专利名称：一种亲和筛选菠萝蛋白酶的亲和配基的方法
技术领域：
本发明属亲和配基筛选方法领域，特别是涉及一种亲和筛选菠萝蛋白酶的亲和配 基的方法。
背景技术：
目前，亲和色谱技术已经愈发成熟，也更多的运用到生产实践中去，但同时，也遇 到了相应的瓶颈问题。随着生物学技术的快速发展和壮大，市场上对于高纯度的生物大分 子的需求也是越来越大，然后落后的传统色谱技术不能完全跟上市场的需求分离成本大， 纯化时间长，操作工序繁琐等问题一直困扰着色谱领域的科学家。如何找到一个合适的配基，能够一对一单独吸附一种生物大分子比如某种蛋白质 或者酶，这是目前色谱领域亟待解决的一个难题。近十几年来，由于化学上的组合化学技术 和生物学上的高通量生物筛选技术的蓬勃发展，仿生配基的研究也应运而生，研究者们设 法变被动为主动，从以前的盲目通过试误法一个个筛选寻找目标蛋白配基的方法逐渐向利 用高通量技术随机寻找仿生配基来替代以前的三嗪染料配基和金属螯合物配基。例如已经 有研究者利用组合筛选方法，通过大量试验与淘洗，筛选出小分子仿生配基作为目标蛋白 的亲和配基。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种亲和筛选菠萝蛋白酶的亲和配基的方法， 该方法简单，成本低廉，大肠杆菌与噬菌体的生物资源丰富；选出来的对菠萝蛋白酶有亲和 作用的7肽配基对菠萝蛋白酶有较高的亲和作用，并且能够发现其一致序列，对于蛋白质 组学中的蛋白质互相作用提供丰富的实验数据。本发明的一种亲和筛选菠萝蛋白酶的亲和配基的方法，包括(1)生物淘洗(筛选)酶标板包被100 300 μ 1菠萝蛋白酶溶液，4°C轻微震 荡，孵育12-24h，之后冲洗包被液，加满封阻液，0 4°C静置1 2h，完成后去除封阻液，用 TBST缓冲液迅速洗酶标板2 10次；噬菌体7肽库以5 10倍稀释度加入所述酶标板的 酶标孔中，摇动1 池，TBST缓冲液迅速洗酶标板2 10次，用50 100 μ g/ml游离菠萝 蛋白酶分子TBS洗脱液竞争性洗脱吸附在固相酶标板上的噬菌体，室温摇动1 池，洗脱下 来的噬菌体作滴度测试；(2)噬菌体定向扩增与富集挑取ER2738菌株培养于LB-Tet培养液中，25 37°C 180 200rpm振荡培养过夜，次日用LB培养液(不加抗生素I~et)l 50 1 100 稀释并再次培养待用，步骤(1)噬菌体洗脱液定量加入至上述大肠杆菌菌液中，25 37°C， 60 IOOrpm感染1 2h，0 4°C，离心10 20min，去上清，菌体重悬至100 200ml LB 培养液中培养8 14h，取培养后的菌液0 4°C，离心10 20min，取上清，加入体积比为 1 3 1 6的聚乙二醇和氯化钠，震荡混勻后冰置1 2h，在0 4°C，8000 15000rpm 离心10 20min去上清，沉淀物重悬于1 ^iil TBS溶液，再加体积比为1 3 1 6的聚乙二醇和氯化钠溶液进行再沉淀，冰置1 2h后，0 4°C，8000 12000rpm离心10 20min,弃上清，再快速离心移去残余上清液，沉淀重悬于100 200 μ 1 TBS, 0. 01 0. 02%
NaR3中，得扩增后的噬菌液；(3)滴度测试将上述扩增后的噬菌液分别用TBS缓冲液稀释10 IO3倍，噬菌 液加入到大肠杆菌菌液，快速震荡混勻，室温温育2 5min，然后将感染的菌液注入40 50°C的顶层琼脂试管中，快速震荡混勻并立即倾注于25 37°C预温的LB/IPTG/Xgal平板 上，均勻铺开，25 37°C倒置培养12-24h，之后计数平板；(4)单克隆噬菌体扩增挑取上述LB-IPTG/Xgal平板上蓝色噬菌斑10 20个分 别装入上述1 2ml ER2738菌液中(0D A600 = 0 . 2 0. 5)，25 37°C 180 220rpm震荡 培养4 5h，离心后取上清液即得单克隆扩增液；(5)ELISA测试100 300 μ 1 ρΗ 8. 