专利名称：可作为分子标记的山羊coxⅱ基因片段的筛选方法及其应用的制作方法
可作为分子标记的山羊COX II基因片段的筛选方法及其应用技术领域
本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体的说是一种可作为分子标记的山羊 COX II基因片段的筛选方法及其应用。
背景技术：
羊的精液冷冻和人工授精是一项成熟并投入生产的生物技术，已经成为新品种培育和良种推广不可缺少的技术，在山羊的品种改良和生产上发挥这巨大作用。羊人工受精是用机械采取公羊精液，进行品质检查和稀释处理后，在把精液注入发情母羊生殖道内，以代替公、母羊自然交配的一种方法。使用人工受精有下述优点(I)提高种公羊的配种效率，特别是在冷冻精液的情况下，I头公羊每年可配母羊达3000头以上。(2)可充分发挥优良种公羊的种用价值。选择最优秀的种公羊用于配种，达到迅速增值良种羊和改良羊种的目的。(3)可以防止因自然交配公母羊互相接触传染的各种疾病，特别是生殖道传染病的传播。(4))克服了公、母羊体格差异过大造成的配种困难(5)可以利用冷冻精液配种，克服了时间、地域和空间的限制，对加速山羊品种改良具有重要作用。(6)使用人工受精可提供完整的配种记录，有助于分析母羊不孕的原因，帮助提高受胎率。(7)可以相应减少种公羊的饲养头数，从而节约饲养管理费用。在人工授精过程中，羊的精液品质的好坏直接影响到该技术带来的遗传改良的效果和经济效益，其中精子活力是精液品质中最重要的一项指标。精子活力(sperm motility)是指精液中呈前进运动精子所占的百分率。由于只有具有前进运动的精子才可能具有正常的生存能力和受精能力，所以精子活力与母畜受胎率密切相关，从而它是目前评定精液品质优劣的常规检查的主要指标之一。
研究表明，精子活力很大程度上与受公畜本身遗传因素有关。精子线粒体主要存在于精子的尾部中段，精子活动的主要能量来源于ATP，而精子线粒体是精子的供能中心， 线粒体代谢异常和供能不足可能是精子活动力障碍的主要原因。哺乳动物每条精子内大约含有75个线粒体。线粒体DNA的异常，会影响精子运动及活动。在弱精子和死精子中，均可以见到大量的线粒体有不同程度的缺陷。虽然线粒体编码的蛋白质种类只占线粒体蛋白的一小部分，但它们构成了线粒体呼吸链酶复合物中的重要亚单位，参与线粒体呼吸链和氧化磷酸化功能，对能量的产生起着重要的作用。近年来，在人类的生育研究中，mtDNA缺陷导致精子活动障碍相关的研究已引起人们的关注，Kaot等研究发现mtDNA4977bp缺失、 7345bp缺失和7599bp突变与精子活动力障碍有关。
细胞色素氧化酶(cytochrome oxidase, COX)是一种氧化还原酶,它是一种存在于细菌或线粒体上的大型跨膜蛋白复合物，是由核DNA和线粒体DNA共同编码的呼吸链复合物IV的主要组成部分，相对分子量166KD，位于线粒体内膜上，是惟一能将电子传给氧分子的细胞色素复合物，其损伤可直接影响线粒体功能。它由13个亚基组成，其中构成级联反应核心的最大3个亚基(COX 1、11和III)由mtDNA编码。细胞色素c氧化酶亚II (C0X II)是由线粒体DNA(mtDNA)编码的CO活性中心，总长约683bp，在与位于线粒体胞质面与细胞色素C(cytochrome c,cyto c)进行反应。该亚基是线粒体内细胞色素c的结合部位， COX II的结构和功能的改变直接导致线粒体呼吸链的破坏，并与细胞色素c的释放有关。 而精子运动过程中所需要的能量主要是有线粒体鞘供给，所以精子的活力，能够间接或直接受到三磷酸腺苷(ATP)的影响，COX II的结构和功能的改变有可能通过影响三磷酸腺苷(ATP)最后影响精子活力。目前，对种公羊种用价值评定，主要采用后裔测定法，此法周期长、投入大，采用分子标记辅助选择不失为一条捷径，此方法可提供种公羊早期选择和部分替代种公羊后裔测定，从而可以节省大量的时间和成本体高经济效益。目前关于COX II基因研究主要集中在肝脏，心脏等组织细胞调完方面的研究，关于COX II基因突变对山羊精子活力性状影响的研究尚未见报道。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种可作为分子标记的山羊COX II基因片段的筛选方法。本发明的另外一个目的是提供一种在山羊精子活力性状标记辅助选择中，将山羊 COX II基因片段作为分子标记的应用。