专利名称：用基因靶标筛选具有降低血脂中胆固醇组分的方法
技术领域：
本发明涉及一种用基因靶标筛选具有降低血脂中胆固醇的关键组分的方法。
背景技术：
流行病学研究表明高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)具有抗动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)作用，血浆中高密度脂蛋白胆固醇浓度的降低是冠心病的危险因素之一。高密度脂蛋白(HDL)是一种重要的胆固醇载体，它可以刺激血管内皮下巨噬细胞的内胆固醇酯的水解，并将水解的非酯化胆固醇从巨噬细胞中转运回肝脏分解，此过程称为胆固醇逆转运。其结果是1、抑制了胆固醇酯在巨噬细胞内的积累，阻止其转化为泡沫细胞，从而防止了动脉粥样硬化；2、因为HDL具有独特的转运动脉粥样硬化斑块泡沫细胞里胆固醇脂到肝脏去分解的作用，从而使动脉粥样硬化血管壁逐步恢复正常。
近年的研究表明HDL抗AS作用主要基于HDL参与胆固醇逆转运(reverse cholesterol transport RCT)过程，在这一过程中，B族I型清道夫受体(scavenger receptors class B type I，SR-BI)起着关键性作用，因而它已成为公认的、有潜力的心血管药物靶点之一]。虽然，目前大部分研究都集中如何提高HDL在血液中的浓度，并把它作为一种药物筛选的新靶点。但进一步考虑如果在B族I型清道夫受体(SR-BI)中存在缺陷或HDL与SR-BI间的相互作用十分微弱，那么，HDL的重要生理功能仍然是不能发挥的。
酵母双杂交方法是近年发展起来的在细胞内研究蛋白质相互作用的方法，我们选用基因公司的MATCHMAKER双杂交系统3为实验体系，MATCHMAKER双杂交系统3是一个先进的以GAL4为基础的双杂交系统，它在酵母体内为检测蛋白质的相互作用提供了显示发生转录分析的报告基因系统。我们可以利用这一系统去观察一个新奇的蛋白与一个已知诱饵蛋白间的相互作用的实验或去测试两个事先克隆好的蛋白间的相互作用。MATCHMAKER双杂交系统做了改进，减少了假阳性结果的出现，从而能快速地确定和证实蛋白间的相互作用。我们选用了这个试剂盒。选用了载脂蛋白HDL中占65％的apoAI，及清道夫受体(SR-BI)的全长cDNA构建成相应的酵母表达载体，用以验证载脂蛋白AI(apoAI)及清道夫受体(SR-BI)间存在的相互作用，以报告基因所表达的α、β-半乳糖苷酶定量检测了载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(SR-BI)间存在相互作用的强弱，并运用已知降脂药及在动物实验中证明有效的药物为阳性对照，检验了该系统，证明该系统有效，可用于在基因水平上筛选和评价具有降低血脂中胆固醇的关键组分。
本发明的目的在于，涉及到一种用基因靶标筛选具有降低血脂中胆固醇组分的方法，首先从大鼠肝脏总RNA用RT-PCR方法获得了wistar大鼠的载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(SR-BI)基因的全长cDNA，并将其克隆入酵母表达载体，利用报告基因、省却培养基、酵母交配证实了在载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(SR-BI)间存在相互作用，以报告基因所表达的α、β-半乳糖苷酶定量检测了载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(SR-BI)间存在相互作用强弱，并运用已知降脂药及在动物实验中证明有效的药物为阳性对照，检验了该系统，证明该系统有效，可用于在基因靶标筛选和评价具有调脂效果的关键组分。
本发明所述的用基因靶标筛选具有降低血脂中胆固醇组分的方法，按下例步骤进行a、采用常规获得目的基因的方法，获得载脂蛋白ApoAI和清道夫受体SR-BI基因，并且将其作为药物筛选靶标；b、采用常规方法将载脂蛋白ApoAI和清道夫受体SR-BI基因构建了酵母载体，利用酵母双杂交系统，并用报告基因和酵母交配证实了相互作用的存在；c、选择酵母双杂交系，用正常的菌株或交配的二倍体菌株检验具有降低血脂中胆固醇的组分的毒性，只有对酵母菌株生长影响不大时才能用于检测；d、以报告基因所表达的α、β-半乳糖苷酶定量检测了载脂蛋白ApoAI和清道夫受体SR-BI间存在相互作用强弱，定量地比较各组分在降低血脂中胆固醇能力的差别；e、本方法不仅用于筛选化合物单体，同时也用于复方的筛选。