6菠萝蛋白酶0 4°C包被12_24h，吸出包被 液，加满封阻液，25 37°C静置1 2h，完成后吸出封闭液，用TBST快速洗板2 10次，每 孔加入100 300 μ 1 TBST，每排第二孔加入10-20 μ 1的单克隆扩增液，并稀释至12孔， 25 37°C缓慢震荡1 池，甩出单克隆扩增液，TBST洗涤6 10次后，每孔加入100 300ul抗fd噬菌体生物素复合物(Anti-fd-Biotin)，轻轻混勻20 30sec，封板后25 37°C温育1 池，TBST再次洗涤6 10次，每孔加入100 300ul抗生物素辣根过氧化物 酶复合物(EXTRAVIDIN-PEROXIDASE)，轻轻混勻20 30sec，封板，25 37°C同样温育1 2h, TBST再次洗板6 10次，每孔加入100 300ul邻苯二胺(OPD)显色液，轻轻混勻5 1086(；，25 371暗处显色0.2 111，显色后每孔加入100 30(^1 1 2M H2SO4终止液， 轻轻混勻20 30sec ；20 30min内测OD值；(6)DNA测序挑取ELISA阳性单克隆噬菌体以_96引物进行测序，解读7肽氨基 酸排列序列。所述步骤(1)中的酶标板为96孔酶标板。所述步骤O)中洗脱下来的噬菌液5 10μ 1用作滴度测试，待用的宿主大肠杆 菌ER2738的菌种浓度为OD A600 = 0 . 2 0. 5。所述步骤O)中的噬菌体扩增计算的有效值为每个平板含有噬菌斑1 100个。所述步骤( 中的滴度测试中，噬菌液体积为5 10 μ 1，大肠杆菌ER2738的体积 为 100 ~ 200 μ Io所述步骤(4)中离心后取上清液后，再次短暂离心10 30sec，取60 80%上清 液，即为单克隆噬菌体扩增液。所述步骤(5)中的ELISA测试用酶联免疫检测仪在OD 492nm处测定。有益效果(1)本发明的制备方法简单，成本低廉，大肠杆菌与噬菌体的生物资源丰富；(2)所筛选出来的对菠萝蛋白酶有亲和作用的7肽配基对菠萝蛋白酶有较高的亲 和作用，并且能够发现其一致序列，对于蛋白质组学中的蛋白质互相作用提供丰富的实验 数据；(3)对菠萝蛋白酶高亲和力的7肽配基更可用于对菠萝蛋白的分离纯化研究。
图1是大肠杆菌的生长曲线与菌体含量图；图2是靶分子(菠萝蛋白酶)浓度的选择优化；图3是去污剂浓度的选择优化；图4是噬菌体第四轮淘洗的噬菌斑；图5四轮淘洗中噬菌体回收量及回收率；图6是18个噬菌体单克隆阳性克隆的ELISA检测。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。实施例1噬菌体宿主菌ER2738的培养与生长曲线测定，具体步骤如下图1所示在接种至液体培养基2.证后，大肠杆菌度过了迟缓期，进入对数期，在 大约培养3-3. 5h，OD A600达到0. 5，从图示中我们发现大肠杆菌ER2738菌群开始进入对数 前期，OD值上升速度极快，这个培养时间3. 5h和大多数研究者经验所得所需要花费的时间 是一致的。说明一般挑取单菌落液体培养或者稀释后一般3. 5h进行噬菌体感染是最适合 的。实施例2M13丝状噬菌体的扩增，具体步骤如下(1)挑取ER2738菌株培养于LB-Tet培养液中，37°C 200rpm振荡培养过夜，次日 1 100稀释的培养液使用LB培养液(不加抗生素Tet)摇床至OD A600 = 0 . 5待用。(2)噬菌体洗脱液定量加入至LB菌液中，37°C，85rpm感染lh。4°C，5000rpm离心 15min。去上清，菌体重悬至200ml LB培养液(注此处LB培养液不加抗生素，增加噬菌体 感染力和活力)中培养12h。(3)次日取菌液4°C，5000rpm离心15min，取上清，转入新鲜离心管后加入1/5 (V/ V)PEG/NaCl，震荡混勻后冰置lh。