专利名称：大口黑鲈快速生长基因及亲本筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种基因，特别涉及一种与大口黑鲈快速生长有关的基因。本发明还涉及使用该基因进行快速生长大口黑鲈亲本的筛选方法。
背景技术：
大口黑鲈(Micropterus salmoides L.)，俗名加州鲈，原产于北美洲，具有生长快、耐低温、肉质鲜美和易捕捞等特点，是重要的淡水养殖鱼类之一。1983年从台湾引种到广东省，现在全国大部分地区均有养殖。然而，目前我国养殖的大口黑鲈是由野生种家养驯化而成的，缺少定向选育，在亲本留种时经常选择个体小，性成熟早的个体作为亲本，致使我国大口黑鲈种质的下降，主要表现在生长速度下降、性成熟年龄普遍提前、饵料转化效率低、抗病力也大幅下降，其中，生长速度关系到大口黑鲈产量的高低，养殖效益的大小。大口黑鲈小型化的趋势直接制约着大口黑鲈养殖业的发展。因此，改良大口黑鲈生长速度的工作势在必行。挑选优质亲鱼是提高养殖鱼类生长速度的主要方法之一，其目的是为了改变养殖群体的遗传结构，使后代获得更快的生长速度、更好的抗病能力的遗传特点。在生产中，其传统方法是挑选个体较大、身体健壮的鱼作为留种亲本，即根据表型来决定亲鱼是否留种。 这种方法方便、快捷、简单，但受人为因素影响很大，加上大口黑鲈属于肉食性为主的鱼类， 掠食性强，饵料不足是会互相残食，致使其生长悬殊较大。如此可见，仅从表型判断大口黑鲈亲本质量往往达不到理想的效果。随着分子生物学和遗传学的发展，已涌现出很多种遗传标记，如AFLP、RAPD, SSR、SNP等标记，其中，SNP标记因分布广泛，适宜高通量自动化分析，遗传稳定，日益成为遗传育种研究中首选的遗传标记。若这些遗传标记能与生产性状相关联在一起，即可实现从DNA水平上进行选择育种，克服了传统方法受人为因素影响大的不利因素，提高了选择的准确性，并且可实现在早期鉴定出具有优良性状的个体，筛选出优良的后备亲本，从而缩短育种周期，加快育种进程。但是，现在未发现与大口黑鲈快速生长有关的基因，这大大影响亲本的筛选效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与大口黑鲈快速生长有关的基因。本发明的另一个目的在于提供一种快速生长大口黑鲈亲本的筛选方法。本发明所采取的技术方案是
大口黑鲈垂体特异性转录因子启动子，其序列如SEQ ID NO. 1所示。一种快速生长大口黑鲈亲本的筛选方法，包括以下步骤检测大口黑鲈亲本中的大口黑鲈垂体特异性转录因子启动子的序列，选择序列如SEQ ID NO. 1所示的纯合体作为亲本。包括如下步骤
1)从待测亲本中剪取鳍条样品，提取DNA;2)以提取得到的DNA为模板，
Pl :5，-GCAGAGCCCAAGACAAACAC-3，(SEQ ID NO. 2) P2 :5，-ATGAGGATTGGCAAGGGTGAGTCT-3，(SEQ ID NO. 3) 为引物，进行初次PCR扩增，得到初次PCR产物；
3)以初次PCR产物为模板，
P3 :5，-GATAAAGTAAGACTAAACACAAGC-3，(SEQ ID NO. 4) P4 5' -CATTCTTCTCAGGCCCCGCT-3，(SEQ ID NO. 5) 为引物，进行二次PCR扩增，得到二次PCR产物；
4)对二次PCR产物进行分析，确定待测亲本的垂体特异性转录因子启动子的是否为 SEQ ID NO. 1所示序列的纯合体。使用内切酶BsrB I对二次PCR产物进行单酶切，之后对酶切产物进行电泳分析确定待测亲本的启动子的是否为SEQ ID NO. 1所示序列的纯合体。初次PCR扩增的反应体系为
ddH20 14. 8μ ；
IOXbuffer 2. 0 μ ；
MgCl2 (25 mmol/L) 0. 8 μ ；
dNTP (10 Mmol/L) 0. 4 μ ；
上下游引物(20 Mmol/L)各0. 4 μ ；
DNA 模板1.0 μ ；
Taq 酶(5U/>L)0. 2 μ 。初次PCR扩增的程序为94°C预变性4 min ；94°C变性30秒，53 °C退火90秒，72 °C 延伸30秒，32个循环；72°C延伸10 min。二次PCR扩增的反应体系为
ddH20 14. 8μ ,
IOXbuffer 2.0 μ ,
MgCl2 (25 mmol/L) 0. 8 μ ；
dNTP (10 Mmol/L) 0. 4 μ ；
上下游引物(20 Mmol/L)各0. 4 μ ；
初次PCR扩增产物1.0 μι;