本发明所述的用基因靶标筛选具有降低血脂中胆固醇组分的方法，其中各步骤具体操作为步骤a中获得目的基因的方法一、大鼠ApoA-I基因及SR-BI基因的获得(一)、取大鼠肝脏利用RNA提取试剂盒(promegag公司SV totalRNA isolation Kit)提取肝脏总RNA，并通过反转录试剂盒将其反转为cDNA。(promegag公司Universal Riboclone CDNA SysthesisSgstem)具体方法如下(1)、称取肝组织(滤纸上拭干血液，剪小块于烧杯中)；(2)、使肝组织与裂解液比率在171mg/ml；(3)、先取3/5体积裂解液于小烧杯中剪碎肝组织，倒入匀浆器，用余下2/5体积裂解液冲洗烧杯并倒入匀浆器；(4)、匀浆器下端插入冰浴中约2min左右；(5)、取175ul裂解物于1.5ml AP管(余下-20℃保存)加350ulSV RNA Dilution Buffer，颠倒3-4次混匀70℃水浴3min；(6)、12000g(相当于台式离心机13000转)室温下离心10min；
(7)、将上清移入新管，加200ul95％乙醇抽吸(或颠倒)3-4次混匀，转入超滤器12000g离心10min；(8)、将spin basket从超滤器上拿下，倒下清夜，将spin basket放回，加入600ul SV RNA Wash solution 12000g离心1min；(9)、倒清夜，(准备孵育液于小管中，按顺序加入40ul黄色core buffer，5ul 0.09M MnCl2和5ul DnaseI enzyme，抽吸混匀置于冰浴中)将50ul孵育液加入spin basket的膜上；(10)、室温孵育15min，加入200ul SV Dnase stop液，12000g离心1min；(11)、加入600ul SV RNA Wash Solution 12000g离心1min；(12)、倒下清夜加入250ul SV RNA Wash Solution 12000g离心2min；(13)、将spin basket从收集管转入洗脱管(新AP管剪去盖子)加100ul无DNA水，完全过膜，12000g离心1min，所得液转入新AP管-70℃保存。
(二)、反转录为cDNA(第一链)(1)、取mRNA 8ul(2ug)、Oligo(dT)引物2ul(0.5mg/ml)加入无DNA酶水至15ul；(2)、0℃水浴5-10min，将管置于冰浴上5min短暂旋转以收集底部的溶液；(3)、加入样品15ul、第一链5×buffer 5ul和RnasinRibonulease Inhibition 1ul(40U)，于42℃水浴3-5min；(4)、再加入Na Pyrophosphate 2.5ul(40mM)和AMV ReverseTranscriptase 1.2ul(30U)，加无DNA酶水0.3ul至总体积25ul；(5)、轻弹管子混匀，将反应体系于42℃水浴1小时，于-20℃保存。
(三)、从GenebanK中调取大鼠ApoA-I基因及SR-BI基因序列，设计并合成含酶切位点的引物，引物如下apoAIP1上游引物5’-ATCCCGGGATGAAAGCTGCAGTGTTGG-3’P2下游引物5’-ATGTCGACGGCGCCTCACTAAGCGTTC-3’SR-BIP3上游引物5’-ATATCGATATGGGCGTCAGCTCCAGGGC-3’P4下游引物5’-ACGAGCTCCTACAGCTTGGCTTCTTGCAG-3’以大鼠cDNA为模板，PCR扩增大鼠ApoA-I基因及SR-BI基因，扩增条件94℃变性2min。94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 90s，30个循环后，72℃延伸7min。产物4℃保存。取RT-PCR扩增产物10μl，在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳。可见到与预期一致的800bp、1.5kb的DNA片段。