4°C，12000rpm离心20min去上清，沉淀物重悬于Iml TBS 溶液，转入微量离心管，再加l/5(V/V)PEG/NaCl溶液进行再沉淀，冰置Ih后，4°C，12000rpm 离心20min，弃上清，再快速离心移去残余上清液。沉淀重悬于200 μ 1 TBS，0. 02% NaN3中。实验结果如表1显示第一种扩增方法是由于NEB公司设计的扩增方法时间段，只 有4.紐，但是它大大降低了序列偏嗜现象。第二种方法是本发明自行设计，在保证大肠杆菌 ER2738在1 内完成生长曲线的期限内，立刻停止扩增，这样也能降低序列偏嗜现象，但同时 保证噬菌体增殖完成一定的数量级。由于感染时间长于方法1，因此得到了更好的扩增效果。实施例3对生物淘洗方法条件优化，具体步骤如下(1)靶分子浓度选择优化设计同时进行四个平行淘洗过程，以BSA作为靶分子溶液，温育酶标板的浓度分别为100μ g/ml,80y g/ml,50y g/ml,20y g/ml/0随机挑取每个淘洗筛选出来的噬菌体10 个，对其进行ELISA检测，如图2所示整体上可以发现浓度最低的20 μ g/ml的靶分子浓度 所筛选的OD值普遍偏高，预示着低浓度靶分子溶液包被的酶标板所筛选出来的配基亲和 性相对来说更高。因此设计在淘洗菠萝蛋白酶的四轮淘洗过程中，逐级降低菠萝蛋白酶溶液的浓 度，从 100 μ g/ml，80 μ g/ml，50 μ g/ml，20 μ g/ml 依次进行筛选。(2)去污剂浓度选择优化在淘洗过程中去污剂洗涤清洗酶标孔(本实验为TBS-Tween-20)，只有逐渐增强 去污剂的浓度，又不超出其限度，才能筛选出理想的配基来。结果如图3所示去污剂浓 度达到1. 0 %时候，洗脱力太强，导致筛选结果不理想，浓度0. 05 %的洗脱力不够，导致不 能屏蔽非特异性吸附带来的假阳性结果。因此本实验选择不同浓度的去污剂浓度0. 5%, 0.2%,0. 分别对应第三/四，第二和第一轮。(3)洗脱方法选择优化—般洗脱法分为非特异性洗脱法和特异性竞争性洗脱法两种。本实验采用非特异 性洗脱法0.2M Glycine-HCl (pH 2. 2), lmg/ml BSA作为洗脱剂，以及特异性洗脱剂100 μ g/ ml游离菠萝蛋白酶分子TBS洗脱剂，对每次生物淘洗后的酶标孔进行洗脱，结果如表2所 示洗脱的效果几乎持平，但是考虑到酸性洗脱法的低PH值会使噬菌体的感染系数降低， 通常洗脱时间不能超过lOmin，否则噬菌体将失去感染能力。另外，短时间的洗脱，只能筛选 到亲和力底下，解离常数小k的短肽配基。因此，综合考虑下，本文选取特异性洗脱剂对以 下实验进行洗脱。实施例4生物淘洗对菠萝蛋白酶的亲和7肽配基，具体步骤如下(1)噬菌体7肽库筛选96孔酶标板包被300 μ 1将100 μ g/ml的菠萝蛋白酶精酶 (XlMNaHCO3溶液(pH 8. 6)，旋转酶标板湿润整个板孔。将酶标板置于增湿容器中4°C轻微 震荡，孵育过夜。挑ER2738单克隆菌种于20ml LB-Tet液体培养液Q50ml锥形瓶，以增加 氧气量)中，37°C，200rpm震荡培养。(2)次日冲洗包被液，加满封阻液，4°C静置lh。完成后去封阻液，用TBST(0. 1% [ν/ν]第一轮，0. 2% [ν/ν]第二轮，0. 5% [ν/ν]第三四轮)缓冲液迅速洗板6次。100 μ 1 TBST缓冲液稀释IO12数量级数的噬菌体量，以10倍稀释度一直稀释到酶标板每排的11个 孔(每排第一个孔为空白液)，室温温和摇动lh。倾倒除去未结合噬菌体后，TBST缓冲液 迅速洗板10次。(3)洗脱为特异性洗脱，即100 μ g/ml游离菠萝蛋白酶分子TBS洗脱液竞争性洗脱 吸附在固相酶标板上的噬菌体。室温温和摇动lh。洗脱下来的噬菌体可作滴度测试。结果如图4和图5显示图4是四轮筛选第四轮中对菠萝蛋白酶有亲和作用的 噬菌体单克隆扩增后的滴度测试，从图中可以发现，由于文库噬菌体源于常规克隆载体 M13mpl9，其含有IacZa基因，当铺在含IPTG和Χ-gal的平板上时，噬菌斑将呈现蓝色，说 明实验结果良好。