专利名称：一种甘油三酯水解酶基因有效shRNA的筛选方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种甘油三酯水解酶基因有效ShRNA的筛 选方法。
背景技术：
RNA干扰是通过双链RNA(dsRNA)介导的遗传干涉现象，它能够特异、有效地 降解mRNA，从而引起基因的沉默。自2001年《Nature》杂志上首次报道在哺乳动物 细胞中通过SiRNA成功诱导了靶基因的特异性表达沉默后，RNA干扰技术就开始作为一 项特异性基因沉默工具在哺乳动物细胞上广泛应用。2003年Rubinson等报道用病毒系统 在原代培养的细胞、干细胞及转基因小鼠上都取得了 RNA干扰成功，更大大扩展了这项 技术的应用范围。目前，RNAi已发展成为调控生物基因表达的遗传学工具，广泛应用于 功能依赖性遗传筛选、基因功能研究等后基因组计划研究中，并有望成为潜在的基因治 疗工具。甘油三酯(TG)是脂肪的主要存在形式，其水解过程是机体主要的能量来源。 2004年，来自于三个不同的实验室的Zimmermann，Jenk ins和Villena等人，同时发现 了一种性质相似的脂肪酶，分别命名为adiposetriglyceride lipas e (ATGL)，desnutrin和 phospholipase A2 ξ (iPLA2 ξ )，经结构和功能研究表明这三种蛋白实为一种脂肪酶，并 将其统一命名为甘油三酯水解酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)。Zimmermann等对不 同物种的ATGL进行研究发现，其氨基酸序列中都存在一个GXSXG(氨基乙酸_X_丝氨 酸-X-氨基乙酸)模序，并且其中间的丝氨酸位点与ATGL的活性有关。此外，在ATGL 的N端还发现一个α/β折叠区域(COG1752)和一个Patatin结构域(PfamO 1734)，这些 结构都是与脂肪酶活性密切相关的保守性区域。对ATGL缺陷型小鼠的研究发现，体内 脂肪组织含量明显提高，并且在多个组织中表现出甘油三酯堆积的现象；同时，心脏由 于堆积过量脂质，引起心脏功能紊乱，并最终导致死亡。在动物细胞中应用RNA干扰技术的另一关键在于有效SiRNA序列的筛选。但 是截至目前，筛选有效的RNAi的序列继而构建其腺病毒载体，尚属空白。因此，现有技术存在缺陷，需要改进完善。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种甘油三酯水解酶 基因有效ShRNA的筛选方法。本发明的方法包括以下步骤Al 编码目的ShRNA的单链DNA寡核 苷酸片段的设计、合成；Α2 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA载体的构建；A3 pDsRedl-Cl-ATGL载体的构建；A4 shRNA有效序列的筛选。所述的方法，其中优选的，所述步骤Al具体执行以下操作根据本实验室克隆 得到的西农萨能羊ATGL序列，设计三条ATGL-siRNA及1条阴性对照序列，在siRNA基础上，将19bp的寡核苷酸以正反向组合，中间添加GAGTACTG的发夹环序列间隔， 使寡核苷酸内部形成发夹结构，每对寡核苷酸两端分别带有BamH I和Xho I酶切位点， 其中正义链的3’端添加TTTTTT终止信号，得到ShRNA的正、反义链模板。所述的方法，其中优选的，所述步骤A2具体执行以下操作A21:单链寡核苷 酸退火反应生成双链；将合成的单链寡核苷酸序列用灭菌无离子水溶解成浓度为200 μ M 的溶液，然后进行退火反应，退火条件是95°C X4分钟，取出置室温逐渐冷却，即获 得浓度为50 μ M的双链寡核苷酸序列，分别标记为ds422、ds600、dsll48 ；再分别取 少量稀释成浓度为5nM的工作浓度，A22 连接反应-构建穿梭载体；用BamH I及Xho I双酶切PRNTR/CMV-GFP/U6载体并切胶回收，然后将所述ds422、所述ds600和所述 ds 1148分别与pRNTR/CMV-GFP/U6载体酶切回收产物连接反应，反应条件为4°C连接 过夜，得到连接产物；A23:连接产物转化；取10 μ L所述连接产物加入100 μ L感受 态DH5a细菌，冰浴30分钟，42°C热激90秒，置冰浴12分钟，加入600 μ L LB培养 液，37°C温和震荡培养45分钟，将细菌涂布于含50 μ g/mL卡那霉素的琼脂平板上，置 于37°C温箱孵育；A24:筛选穿梭载体克隆。