(图1)(四)、将质粒DNA导入大肠杆菌DH5α、JM109中，筛选单克隆，利用抗菌素标记挑选出含有重组质粒的细菌菌落，小量提取质粒DNA，通过限制性内切酶酶切分析及PCR扩增分析质粒DNA，转化方法如下制备感受态细胞(1)、取2-3个在平板上保存的大肠杆菌单菌落于50ml的液体培养基中，37℃、250rpm摇床过夜培养，达到饱和，新鲜培养至饱和期的细菌的浓度约为1×109_2×109细胞/ml；(2)、一个500ml的三角烧瓶中加入100mlLB培养液，再加入1ml过夜培养基，在37℃摇床培养(135rpm)约3个小时，至OD590为0.375；(3)、培养液分装到2个50ml预冷无菌的聚丙烯管中，在冰上放置5-10min，然后4℃、4000rpm离心7min；(4)、用10ml冰冷的CaCl2液体重悬细胞沉淀，于冰上放置30min，然后4℃、4000rpm离心5min；(5)、用2ml冰冷的CaCl2溶液重悬各管细胞，按250uL/管的量分装重悬细胞，然后加入灭菌甘油溶液，终浓度为10％，立即冻存于-70℃或直接做转化实验。
质粒转化感受态大肠杆菌(1)、根据质粒所带的抗生素标记制备含有amp标记的LB培养基，根据质粒所带的抗生素标记制作带有amp标记的LB平板。由于amp很易失效，因此平板应在24小时内使用；(2)、将10ng左右的质粒用冷却的无菌吸头转移到15ml的无菌的圆底试管中并放置在冰上，然后将盛有感受态的管子握在手上使菌液迅速融化，将100ul感受态菌加到管中，轻轻摇动，并在冰上放置30min(为确保质粒与菌株的充分接触和均匀，提前将质粒由贮藏浓度稀释到所需浓度)；(3)、将管子加入到42℃水浴进行2min热休克，然后加入890ul LB液体培养基于每一支试管中，37℃、250rpm培养1.5小时；(4)、将原菌液稀释100倍，然后分别取50ul加到相应的抗生素平板上，无菌涂布棒涂布；(5)、37℃倒置培养24小时后观察结果。
酶切鉴定质粒的提取与纯化1)、碱裂解法大量制备质粒(1)、从LB平板上挑取2-3个单菌落，接到5ml LB液体培养基中，250rpm过夜培养12-16h；(2)、在2L的烧瓶中加入500ml带有amp抗生素的LB培养基，然后加入5ml培养基于37℃培养20-24h至饱和状态；(3)、4℃、4000rpm离心15min，弃上清直至上清完全流尽；(4)、将细菌沉淀重悬于100ml冰预冷的STE溶液中，重新收集细胞；(5)、将洗过的细胞重悬于10ml的碱裂解液I中；(6)、加入1ml新配制的含10mg/ml溶菌酶溶液，重悬沉淀，于室温放置10；(7)、加入20ml新配制的碱裂解液II，盖紧瓶盖，缓慢颠倒离心管数次，以充分混匀内容物，于室温放置10；(8)、加15ml用冰预冷的碱裂解液III，封住瓶口摇动离心管数次以混匀内容物，此时不再出现两个液相；置于冰上10min，形成白色絮状沉淀；(9)、4℃、4000rpm离心15min，用4层干净纱布过滤上清于另外两个灭菌的离心管中，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10min；(10)、于室温以5000rpm离心15min，沉淀核酸；(11)、小心弃上清，于室温用70％乙醇洗涤沉淀和管壁。倒出乙醇，沉淀真空干燥，残余乙醇挥发殆尽；(12)、用3ml TE(PH8.0)溶解核酸沉淀。
2)、聚己二醇法纯化质粒DNA(1)、将TE溶液中溶解的核酸转入15ml离心管中，加入3ml冰预冷的LiCl溶液，充分混匀，4℃，10000rpm离心10min以沉淀高分子量的RNA；(2)、将上清转移到另一个30ml的离心管内，加等量的异丙醇，充分混匀，在室温以10000rpm离心10min，回收沉淀的核酸；(3)、70％的乙醇洗涤一次，真空干燥；(4)、加含500ul无DNase的RNase(1ul，10ug/ul)的TE(PH8.0)溶解沉淀，将溶液转到一离心管中，在室温放置30；(5)、加500ul含13％(W/V)的聚己二醇(PEG8000)的1.6mol/L的NaCl溶液充分混匀，用微量离心机4℃、12000rpm离心5min以回收质粒DNA；(6)、吸出上清，用400ul TE溶解质粒DNA沉淀，用酚，酚/氯仿，酚/氯仿/异戊醇各抽提至少一次直至两相界面间无白色物质；
(7)、将水相转到另一个微量离心管中，加100ul 10mol/L的乙酸铵，充分混匀；加2倍体积的无水乙醇，在冰上冷却10min，4℃，10000rpm离心10min以沉淀质粒DNA；(8)、吸取上清，加200uL的4℃的70％的乙醇，稍加振荡，微量离心机4℃以12000离心2min，真空干燥；(9)、用500uL的TE(PH8.0)，以1∶100的TE稀释后测定质粒的浓度和纯度。质粒DNA贮存于-20℃；(10)、适当浓度的琼脂糖凝胶电泳检查提取的质粒DNA；(11)、紫外分光光度计测定特定波长的OD值并计算质粒DNA纯度。