图5则是四轮淘洗过程中噬菌体回收量和回收率的图谱。实验结果显示此法筛 选克服了传统筛选流程富集程度不高的缺点第二轮的噬菌体回收率比第一轮高出13. 77倍，而第三轮的回收率比之第一轮高出可以发现153. 06倍，第四轮的回收率有所降低，说 明了富集已经到了临界点。因此本实验共选择4轮淘洗过程，选择阳性单克隆进行ELISA 测试。实施例5随机挑选第四轮淘洗中的噬菌体单克隆18个进行ELISA，具体步骤如下(1)首先将目标蛋白菠萝蛋白酶包被在酶标板的微孔固相上；(2)混合第四轮中随机挑取的18个单克隆噬菌体，使单克隆噬菌体展示的7肽与 目标蛋白进行亲和作用；(3)第三步加入Anti-fd-Biotin (SIGMA)，此类抗体能够对fd和M13噬菌体有抗 原反应，并且链接生物素；(4)第四步加入EXTRAVIDIN-PEROXIDASE(SIGMA)，此二抗的抗生物素蛋白能够特 异性的与生物素结合，酶标抗体上的酶是辣根过氧化物酶(HRP)；(5)最后加入HRP底物OPD溶液。在492nm波长处测定底物含量的变化。结果如图6所示以上的18个单克隆噬菌体中其中姊，5#，6#在49211111处有强烈 吸收峰。其中6#的OD值达到了 1. 9，证明底物OPD被大量HRP所催化，也就意味着这三个 单克隆所展示的7肽对菠萝蛋白酶的亲和作用较高。可以对2#’ 5#，6#，10#，14#，18#6个阳 性克隆进行DNA/氨基酸测序。实施例66个阳性克隆的DNA测序挑取ELISA6个阳性单克隆噬菌体以_96引物进行测序，解读7肽氨基酸排列序 列。结果如表3所示6个阳性克隆的氨基酸序列有共同的一致序列Ile-XXX-Ser-Pr0-XX X-XXX-XXX(LXSPXXX)。表1不同扩增方法的选择优化
扩增方法噬菌体投入量(cfu)噬菌体洗脱量(Cfu)扩增倍数
1IO36.7χ108-IO52IO35.3χ10η-IO9
表2洗脱方法的选择优化洗脱方法噬菌体投入量(Cfu)噬菌体洗脱量(cfu)
1IO33552IO3478表3菠萝蛋白酶高亲和性的7肽氨基酸序列展示
8
权利要求
1.一种亲和筛选菠萝蛋白酶的亲和配基的方法，包括(1)酶标板包被100 300μ1菠萝蛋白酶溶液，4°C轻微震荡，孵育1214h，之后冲洗 包被液，加满封阻液，0 4°C静置1 2h，完成后去除封阻液，用TBST缓冲液迅速洗酶标 板2 10次；噬菌体7肽库以5 10倍稀释度加入上述酶标板的酶标孔中，摇动1 2h， TBST缓冲液迅速洗酶标板2 10次，用50 100 μ g/ml游离菠萝蛋白酶分子TBS洗脱液 竞争性洗脱吸附在固相酶标板上的噬菌体，室温摇动1 2h，洗脱下来的噬菌体作滴度测 试；(2)挑取ER2738菌株培养于LB-Tet培养液中，25 37°C180 200rpm振荡培养 12-24h，之后用不加抗生素Tet的LB培养液1 50 1 100稀释并再次培养待用，步骤 (1)噬菌体洗脱液定量加入至上述大肠杆菌菌液中，25 37°C，60 IOOrpm感染1 2h， 0 4°C，离心10 20min，去上清，菌体重悬至100 200ml LB培养液中培养8 14h，取 培养后的菌液0 4°C，离心10 20min，取上清，加入体积比为1 3 1 6的聚乙二 醇和氯化钠，震荡混勻后冰置1 2h，在0 4°C，8000 15000rpm离心10 20min去上 清，沉淀物重悬于1 anl TBS溶液，再加体积比为1 3 1 6的聚乙二醇和氯化钠溶 液进行再沉淀，冰置1 2h后，0 4°C，8000 12000rpm离心10 20min，弃上清，再快 速离心移去残余上清液，沉淀重悬于100 200 μ 1 TBS,0. 01 0. 