所述的方法，其中优选的，所述连接反应体系为如下PENTRTM/U6，2yL； ds oligos (5nM)，IyL ； 5X 退火缓冲液，4yL; T4DNA 连接酶，IyL;不含 DNase/ Rnase 的水，12 μ L ；总体积 20.0 μ L。所述的方法，其中优选的，所述步骤Α24具体执行以下操作(1)穿梭载体克隆 的质粒酶切鉴定ds oligos的黏性末端与试剂盒提供的线性载体pENTRTM/U6的黏性末 端互补，经连接反应后，形成环形质粒；于卡那霉素琼脂平板上挑取单克隆菌落，转种 于4mL的含50 μ g/mL卡那霉素的LB培养液中，37°C振荡培养12-16小时，取菌液2mL 提取质粒，大小符合的再进行Sca I及EcoR V双酶切鉴定，产物以1.2%的琼脂糖凝胶电 泳观察；(2)穿梭载体克隆的测序鉴定取(1)中双酶切鉴定正确的单克隆菌液，送南京 金思瑞生物技术有限公司以ABI377型DNA自动荧光序列分析仪进行序列测定，引物为 测序引物U6或M13。所述的方法，其中优选的，所述步骤A3具体执行以下操作A31:构建 pDsRedl-Cl-ATGL克隆载体；将回收的目的基因片段与pGM-Τ载体连接，16°C保温过 夜，连接产物转化感受态E.C0liDH5ci菌株，涂布于含氨苄青霉素和X-gal/IPTG的LB培 养平皿中，于37°C培养过夜，挑取白色单菌落摇菌，同时进行菌落PCR，反应结束后取 10 μ L反应液进行琼脂糖凝胶电泳鉴定；将阳性克隆菌液利用碱裂解法抽提质粒，然 后用Xho I和Sal I内切酶进行双酶切鉴定，酶切反应体系如下10 XH Buffer，2.0 μ L ； Xho I，0.7 μ L ； Sal I，0.7 μ L ； pGM-T-gATGLlAl, 10.0 μ L ； ddH20, 6.6 μ L ；总体 积20.0yL; 37°C水浴反应过夜，取全部反应液在琼脂糖凝胶上电泳，回收带有设计 酶切位点的目的基因片段；A32:构建pDsRedl-Cl-ATGL表达载体。所述的方法，其中优选的，所述步骤A 32具体执行以下操作(1)配制 pDsRedl-Cl酶切反应体系并进行37°C水浴反应过夜；(2)酶切反应结束后，取全部反应 液进行琼脂糖凝胶电泳，回收pDsRedl-Cl载体酶切后的线性化片段；(3)将载体片 段与目的基因片段连接，16°C反应过夜；(4)将pDsRedl-Cl-ATGL转化至E.coli DH5 α 感受态细胞，涂布含卡那霉素的平皿，37°C孵育过夜，挑取单菌落摇菌，同时进行菌落PCR鉴定，然后提取质粒，进行酶切鉴定。所述的方法，其中优选的，所述酶切反应体系为IOXH Buffer，2.0 μ L ； Xho I，0.7 μ L ； Sal I，0.7 μ L ； pDsRedl—Cl—ATGL，5.0 μ L ； ddH20, 11.6 μ L ；总体积 20.0 μ L。所述的方法，其中优选的，所述步骤Α4具体执行以下操作Α41:去内毒素质 粒提取；Α42 细胞的复苏；Α43细胞传代培养Α44 细胞转染。