(五)、重组质粒pMD18-A、pMD18-S的酶切及序列分析将纯化的PCR产物定向克隆到pMD18-T质粒中，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白筛选。酶切鉴定含有插入片段的阳性克隆，命名为pMD18-A、pMD18-S，再利用SmaI、SalI及ClaI、SacI分别对质粒pMD18-A、pMD18-S进行酶切鉴定。(图2)鉴定正确后，对pMD18-A、pMD18-S进行测序分析，其结果与Genebank中提供的wistar大鼠的apoAI、SR-BI序列相比较。序列分析表明扩增得到的apoAI蛋白基因与给出基因完全一致，、SR-BI蛋白基因中出现1个同义突变，氨基酸性质未改变。
步骤b中构建酵母载体的方法构建酵母双杂交重组质粒DNA-BD和AD融合载体pGBKT7和pGADT7是为高水平蛋白表达而设计的，且易于确认蛋白质的相互作用。我们以它们为载体将目的基因置入，先将PMD18-A用SmaI、SalI双酶切，酶介回收ApoAI基因片段，再将PMD18-S用ClaI、SacI双酶酶切，回收SR-BI片段。再分别把酵母载体pGBKT7用SmaI、SalI酶切后与ApoAI片段连接，形成重组质粒pGBKT7-ApoAI。把酵母载体pGBKT7用ClaI、SacI酶介后与SR-BI片段连接形成重组质粒pGBKT7-SR-BI。连接后将他们分别转化入大肠杆菌DH5α中，经限制性内切酶分析含有正确插入片段的克隆命名为pGBADT7-SR-BI、pGBKBT7-apoAI。酶切鉴定结果如下(图3)a)、制备酵母感受态细胞I)、随即挑选几个酵母菌株AH109接种于50ml YPDA培养基中，在30℃振荡培养(250rpm)16-18h以达到OD600＞1.5；ii)、转移在300ml新鲜的YPDA中使OD600＝0.2-0.3，30℃摇动(250rpm)使OD600达到0.4-0.6(约3h)将细胞放在50ml的试管中，室温下5000rpm 5min离心弃上清，用25-50ml的无菌水或TE涡流震荡使细胞再悬浮；iii)、全部细胞在室温5000rpm离心5分钟，弃上清。在1.5ml的新准备的无菌的1X TE/LiAc中再悬浮细胞团，得到酵母感受态。
b)、双质粒共转化酵母菌株i)、在1.5ml为两离心管中加入100ul感受态、构建好pGBADT7-SR-BI、pGBKBT7-apoAI的共0.6μg、鲱鱼精子DNA 0.1mg混匀，加入0.6ml的无菌PEG/LiAc溶液并用最高速度混合，在30℃摇动(200rpm)30min；ii)、加入70μl的DMSO，温和颠倒混匀。42℃水浴加热震动15min，将细胞放在冰上1-2min；iii)、在室温下离心细胞14000rpm离心5s，其上清，以0.5ml 1XTE重悬细胞，最后将菌液涂布在相应的SD(营养缺陷培养基)平板上，30℃保温3-5天，观察转化菌的生长状况。
LEU、TRP、HIS、ADE、MEL1报告基因表达的检测含pGBADT7-SR-BI、pGBKBT7-apoAI质粒菌斑挑到在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal的平板上，30℃保温3-5天，可观察到菌斑可以生长且菌斑呈现蓝色。
Leu、Trp、His、Ade、LacZ将含pGBADT7-SR-BI、pGBKBT7-apoAI质粒菌斑挑到在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-Gal的平板上，30℃保温3-5天，可观察到菌斑可以生长且菌斑呈现蓝色。
利用酵母交配证实apoAI、SR-BI两种蛋白间存在相互作用在分析和验证阳性克隆时，本发明采取了酵母交配的方法，将pGBKBT7、pGBKBT7-appAI、pGBKBT7-Lam分别转化到Y187中在SD/-Trp平板上筛选阳性克隆，pGBADT7、pGBADT7-SR-BI、pGBADT7-P53转化到AH109菌株中，在SD/-Leu平板上筛选阳性克隆。挑选用于交配的单个的、直径2-3mm的新鲜克隆于1.5ml微量离心管中加0.5ml YPD培养基在30℃振摇20-24小时(＞200转/分)。取100μl过夜的菌液涂布在SD/-Leu/-Trp平板上，30℃保温3-5天，待长出克隆后，用无菌牙签接种在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal平板上，30℃保温3-5天，观察转化菌的生长状况及颜色变化。经交配后的菌液涂布在SD/-Leu/-Trp的平板上，所有平板上均有菌斑生长，再将其转接到SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal仅有含pGBKBT7-appAI、pGBADT7-SR-BI及pGBKBT7-Lam、pGBADT7-P53质粒的菌株可以生长且菌斑呈现蓝色。以ONPG为底物的液体分析法可测的β-半乳糖苷酶的活力。