对于作为分子标记的山羊COX II基因片段的筛选方法，本发明采用的技术方案是包括如下步骤(1)构建山羊精子基因组DNA池，并以此池DNA为模版，利用设计的引物特异性Pl 在TagDNA聚合酶、buffer、Mg2+、dNIPs存在的情况下，PCR扩增COXII基因；所述引物Pl如下正向引物5，-CGGTCTGAACTATCTTAC-3，反向引物5，-GAACGTCTTCGGAAGAGA-3，PCR 扩增条件:50ng/ul 基因组 DNA 模板 1. 0ul,25mmol/L MgCl2 1. 5ul，2. 5mmol/ L dNTPO. 5ul，引物(IOpmol)各 0. 8ul，10X 反应缓冲液 2. Oul，0. 4ulTaq DNA 聚合酶(5U)， 用超纯水补足20ul ；PCR反应程序如下95°C预变性5min，94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s， 32个循环，72 °C延伸8min，最后4°C保持8min ；(2)根据琼脂糖凝胶电泳图判定目的片段大小，测序发现该PCR扩增产物在162bp 处存在1个A — G的碱基的突变；用限制性内切酶HindIII消化引物Pl的PCR扩增产物， 并用2%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的扩增片段，进行基因型判定。另外，上述山羊COX II基因片段可作为山羊精子活力性状选择的分子标记，为山羊精液品质性状标记辅助选择提供分子标记。本发明的有益效果是明确了与山羊精子活力性状相关的功能基因COX II基因的1个SNP，这A —G突变能够作为一个山羊公羊精子活力分子遗传标记，利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。本发明为COX II基因的SNP与山羊精子活力性状关系的建立奠定了基础，以便用于山羊种公羊精液品质性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的山羊种群。
图I是是本发明的操作流程图。
图2图3是山羊COX II基因片段PCR扩增产物RFLP检测图。
图3是山羊COX II基因片段DNA序列测序峰图。
在图2中，M表示Marker,即分子标记。
具体实施方式
图I表示了本实施例的操作流程，以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
I、山羊精子活力性状相关COX II基因部分DNA片段的扩增
I. I样本采集及基因组DNA提取
通过假阴道法进行采精。采精公羊为体质健壮，繁殖性能良好安徽白山羊(40只) 和波尔山羊(40只)，样本由合肥博大牧业科技公司种羊场提供。冻存于_70°C冰箱中。基因组DNA按照下列方法提取
I)取Iml山羊精液放入2ml高压灭菌离心管中，加入Iml的PBS漂洗后弃上清液， 再加入Iml的PBS漂洗一次，弃上清液。
2)向离心管中加入700 u ITE抽提液，再加入20 的SDS (20% )、0. 06mmo INaCl, IOiU 的 ProK(20mg/ml)充分混匀。
3)将上述离心管进行55°C水浴，消化过夜。
4)向各个离心管中加入等体积的约800 U I的Tris饱和酚，轻轻摇动混匀lOmin， 然后离心 12000rpm, 8min。
5)将上层清液取出，装入新的离心管中中，再加等体积的Tris饱和酚，轻轻摇动混勻 IOmin,离心 12000rpm, 8min。
6)取上层清液，加入等体积的酚氯仿异戊醇(25 24 I)混匀 IOmin (300 U I 酿、300 U I 氯仿:异戍醇)离心 12000rpm, 8min。
7)取上层清液加入等体积的氯仿异戊醇(24 l)600iil，轻轻混匀lOmin，离心 12000rpm,IOmin0
8)取上层清液加入I. 5ml冰乙醇，再加1/10体积的NaAc水平摇动，可见絮状、白色DNA样品出现。
9)将样品置于-20°C冷冻30min，离心，12000rpm, 5min, DNA沉于管底。
10)用75%乙醇洗漆DNA,摇动洗漆后，离心12000rpm, 5-lOmin。
11)弃去75%的乙醇，自然干燥后，加入IOOiUTE溶解，放_20°C冰箱中保存。
1.2DNA池的构建
I)将80个基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，对DNA样品条带均一、无拖尾的样品随机选择50个样本。
2)使用紫外分光光度计测量每个个体的DNA浓度，并且最终稀释到统一的浓度 (50ng/u I)。
3)再用移液器从上述50个个体中，每个个体中吸取5ul基因组DNA，统一混合在一个Eppendorf管中，充分混勻，即得到一个DNA池。必须保证每一个DNA池中每个个体CN 102533746 A