Taq 酶(5U/>L)0. 2 μ 。二次PCR扩增的程序为94°C预变性4 min ；94°C变性30秒，50°C退火15秒，72°C 延伸30秒，32个循环；72°C延伸10 min。申请人:研究发现，在大口黑鲈垂体特异性转录因子(pituitary specific transcription factorl, P0UIFI)启动子序列的-183位置发现一个SNP，用限制性内切酶 BsrA I酶切后有210bp和187bp两条带，定为等位基因A和B。在检测的随机群体实验中发现，这个SNP对体重、体长、全长、体高、体宽有显著影响，其基因型AA和AB的个体的生长性状明显优于基因型为BB的个体。因此，根据大口黑鲈启动子序列设计引物，建立了有效地鉴定具有优良生长性状且遗传稳定的亲本。利用本方法将生产中BB和AB基因型大口黑鲈亲本去除，保留AA基因型的大口黑鲈亲本，便可快速获得生长速度快且遗传稳定的大口黑鲈的品种。该方法与传统的方法相比，具有目的性强，作用效果直接的优点，且操作简单、检测快速、检测成本低，便于广泛推广使用。本发明的方法，大大降低了大口黑鲈亲本筛选的盲目性，可以快速获得生长速度快且遗传稳定的大口黑鲈品种。通过酶切之后分析，既保证了检测结果的可靠性，无需使用专用仪器对PCR产物进行测序分析，提高了处理效率。
具体实施例方式研究发现，在大口黑鲈垂体特异性转录因子(pituitary specific transcription factorl, P0UIFI)启动子序列的-183位置发现一个SNP，用限制性内切酶 Bsr^ I酶切后有210bp和187bp两条带，定为等位基因A和B。等位基因A的序列如SEQ ID NO: 1所示，SEQ ID NO: 1所示序列的第_183bp的T突变为G即得到等位基因B。本实验用于关联分析的样本数为1 的随机群体M为同一批繁殖、同池养殖，且采样时间一致，因此在建立模型时不考虑时间、环境及人工饲养条件的差异。不同基因型个体间生长性状的多重比较结果见表3-3，关联分析结果表明，两个SNPs所构成的单倍型对体重、体长、全长、体高、体宽有显著影响(/X0. 05)，基因型为AA和AB的个体的生长性状明显优于基因型为BB的个体。
权利要求
1.大口黑鲈垂体特异性转录因子启动子，其序列如SEQID NO. 1所示。
2.一种快速生长大口黑鲈亲本的筛选方法，包括以下步骤检测大口黑鲈亲本中的大口黑鲈垂体特异性转录因子启动子的序列，选择序列如SEQ ID NO. 1所示的纯合体作为亲本。
3.根据权利要求2所述的一种快速生长大口黑鲈亲本的筛选方法，包括如下步骤1)从待测亲本中剪取鳍条样品，提取DNA；2)以提取得到的DNA为模板，Pl :5，-GCAGAGCCCAAGACAAACAC-3，(SEQ ID NO. 2) P2 :5，-ATGAGGATTGGCAAGGGTGAGTCT-3，(SEQ ID NO. 3) 为引物，进行初次PCR扩增，得到初次PCR产物；3)以初次PCR产物为模板，P3 :5，-GATAAAGTAAGACTAAACACAAGC-3，(SEQ ID NO. 4) P4 :5，-CATTCTTCTCAGGCCCCGCT-3，(SEQ ID NO. 5) 为引物，进行二次PCR扩增，得到二次PCR产物；4)对二次PCR产物进行分析，确定待测亲本的垂体特异性转录因子启动子的是否为 SEQ ID NO. 1所示序列的纯合体。
4.根据权利要求3所述的一种快速生长大口黑鲈亲本的筛选方法，其特征在于使用内切酶BsrB I对二次PCR产物进行单酶切，之后对酶切产物进行电泳分析确定待测亲本的启动子的是否为SEQ ID NO. 1所示序列的纯合体。
5.根据权利要求3所述的一种快速生长大口黑鲈亲本的筛选方法，其特征在于初次 PCR扩增的反应体系为ddH20 14. 8μ ；IOXbuffer 2. 0 μ ；MgCl2 (25 mmol/L) 0. 8 μ ；dNTP (10 Mmol/L) 0. 4 μ ；上下游引物(20 Mmol/L)各0. 4 μ ；DNA 模板1.0 μ ；Taq 酶(5U/>L)0. 2 μ 。
6.根据权利要求3或5所述的一种快速生长大口黑鲈亲本的筛选方法，其特征在于 初次PCR扩增的程序为94°C预变性4 min ；94°C变性30秒，53°C退火90秒，72°C延伸30 秒，32个循环；72°C延伸10 min。
7.根据权利要求3所述的一种快速生长大口黑鲈亲本的筛选方法，其特征在于二次 PCR扩增的反应体系为ddH20 14. 8μ ,IOXbuffer 2.0 μ ,MgCl2 (25 mmol/L) 0. 8 μ ；dNTP (10 Mmol/L) 0. 4 μ ；上下游引物(20 Mmol/L)各 0. 4 μ ； 初次PCR扩增产物1.0 μι;Taq 酶(5U/>L)0. 2 μ 。
8.根据权利要求3或7所述的一种快速生长大口黑鲈亲本的筛选方法，其特征在于 二次PCR扩增的程序为94°C预变性4 min ；94°C变性30秒，50°C退火15秒，72°C延伸30 秒，32个循环；72°C延伸10 min。
全文摘要
本发明公开了大口黑鲈快速生长基因及亲本筛选方法，生长基因其序列如SEQIDNO.1所示。该基因对大口黑鲈的体重、体长、全长、体高、体宽有显著影响。通过检测这一基因在大口黑鲈中是否为纯合，可以快速、准确地筛选出生长性状优异的亲本。该方法与传统的方法相比，具有目的性强，作用效果直接的优点，且操作简单、检测快速、检测成本低，便于广泛推广使用。
文档编号C12N15/113GK102242121SQ20111013700
公开日2011年11月16日 申请日期2011年5月25日 优先权日2011年5月25日
发明者于凌云, 李胜杰, 李镕, 杜芳芳, 樊佳佳, 白俊杰, 马冬梅 申请人:中国水产科学研究院珠江水产研究所