步骤c中毒性检测方法首先用正常的菌株或交配的二倍体菌株检验具有降低血脂中胆固醇能力的组分的毒性，只有对酵母菌株生长影响不大时才能用于检测。具体方法如下接种在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade培养基中分别加入等体积的使用Tr MATCHMAKERGAL4 TWO-Hybrid Sysslem3中提供的共转化了P53和SV大T抗原基因的AH109菌株或交配的二倍体菌株、层粘连蛋白Lam和SV大T抗原基因的AH109菌株或交配的二倍体菌株共转化了载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(SR-BI)的AH109菌株或交配的二倍体菌株；向培养基中分别加入待测药品，在相同条件下进行培养；测定OD600，判断药品的毒性。此时，用共转化了P53和SV大T抗原基因的AH109菌株或交配的二倍体菌株作为阳性对照，以层粘连蛋白Lam和SV大T抗原基因的AH109菌株或交配的二倍体菌株作为阴性对照，以不加药物组分的共转化菌株或交配的二倍提体菌株为空白对照。只有对酵母菌株生长影响不大时才能用此系统进行检测。
步骤d中酶活检测方法检测α-半乳糖苷酶的活力以PNP为底物的液体分析法检测α-半乳糖苷酶的活力可测得含pGBADT7-SR-BI、pGBKBT7-apoAI质粒的酵母菌表达的α-半乳糖苷酶的活力在8IU.左右。具体方法如下1)、在SD/-Leu/-Trp/-His液体培养基中加入含pGBADT7-SR-BI、pGBKBT7-apoAI质粒菌斑；2)、在30℃摇动(250rpm)16-18h，此时，OD600＝0.5-1.0；3)、将菌液离心后，取上清8μl，加入分析缓冲液(1XNaOAC∶100mMPNP＝2∶1)24μl，30℃孵育60min后加入终止液1XNaCO3960μl；4)、在410nm比色，计算α-半乳糖苷酶的活力；β-半乳糖苷酶的活力以ONPG为底物的液体分析法检测β-半乳糖苷酶的活力可测得含pGBADT7-SR-BI、pGBKBT7-apoAI质粒的酵母菌表达的β-半乳糖苷酶的活力在10-40IU左右。具体方法如下1)、在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade液体培养基中加入含pGBADT7-SR-BI、pGBKBT7-apoAI质粒菌斑，在30℃摇动(250rpm)16-18h；2)、取出菌液2ml于8ml YPDA混合后30℃摇动(250rpm)3-5小时此时，OD600＝0.5-0.8；
3)、将菌液离心后，用Z-buffer清洗一次，再离心，弃上清；4)、在用0.3mlZ-buffer重悬细胞。向1.5ml微量离心管中加入0.1ml/份菌液；5)、在液氮中裂解2次以上；6)、加入0.7mlZ-buffer巯基乙醇、0.16ml ONPG(4mg/ml)混匀后30℃保温记时至溶液变黄；7)、在加入0.4ml 1MNa2CO3混匀后14,000rpm离心10min；8)、用上清比色测定OD420值，计算β-半乳糖苷酶的活力。
检测待栓组分报告基因α、β-半乳糖苷酶的影响，从而判断它们对载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(SR-BI)间存在相互作用的影响，找出能够加强载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(SR-BI)间存在相互作用的组分。