DNA的量都是相等的。1.3引物设计根据山羊COX II基因序列(Genbank登录号⑶229281)，利用I^rimerS. 0设计特异性引物对COX II基因进行扩增，引物序列如下正向引物5，-CGGTCTGAACTATCTTAC-3，方向引物5，-GAACGTCTTCGGAAGAGA-3，该引物扩增长度291bp1. 4PCR扩增体系及扩增条件体系COX II基因片段PCR扩增体系为20ul，包括50ng/ul基因组DNA模板 1. 0ul,25mmol/L MgCl2 1. 5ul,2. 5mmol/L dNTPO. 5ul，引物(IOpmol)各 0. 8ul，IOX 反应缓冲液2. 0ul，0.如1 Taq DNA聚合酶(5U)，用超纯水补足20ul。条件PCR扩增程序为95°C预变性5min，94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸 308，32个循环，721延伸8min，最后4°C保持8min。1. 5PCR产物检测、纯化、回收及测序1)PCR产物检测PCR扩增产物在进行纯化回收前，需要经过琼脂糖凝胶电泳的检测。电泳结果所示，可以清楚的看到^lbp的条带，说明目的基因片段扩展成功2)PCR产物检测纯化回收PCR扩增产物采用北京天根生化科技有限公司试剂盒进行纯化回收。具体步骤如下a.将PCR扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳后，将目的DNA条带切下，然后放入离心管中；b.加入500 μ 1平衡液进吸附柱中，离心lmin(12000rpm)并回收集管。向上述离心管中加入500 μ 1溶胶液PN。50°C水浴放置lOmin，间歇性摇动离心管。直至胶块完全溶解；c.待胶块完全溶解后，将上一步所得溶液加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室温放置lmin，12000rpm离心60s，倒掉收集柱中的废液；d.加600 μ 1漂洗液进吸附柱中，离心30 60s(12000rpm)，静置2min，弃掉收集柱中废液；加入500 μ 1漂洗液，离心30 60s(12000rpm)，倒掉废液。将吸附柱放回收集管中，离心aiiin(12000rpm)，除尽漂洗液。将吸附柱置于室温放置，彻底晾干；e.用水作洗脱液，将吸附柱放到干净离心管中，滴加50 μ 1蒸馏水，室温放置 2min。离心 2min (12000rpm)收集 DNA 溶液。f.用2%的凝胶电泳检测，并将产物保存在-20°C，以防DNA降解。3)目的片断测序经检测成功的PCR纯化产物及扩增引物送交北京华大基因公司进行双向测序(测序仪为ABI PRISM3730基因分析仪；测序试剂为=BigDye terminator v3. 1)。对测序峰图进行分析，其中在同一位置有两个不同峰是发生了单核苷酸突变；在测序结果显示片段扩增长度为^lbp,发现扩增产物存在1个碱基的突变，即第162bp位存在 A — G等位突变(图3)。2、山羊COX II基因片段PCR-RFLP检测2.1 RFLP 方法建立PCR 酶切反应总体系为 20ul，其中 PCR 产物 5. Oul, IX 酶切 bufferl. Oul,HindIII内切酶(5U)0. 5ul，用超纯水补足20ul，37°C水浴锅消化12小时，用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，拍照保存酶切结果图片，并记录基因型。只出现291片段，命名为AAM^mieibp 和130bp两条带，命名为BB型。
2. 2不同基因型个体PCR产物的测序验证
将AA型和BB型个体PCR产物各挑5个送交北京华大基因公司进行双向测序，结果如图2所示，在COX II基因片段扩增产物序列显示第162bp位在A — G等位突变，该突变导致限制性内切酶HindIII酶切位点改变，当该位点为A时存在该酶切位点(A/AGCTT)， 命名为B等位基因，限制性内切酶HindIII将该片段切为两段(161bp和130bp);当该位点突变为G时不存在该酶切位点(AGGCTT)，命名为A等位基因，限制性内切酶HindIII不能识别碱基错配引入的酶切位点导致不能将其切开。由于线粒体DNA不存在重组，这两个位点只有2种基因型AA和BB。
3、该山羊COX II基因片段作为分子标记在山羊精子活力性状关联分析上的应用
3. I精液采集
