Hspa12a基因作为治疗脑梗死药物筛选靶标的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了HSPA12A基因作为治疗心肌梗死药物筛选靶标的应用。根据HSPA12A通过降低血脑屏障通透性、减轻脑神经元凋亡从而显著改善局灶性脑缺血/再灌注损伤这一特性，可将HSPA12A作为设计开发用于脑梗死药物治疗的靶分子，筛选能使HSPA12A高表达从而对血脑屏障、神经细胞的凋亡、脑缺血/再灌注损伤、脑组织的纤维化都有非常显著改善作用的药物。该药物具有作用特异、治疗靶标明确的优点。
【专利说明】HSPA12A基因作为治疗脑梗死药物筛选靶标的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物化学领域，特别涉及HSPA12A基因作为治疗脑梗死药物筛选靶标的应用。
【背景技术】
[0002]脑血管病是导致人类死亡的三大疾病之一，以缺血性脑血管病最常见，约占全部脑血管病的80%，病死率和致残率高，严重影响着人类的预期寿命和生活质量。50岁以上的老年人发病率高，男性比女性高。在世界范围内，脑卒中是导致人类死亡的第3位死因和致残的主要原因。脑梗死是指局部脑组织因供血障碍而发生的缺血性坏死，其根本原因是在颅内或颅外动脉狭窄或闭塞下，侧支循环又不足以代偿性供血，而导致局部脑组织发生缺血性坏死。而脑组织长期缺血缺氧后又将逐渐发生结构和功能的重塑(remodeling)，其突出表现是血脑屏障通透性升高，脑神经元细胞凋亡，脑组织纤维化，引起语言、运动、记忆等功能障碍或并发感染，甚至引起死亡。因此，尽快开通阻塞血管，促使缺血脑组织恢复原有结构和功能是治疗的根本。然而脑缺血的病理生理过程极为复杂，其中脑缺血再灌注可导致严重的迟发性神经元损伤，影响患者的预后和功能恢复，故改善脑缺血再灌注损伤可以有效改善患者预后，有利于患者功能的恢复。
[0003]热休克蛋白与心脑血管疾病有着密切的关联，越来越多的研究显示某些热休克蛋白参与神经元的保护和损伤作用，特别是在缺血性脑损伤的实验模型中。例如:高表达HSP70, HSP32和HSP27的转基因小鼠已被证明具有缺血性脑损伤的神经保护作用。相反，有针对性地破坏HSpll0/105基因能减轻缺血性损伤。热休克蛋白在缺血性脑损伤中的重要作用逐步被认识， 将有利于解决脑缺血再灌注所造成的脑损伤问题，因此有人将HSPs看成是脑卒中治疗的一个新靶点。我们设想，是否可以寻找到一种新型的、与缺血性脑损伤关系更为密切或者说是具有特异性的基因，从而提高治疗疗效。
[0004]2003年，韩志华等人发现人类动脉粥样硬化斑块中有HSPA12A表达。由于HSPA12A基因序列和结构域与HSP70具有同源性而被归类成HSP70家族成员，但HSPA12A结构域并不典型，并被245-311个氨基酸序列分隔两部分，这段分隔片断的生物功能尚不清楚。目前关于HSPA12A的研究并不多，仅有的几篇报道证实它和脑的关系十分密切。Zhihua Han等研究表明人和小鼠体内HSPA12A在脑组织中的表达量要远远高于心、肝、肾等其他组织。Pongrac JL等应用原位杂交技术发现HSPA12A基因转录在人类特定神经元和特定脑区高度表达，额叶、枕叶皮层最高。
[0005]迄今为止，未见关于HSPA12A表达在治疗缺血性脑卒中应用的公开报道。本研究小组在最近的研究中，发现HSPA12A表达对急性脑梗死后结构和功能重塑有显著的治疗作用。
【发明内容】
[0006]发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供HSPA12A基因作为治疗心肌梗死药物筛选靶标的应用。
[0007]技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为:
[0008]本发明提供了 HSPA12A基因作为治疗心肌梗死药物筛选靶标的应用。具体为:将HSPA12A基因在脑组织中的表达作为一种新的靶点来筛选治疗缺血性脑卒中药物。
[0009]本发明提供了 HSPA12A基因在心肌梗死药物筛选中的应用。
[0010]人类HSPA12A基因定位于10q26.12，全长5721bp(图1)，编码710个氨基酸多肽链(图 2) (GeneBank:ΑΒ007877.I)。
[0011]有益效果:与现有技术相比，本发明具有以下优点:本发明根据HSPA12A可以显著改善由脑梗死引起的血脑屏障通透性增加、脑缺血组织重塑，且促进脑梗死周围区的血管新生和降低脑梗死周围区的细胞凋亡率这一特性，可将HSPA12A作为设计开发用于脑梗死治疗药物的靶分子，筛选能使HSPA12A高表达从而对血脑屏障、神经细胞的凋亡、脑缺血/再灌注损伤、脑组织的纤维化都有非常显著改善作用的药物，具有药物作用特异、治疗靶标明确的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为HSPA12A在小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、骨骼肌七种组织中的表达量。