利用建立好的系统，本发明将一些在动物实验中证明的具有降低血脂中胆固醇能力的组分加入系统中，首先，用正常的菌株或交配的二倍体菌株检验具有降低血脂中胆固醇能力的组分的毒性，只有对酵母菌株生长影响不大时才能用于检测，然后我们用共转化了P53和SV大T抗原基因的AH109菌株或交配的二倍体菌株作为阳性对照，以层粘连蛋白Lam和SV大T抗原基因的AH109菌株或交配的二倍体菌株作为阴性对照，以不加药物组分的共转化菌株或交配的二倍提体菌株为空白对照，在相同条件下进行培养，检测它们报告基因α、β-半乳糖苷酶的影响，从而判断它们对载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(SR-BI)间存在相互作用的影响，找出能够加强载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(SR-BI)间存在相互作用的组分。
参见附1为本发明大鼠APOA-I基因序列2为本发明大鼠SR-BI基因序列3为本发明RT-PCR扩增的大鼠载脂蛋白APOA-I及清道夫受体SR-BI的cDNA电泳图，M100bp-1500bp，1、2两条切出用于克隆图4为本发明大鼠Apo-AI及受体SR-BI基因的克隆和鉴定，大鼠Apo-AI及受体SR-BI重组子限制性内切酶间基因的克隆和鉴定电泳图，其中1pMD18-T空质粒； 2、随机挑选的APO-AI重组子；3随机挑选的SR-BI重组子；4pMD18-T空质粒SalI单酶切；5-6APO-AI、SR-BI重组质粒SalI单酶切；M100bp-1500bp；7-9APO-AI重组质粒EcoRI、SalI双酶切；10-12SR-BI重组质粒EcoRI、SalI双酶切。
图5为本发明大鼠APO-AI、SR-BI酵母载体酶切鉴定电泳图，其中1、空BD，2、未经酶切的BD-Apo-AI，3、酶切后的BD-ApoAI，M100bp-1500bp Marker，4、酶切后的AD-SR-BI，5、未经酶切的AD-SR-BI，6、空AD。
图6为本发明PGBKT7质粒示意7为本发明PGADT7质粒示意8为本发明构建酵母重组质粒PGBKT7-APO-AI示意9为本发明构建酵母重组质粒PGADT7-SR-BI示意10为本发明APO-AI、SR-BI功转化酵母菌示意11为本发明酵母交配示意图具体实施方式
实施例1利用本发明所述的方法对已知常用药辛伐他丁筛选具有降血脂中胆固醇效果组分a、采用常规获得目的基因的方法，获得载脂蛋白AIapoAI和清道夫受体SR-BI基因，并且将其作为药物筛选靶标；
b、采用常规方法将载脂蛋白AIapoAI和清道夫受体SR-BI基因构建了酵母载体，并用报告基因和酵母交配证实了相互作用的存在；c、选择酵母双杂交系，用正常的菌株或交配的二倍体菌株检验具有降血脂中胆固醇能力的组分的毒性，只有对酵母菌株生长影响不大时才能用于检测；分别取辛伐他丁溶液0、50μl、100μl、150μl加入含酵母菌AH109菌株的5ml YPDA培养基中，体积差用溶剂补齐，30℃摇动(250rpm)16-18h后取出，在600nm测定OD值以判断辛伐他丁的毒性，可知在此条件下辛伐他丁基本不影响酵母菌的生长；d、以报告基因所表达的α、β-半乳糖苷酶定量检测了载脂蛋白AI apoAI和清道夫受体SR-BI间存在相互作用强弱，定量地比较具有降血脂中胆固醇能力的组分的差别；活化共转化了P53和SV大T抗原基因的AH109菌株，共转化了层粘连蛋白Lam和SV大T抗原基因的AH109菌株及共转化了载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(SR-BI)基因的AH109菌株，辛伐他丁溶液0、50μl、100μl、150μl分别加入共转化了载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(SR-BI)基因的AH109菌株的5ml YPDA培养基中，体积差用溶剂补齐，同时培养含共转化了P53和SV大T抗原基因的AH109菌株共转化了层粘连蛋白Lam和SV大T抗原基因的AH109菌株，30℃摇动(250rpm)16-18h后取出，以ONPG为底物的液体分析法检测β-半乳糖苷酶的活力，具体方法如下将菌液离心后，用Z-buffer清洗一次，再离心，弃上清。在用0.3mlZ-buffer重悬细胞。向1.5ml微量离心管中加入0.1ml/份菌液，在液氮中裂解2次以上，加入0.7mlZ-buffer巯基乙醇、0.16ml ONPG(4mg/ml)混匀后30℃保温记时至溶液变黄，在加入0.4ml 1MNa2CO3混匀后14,000rpm离心10min用上清比色测定OD420值。测得含共转化了P53和SV大T抗原基因的AH109菌株的β-半乳糖苷酶活力基本不变在43IU，共转化了层粘连蛋白Lam和SV大T抗原基因的AH109菌株几乎不表达β-半乳糖苷酶，共转化了载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(SR-BI)基因的AH109菌株β-半乳糖苷酶力26.08、30.34、25.9、33.4，加药后比空白对照分别提高了16.33％、-0.68％、28.06％与文献报道的辛伐他丁可升高HDL15％以上相符。