02% NaN3中，得扩增后 的噬菌液；(3)将上述扩增后的噬菌液分别用TBS缓冲液稀释10 IO3倍，噬菌液加入到大肠杆菌 菌液，快速震荡混勻，室温温育2 5min，然后将感染的菌液注入40 50°C的顶层琼脂试 管中，快速震荡混勻并立即倾注于25 37°C预温的LB/IPTG/Xgal平板上，均勻铺开，25 37°C倒置培养12-24h，之后计数平板；(4)挑取上述LB-IPTG/Xgal平板上蓝色噬菌斑10 20个分别装入上述1 2ml ER2738菌液中，25 37°C 180 220rpm震荡培养4 5h，离心后取上清液即得单克隆扩 增液；(5)100 300 μ 1 pH 8. 6菠萝蛋白酶0 4°C包被12_Mh，吸出包被液，加满封阻液， 25 37°C静置1 2h，完成后吸出封闭液，用TBST快速洗板2 10次，每孔加入100 300 μ 1TBST,每排第二孔加入10-20 μ 1的单克隆扩增液，并稀释至12孔，25 37°C缓慢 震荡1 浊，甩出单克隆扩增液，TBST洗涤6 10次后，每孔加入100 300ul抗fd噬菌 体生物素复合物，轻轻混勻20 30sec，封板后25 37°C温育1 2h，TBST再次洗涤6 10次，每孔加入100 300ul抗生物素辣根过氧化物酶复合物，轻轻混勻20 30sec，封板， 25 37°C同样温育1 2h，TBST再次洗板6 10次，每孔加入100 300ul邻苯二胺显 色液，轻轻混勻5 10sec，25 37°C暗处显色0. 2 lh，显色后每孔加入100 300 μ 1 1 2MH2S04终止液，轻轻混勻20 30sec ；20 30min内测OD值；(6)挑取步骤(5)中的ELISA阳性单克隆噬菌体以-96引物进行测序，解读7肽氨基酸 排列序列。
2.根据权利要求1所述的一种亲和筛选菠萝蛋白酶的亲和配基的方法，其特征在于 所述步骤(1)中的酶标板为96孔酶标板。
3.根据权利要求1所述的一种亲和筛选菠萝蛋白酶的亲和配基的方法，其特征在于 所述步骤O)中洗脱下来的噬菌液5 10 μ 1用作滴度测试，待用的宿主大肠杆菌ER2738的菌种浓度为OD A600 = 0 . 2 0. 5。
4.根据权利要求1所述的一种亲和筛选菠萝蛋白酶的亲和配基的方法，其特征在于 所述步骤(2)中的噬菌体扩增计算的有效值为每个平板含有噬菌斑1 100个。
5.根据权利要求1所述的一种亲和筛选菠萝蛋白酶的亲和配基的方法，其特征在于 所述步骤(3)中的滴度测试中，噬菌液体积为5 10 μ 1，大肠杆菌ER2738的体积为100 200 μ 1。
6.根据权利要求1所述的一种亲和筛选菠萝蛋白酶的亲和配基的方法，其特征在于 所述步骤(4)中离心后取上清液，再次短暂离心10 30sec，取60 80%上清液，即为单 克隆噬菌体扩增液。
7.根据权利要求1所述的一种亲和筛选菠萝蛋白酶的亲和配基的方法，其特征在于 所述步骤(5)中的ELISA测试用酶联免疫检测仪在OD 492nm处测定。
全文摘要
本发明涉及一种亲和筛选菠萝蛋白酶的亲和配基的方法，包括(1)生物淘洗；(2)噬菌体定向扩增与富集(3)滴度测试；(4)单克隆噬菌体扩增；(5)ELISA测试；(6)DNA测序，Ile-XXX-Ser-Pro-XXX-XXX-XXX(LXSPXXX)。本发明的制备方法简单，成本低廉，大肠杆菌与噬菌体的生物资源丰富；选出来的对菠萝蛋白酶有亲和作用的7肽配基对菠萝蛋白酶有较高的亲和作用，并且能够发现其一致序列，对于蛋白质组学中的蛋白质互相作用提供丰富的实验数据；菠萝蛋白酶高亲和力的7肽配基更可用于对菠萝蛋白的分离纯化研究。
文档编号C12Q1/37GK102121043SQ20101059161
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月16日 优先权日2010年12月16日
发明者朱利民, 汪雯, 聂华丽, 陈天翔 申请人:东华大学