通过假阴道法进行采精。采精公羊为体质健壮，繁殖性能良好安徽白山羊(40只) 和波尔山羊(40只)，样本由合肥博大牧业科技公司种羊场提供。该样本在同一个饲养管理条件下舍饲圈养。
3. 2精液的冷冻与解冻
3. 2. I颗粒冻精制作
用假阴道法采精实验羊精液。按原精液稀释液为I : 4比例一步法稀释鲜精， 4°C冰箱平衡3h后，铜纱网上滴冻、熏蒸5min后浸入液氮，制作0. Iml/粒的颗粒冻精。
3. 2. 2冻精颗粒解冻
从液氮中取出冻精颗粒后放入经维生素B12液润湿过的试管，在40°C水浴中解冻。
3. 3精液活力测定
精子活力取鲜精或解冻后冻精精液20ii L，置于38°C恒温载物台的载玻片上，加盖玻片后，用带有监视器屏幕的显微镜400倍下观测其活力。精子密度利用0. 9% NaCl溶液将鲜精精液5倍稀释用精子密度测定仪测定。
3. 4山羊精子活力性状关联分析
安徽白山羊和波尔山羊公羊DNA样品用于基因型检测，并对对应样本的精液进行分析，分析的主要指标包括精子密度、原精活力及冻精活力。
对山羊COX II基因的PCR-RFLP多态位点基因型检测结果表明安徽白山羊中40 个个体中AA基因型有12个，BB基因型有28个。波尔山羊中40个个体中AA基因型有8 个，BB基因型有32个。利用SPSS(13.0)软件分析精子密度、原精活力、冻精活力和各基因型之间的相关性。先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘法分析各基因型间性状的最小二乘均值和标准差，结果见表I。
表I安徽白山羊和波尔山羊公羊不同COX II基因型个体精子活力性状参数
权利要求
1.一种可作为分子标记的山羊COX II基因片段的筛选方法，其特征在于，包括下列步骤(1)构建山羊精子基因组DNA池，并以此池DNA为模版，利用设计的特异性引物Pl在 TagDNA聚合酶、buffer、Mg2+、dNTPs存在的情况下，PCR扩增COX II基因；所述引物Pl如下正向引物5’ -CGGTCTGAACTATCTTAC-3， 反向引物5，-GAACGTCTTCGGAAGAGA-3，所述 PCR 扩增条件:50ng/ul 基因组 DNA 模板 1. 0ul,25mmol/L MgCl2L 5ul，2. 5mmol/L dNTPO. 5ul，引物(IOpmol)各 0. 8ul，10X 反应缓冲液 2. Oul，0. 4ul Taq DNA 聚合酶(5U)， 用超纯水补足20ul ；所述PCR反应程序如下95 °C预变性5min，94 V变性30s，53 °C退火30s，72 °C延伸30s， 32个循环，72 °C延伸8min，最后4°C保持Snin ；(2)根据琼脂糖凝胶电泳图判定目的片段大小，测序发现该PCR扩增产物在162bp处存在1个A — G的碱基的突变；用限制性内切酶HindIII消化引物Pl的PCR扩增产物，并用 2%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的扩增片段，进行基因型判定。
2.—种可作为分子标记的山羊COX II基因片段的应用，其特征在于，所述山羊COX II 基因片段可作为山羊精子活力性状选择的分子标记，为山羊种公羊种用价值的评定提供分子标记辅助选择。
全文摘要
本发明公开了一种山羊COX II基因片段的筛选方法及其应用。该筛选方法以构建的山羊精子池DNA为模版，利用设计的特异性引物P1在Tag DNA聚合酶、buffer、Mg2+、dNTPs存在的情况下，设定相应的程序，PCR扩增COX I I基因。根据琼脂糖凝胶电泳图判定目的片段大小。测序获得序列及突变位点信息，结果显示扩增产物存在1个碱基的突变。利用限制性内酶切酶HindI II消化P1扩增产物后，再用琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的扩增片段。通过对P1的扩增产物进行基因型和基因频率分析，以及与安徽白山羊、波尔山羊的精子活力之间进行关联分析，表明COX II基因由引物P1检测的SNP位点可作为山羊精子活力性状选择的分子标记，为山羊精液品质性状标记辅助选择提供分子标记。
文档编号C12Q1/68GK102533746SQ20121001619
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月11日 优先权日2012年1月11日
发明者丁建平, 凌英会, 孙志辉, 张子军, 张晓东, 张运海, 章孝斌, 章孝荣, 黄桠峰 申请人:合肥博大牧业科技开发有限责任公司, 安徽农业大学