪氨酸浓度的上升，L-苯丙氨酸含量缓慢上升，但是平均L-苯丙氨酸比合成速率是逐渐下降的，平均比生长速率是逐步上升的，于是得出L-酪氨酸初始浓度在0.3左右最佳以及L-酪氨酸对酪氨酸缺陷型菌株起着重要的作用:L-酪氨酸添加过少，细胞生长缓慢，产L-苯丙氨酸也不多，L-酪氨酸添加过多，细胞生长过快，相对少的碳流向L-苯丙氨酸的合成。由图3得出，在0.3、1、2.4g/L初始酪氨酸浓度下，得到其对应的最大L-苯丙氨酸比合成速率；当比生长速率高于对应最大L-苯丙氨酸比合成速率的比生长速率，L-苯丙氨酸比合成速率随着比生长速率的减小而下降。这可能是当比生长速率降到特定的值，碳流可能逐渐的从细胞生长流向L-苯丙氨酸的积累。又由图3得出，当比生长速率低于0.0Sh-1,曲线的斜率代表L-苯丙氨酸对细胞的得率；这是个常数，并随着L-酪氨酸浓度的上升而下降。由此得出，可以通过控制比生长速率来控制L-苯丙氨酸比合成速率，而比生长速率可以通过L-酪氨酸的补料来控制。
[0041]表1不同初始L-酪氨酸浓度发酵制备L-苯丙氨酸
[0042]
【权利要求】
1.一种生产L-苯丙氨酸的发酵方法,包括菌种活化、种子培养、发酵培养,其特征在于，还包括多阶段指数L-酪氨酸补料策略。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括发酵培养基中氮源的优化。
3.根据权利要求1-2所述的方法，其特征在于，发酵的菌株为大肠杆菌BL21(pET/P-aspC)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的多阶段指数L-酪氨酸补料策略具体步骤如下:发酵12 h后开始补加L-酪氨酸；12-32 h维持菌体比生长速率在0.08 ；32-52 h，维持菌体比生长速率为0.05 ；52-72 h,维持菌体比生长速率为0.02 h'
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，初始L-酪氨酸浓度为0-2.4 g/L，优选的为 0.3-1 g/Lο
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的氮源优化包括对发酵培养基中硫酸铵浓度和有机氮源种类的优化。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的硫酸铵的浓度为0-30g/L，优选的在5 g/L以下。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的有机氮氮源的优化为单一有机氮源优化，其种类及其浓度为酵母粉10g/L、玉米浆干粉11.5g/L、棉籽饼粉10g/L、豆饼浸粉7.9 g/L、蛋白胨 9.2g/L。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的有机氮氮源的优化为复合有机氮源优化，其种类及其浓度为酵母粉5g/L和玉米浆干粉5.75g/L，蛋白胨4.6g/L和玉米浆干粉5.75g/L，酵母粉5g/L和蛋白胨4.6g/L，优选的，为酵母粉和玉米浆干粉复合有机氮源。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述有机氮源的总氮量是相当，并且复合有机氮源中两个单一有机氮源是按其含氮量1:1添加。
【文档编号】C12R1/19GK104004798SQ201410277338
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月19日 优先权日:2014年6月19日
【发明者】陈可泉, 袁佩佩, 何珣, 曹伟佳, 王震, 肖文, 赵艳, 欧阳平凯 申请人:南京工业大学