[0013]图2为与假手术组相比，缺血再灌注(I/R)后脑组织胞浆和胞核蛋白中HSPA12A表达量均降低。
[0014]图3Α为提取鼠尾DNA，PCR法鉴定显示HSPA12A基因敲除小鼠构建成功。
[0015]图3Β为基因敲除小鼠(KO)脑组织中几乎没有HSPA12A表达。
[0016]图4为HSPA12A基因敲除加重I/R引起的神经学损伤图。
[0017]图5为HSPA12A基因敲除增大IR引起的梗死体积。
[0018]图6为HSPA12A的敲除增大IR导致的海马损伤(HE染色)。
[0019]图7为HSPA12A的敲除增大IR导致的海马损伤(尼氏染色)。
[0020]图8为HSPA12A基因的缺失使IR引起的凋亡增多。
[0021]图9为野生型和HSPA12A基因敲除鼠在IR后GSK3P的表达。
[0022]图10为野生型和HSPA12A基因敲除鼠在IR后β -catenin的表达。
[0023]图11为野生型和HSPA12A基因敲除鼠在IR后Bax Bcl2的表达。
[0024]图12为加用氯化锂后HSPA12A基因敲除对I/R引起的梗死体积的影响。
[0025]图13为加用氯化锂后HSPA12A基因敲除对I/R引起的神经学损伤的影响。
[0026]图14为加用氯化锂后HSPA12A基因敲除对I/R导致的海马损伤的影响(尼氏染色)。
[0027]图15为加用氯化锂后野生型和HSPA12A基因敲除鼠在IR后p_GSK3 β的表达。
【具体实施方式】
[0028]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0029]实施例1HSPA12A基因缺失加重脑缺血再灌注损伤
[0030]1.1实验材料:
[0031]实验组:8-10周HspA12A基因敲除小鼠(HSPA12A K0)，该小鼠通过构建人类
[0032]HSPA12A的基因敲除鼠并经6代回交获得遗传稳定的转基因品系制得；
[0033]对照组:年龄性别相匹配的野生型小鼠(HSPA12A WT)。
[0034]1.2实验仪器:
[0035]移液器；电子天平；2400型PCR仪；LX_100手掌型离心机；DGG_9070A型电热恒温鼓风干燥箱；荧光显微镜；心脏二维超声仪；超纯水机；小鼠呼吸机；剪刀、镊子、血管钳；可见光光度计；电动匀浆器；垂直电泳槽、电泳电源及转移装置；全自动恒温酶标仪；低温超速离心机；pH检测仪PVDF膜。
[0036]1.3实验方法
[0037]以大脑中动脉线栓法(MCAO)构建局灶性脑缺血模型。缺血时间lh，再灌注时间为3-24h(因具体实验而定)。对照为假手术组，即只做解剖和分离动脉的操作，不插线栓塞。
[0038]1.4实验结果
[0039]a) HSPA12A基因在小鼠各组织中的表达情况。
[0040]A.实验动物选取:8-10周龄(24_26g)、雄性C57/B6鼠。
[0041]B.Western Blot法测定HSPA12A在小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、骨骼肌七种组织中的表达量。
[0042]C.利用免疫荧光共染，检测HSPA12A定位于脑组织中哪种类型的细胞:收集脑组织，制备冰冻切片，然后进行免疫荧光共染，确定HSPA12A是否特异性表达于神经元细胞。
[0043]结果见图1，由图可知，HSPA12A在脑组织中表达量最大。
[0044]b)脑缺血再灌注后，野生型鼠脑组织中HSPA12A的表达情况。
[0045]WT鼠分为假手术、MCAO后再灌注不同时间如0.5h、3h、9h、24h，收集脑组织，用Western Blot法比较HSPA12A的表达情况。
[0046]结果见图2，由图可知，与假手术组相比，缺血再灌注(I/R)后脑组织胞浆和胞核蛋白中HSPA12A表达量均降低。
[0047]c)HSPA12A缺失对脑缺血再灌注损伤的影响。
[0048]A.基因型鉴定:PCR法(鼠尾DNA)、Western Blot法(脑组织)验证HSPA12A基因敲除成功，见图3A和图3B ;图3A显示提取鼠尾DNA，PCR法鉴定显示HSPA12A基因敲除小鼠构建成功，而图3B显示基因敲除小鼠(KO)脑组织中几乎没有HSPA12A表达。
[0049]B.评价HSPA12A基因缺失对脑缺血再灌注损伤的影响(加重或减轻)。
[0050]
【权利要求】
1.HSPA12A基因作为治疗心肌梗死药物筛选靶标的应用。
2.HSPA12A基因在心 肌梗死药物筛选中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104131074SQ201410277035
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年6月19日 优先权日:2014年6月19日
【发明者】吴军, 刘莉, 丁正年, 毛宇 申请人:吴军, 刘莉, 江苏省人民医院