e、本方法用于筛选化合物单体，同时也用于复方的筛选。
实施例2利用本发明所述的方法对已知常用药“强心口服液”筛选具有降血脂中胆固醇效果组分强心口服液是一个广为应用具有抗动脉粥样硬化效果的维吾尔药复方。
a、采用常规获得目的基因的方法，获得载脂蛋白AI apoAI和清道夫受体SR-BI基因，并且将其作为药物筛选靶标；b、采用常规方法将载脂蛋白AI apoAI和清道夫受体SR-BI基因构建了酵母载体，并用报告基因和酵母交配证实了相互作用的存在；c、选择酵母双杂交系，用正常的菌株或交配的二倍体菌株检验具有降血脂中胆固醇能力的组分的毒性，只有对酵母菌株生长影响不大时才能用于检测；分别取强心口服液0、150μl、200μl、250μl、300μl加入含酵母菌AH109菌株的5ml YPDA培养基中，体积差用溶剂补齐，同时培养含共转化了P53和SV大T抗原基因的AH109菌株共转化了层粘连蛋白Lam和SV大T抗原基因的AH109菌株30℃摇动(250rpm)16-18h后取出，在600nm测定OD值以判断强心口服液的毒性，可知在此条件下强心口服液基本不影响酵母菌的生长。
d、以报告基因所表达的α、β-半乳糖苷酶定量检测了载脂蛋白AI apoAI和清道夫受体SR-BI间存在相互作用强弱，定量地比较具有降血脂中胆固醇能力的组分的差别；
活化共转化了P53和SV大T抗原基因的AH109菌株，共转化了层粘连蛋白Lam和SV大T抗原基因的AH109菌株及共转化了载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(SR-BI)基因的AH109菌株，将强心口服液0、150μl、200μl、250μl、300μl分别加入共转化了载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(SR-BI)基因的AH109菌株的5ml YPDA培养基中，体积差用溶剂补齐，同时培养含共转化了P53和SV大T抗原基因的AH109菌株共转化了层粘连蛋白Lam和SV大T抗原基因的AH109菌株，0℃摇动(250rpm)16-18h后取出，以ONPG为底物的液体分析法检测β-半乳糖苷酶的活力，具体方法如下将菌液离心后，用Z-buffer清洗一次，再离心，弃上清。在用0.3mlZ-buffer重悬细胞。向1.5ml微量离心管中加入0.1ml/份菌液，在液氮中裂解2次以上，加入0.7mlZ-buffer巯基乙醇、0.16ml ONPG(4mg/ml)混匀后30℃保温记时至溶液变黄，在加入0.4ml 1MNa2CO3混匀后14,000rpm离心10min用上清比色测定OD420值。测得含共转化了P53和SV大T抗原基因的AH109菌株的β-半乳糖苷酶活力基本不变在28IU，共转化了层粘连蛋白Lam和SV大T抗原基因的AH109菌株几乎不表达β-半乳糖苷酶，共转化了载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(SR-BI)基因的AH109菌株β-半乳糖苷酶力为11.5IU、20.35IU、21.23IU、20.8IU、22.6IU加药后比空白对照分别提高了76.96％、84.61％、80.87％、96.54％与文献中报道动物实验结果一致。
e、本方法不仅用于筛选化合物单体，同时也用于复方的筛选。
实施例3利用本发明所述的方法对已知常用药“爱维心口服液”筛选具有降血脂中胆固醇效果组分爱维心口服液是一个广为应用具有抗动脉粥样硬化效果的维吾尔药复方。
a、采用常规获得目的基因的方法，获得载脂蛋白AI apoAI和清道夫受体SR-BI基因，并且将其作为药物筛选靶标；b、采用常规方法将载脂蛋白AI apoAI和清道夫受体SR-BI基因构建了酵母载体，并用报告基因和酵母交配证实了相互作用的存在；c、选择酵母双杂交系，用正常的菌株或交配的二倍体菌株检验具有降血脂中胆固醇能力的组分的毒性，只有对酵母菌株生长影响不大时才能用于检测；分别取爱维心口服液0、10μl、50μl、100μl、150μl加入含酵母菌AH109菌株的5ml YPDA培养基中，体积差用溶剂补齐，30℃摇动(250rpm)16-18h后取出，在600nm测定OD值以判断爱维心的毒性，可知在此条件下爱维心口服液基本不影响酵母菌的生长；d、以报告基因所表达的α、β-半乳糖苷酶定量检测了载脂蛋白AI apoAI和清道夫受体SR-BI间存在相互作用强弱，定量地比较具有降血脂中胆固醇能力的组分的差别；活化共转化了P53和SV大T抗原基因的AH109菌株，共转化了层粘连蛋白Lam和SV大T抗原基因的AH109菌株及共转化了载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(SR-BI)基因的AH109菌株，将爱维心口服液0、10μl、50μl、100μl、150μl共转化了载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(SR-BI)基因的AH109菌株的5ml YPDA培养基中，体积差用溶剂补齐，同时培养含共转化了P53和SV大T抗原基因的AH109菌株共转化了层粘连蛋白Lam和SV大T抗原基因的AH109菌株，30℃摇动(250rpm)16-18h后取出，以ONPG为底物的液体分析法检测β-半乳糖苷酶的活力，具体方法如下将菌液离心后，用Z-buffer清洗一次，再离心，弃上清。在用0.3mlZ-buffer重悬细胞。向1.5ml微量离心管中加入0.1ml/份菌液，在液氮中裂解2次以上，加入0.7mlZ-buffer巯基乙醇、0.16ml ONPG(4mg/ml)混匀后30℃保温记时至溶液变黄，在加入0.4ml 1MNa2CO3混匀后14,000rpm离心10min用上清比色测定OD420值。测得含共转化了P53和SV大T抗原基因的AH109菌株的β-半乳糖苷酶活力基本不变在27.6IU，共转化了层粘连蛋白Lam和SV大T抗原基因的AH109菌株几乎不表达β-半乳糖苷酶，共转化了载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(SR-BI)基因的AH109菌株β-半乳糖苷酶力13.38IU、13.84IU、13IU、20.85IU、15.67IU加药后比空白对照分别提高了3.4％、-2.8％、55.83％、17.12％与文献中报道动物实验结果一致。
e、本方法不仅用于筛选化合物单体，同时也用于复方的筛选。
权利要求
1.一种用基因靶标筛选具有降低血脂中胆固醇组分的方法，其特征在于，按下例步骤进行a、采用常规获得目的基因的方法，获得载脂蛋白ApoAI和清道夫受体SR-BI基因，并且将其作为药物筛选靶标；b、采用常规方法将载脂蛋白ApoAI和清道夫受体SR-BI基因构建酵母载体，利用酵母双杂交系统，并用报告基因和酵母交配证实相互作用的存在；c、选择酵母双杂交系，用正常的菌株或交配的二倍体菌株检验具有降低血脂中胆固醇组分的毒性，只有对酵母菌株生长影响不大时才能用于检测；d、以报告基因所表达的α、β-半乳糖苷酶定量检测了载脂蛋白ApoAI和清道夫受体SR-BI间存在相互作用强弱，定量地比较各种组分在降低血脂中胆固醇能力的差别；e、本方法不仅用于筛选化合物单体，同时也用于复方的筛选。
全文摘要
本发明涉及一种用基因靶标筛选具有降低血脂中胆固醇组分的方法，该方法首先从大鼠肝脏总RNA用RT－PCR方法获得了wistar大鼠的载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(SR－BI)基因的全长cDNA，并将其克隆入酵母表达载体，利用报告基因、省却培养基、酵母交配证实了在载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(SR－BI)间存在相互作用，以报告基因所表达的α、β－半乳糖苷酶定量检测了载脂蛋白AI(apoAI)和清道夫受体(SR－BI)间存在相互作用强弱，并运用在动物实验中证明有效的药物为阳性对照，检验了该方法，证明该方法有效，可用于在基因水平上筛选和评价具有调脂效果的关键组分。该方法成本低廉，高效准确，又可部分揭示了药物降低胆固醇的作用机理。
文档编号C12Q1/68GK1563413SQ20041000872
公开日2005年1月12日 申请日期2004年3月16日 优先权日2004年3月16日
发明者信学雷, 李维琪, 陈志慧, 刘云英, 麦迪娜, 张云峰 申请人:中国科学院新疆理化技术研究所