所述的方法，其中优选的，所述步骤Α41具体执行以下操作(1)柱平衡向 吸附柱中加入500 μ L的平衡液，吸附柱放入收集管中，12000rpm(13400Xg)离心1分 钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；(2)取5-15mL过夜培养的菌液 加入离心管中，12000rpm(13400Xg)离心1分钟，吸除上清液；(3)向留有菌体沉淀的 离心管中加入500 μ L已加入RNaseA的溶液P1，使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉 淀；(4)向离心管中加入500 yL溶液Ρ2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解；(5) 向离心管中加入700 yL溶液Ρ3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混勻，出现白色絮 状沉淀，12000rpm(13400Xg)离心10分钟，在离心管底部形成沉淀，收集上清液；(6) 将(5)中收集的上清液分次加入过滤柱，过滤柱放入收集管中，12000rpm(13400Xg)离 心2分钟，将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱中；(7) 12000rpm(13400Xg)离 心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；(8)向吸附柱中加入500μ1去 蛋白液，12000rpm(13400Xg)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管 中；(9)按照3倍体积向漂洗液中加入无水乙醇，向吸附柱中加入700 μ L所述漂洗液， 12000rpm(13400Xg)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；(10) 向吸附柱中加入500μ 漂洗液，12000rpm(13400Xg)离心1分钟，倒掉收集管中的废 液；(11)将吸附柱重新放回收集管中置于12000rpm(13400Xg)离心2分钟，将吸附柱中 残余的漂洗液去除；(12)将吸附柱置于一干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴 加100-300 μ L洗脱缓冲液，室温放置2分钟，12000rpm(13400 Xg)离心1分钟后将质粒 溶液收集到离心管中。所述的方法，其中优选的，所述步骤A42具体执行以下操作(1)从液氮罐中取 出1支冻存的HEK293细胞，立即放入38°C水浴锅中，至细胞完全融化；(2)将冻存管内 容物转入IOmL离心管中，加入4mL含10%FBS&DMEM，洗脱冻存时加入的DMSO ； (3) 1400rpm,离心10分钟，弃掉上清液；(4)加入2.0mL含10% FBS的DMEM，吹勻， 转移入塑料培养瓶中，在所述离心管中再次加入2.0mL含10% FBS的DMEM，吹勻， 将残余细胞转入所述塑料培养瓶中；(5)拧松培养瓶瓶盖，置37°C，5% CO2培养箱中培 养。所述的方法，其中优选的，所述步骤A43具体执行以下操作(1)将培养瓶内培 养基吸弃，加入ImL培养基清洗后吸弃，以除去血清；(2)加入ImL 0.25%的ATV，置 于镜下观察，当细胞饱满后吸弃ATV ； (3)加入2mL含10% FBS的DMEM，吹打贴壁 细胞，使细胞均勻分散，将细胞悬液分装至2-3个新培养瓶中，置37°C，5%C02培养箱培养。所述的方法，其中优选的，所述步骤A44具体执行以下操作将低血 清Opti-MEM培养液及LipofectamineTM2000于室温条件下平衡；按2 1比例将Lipofectamine 2000及质粒分别加入250 μ L低血清Opti-MEM中，轻弹管壁使混勻，室 温静置5min，将质粒DNA/低血清Opti-MEM混合物加入LipofectamineTM2000低血清 Opti-MEM混合物中，轻弹管壁使之混勻，室温孵育20min;将转染复合物均勻、缓慢地 加入细胞培养皿中，轻旋培养皿混勻液体，将细胞放入37°C细胞培养箱孵育。
本发明在构建重组腺病载体之前先在HEK 293细胞中验证所设计序列的干扰 效果，以节省时间及成本，将干扰载体及靶基因表达载体分别用绿色荧光和红色荧光标 记，共转染HEK 293细胞，通过在荧光显微镜下观察绿色荧光及红色荧光的强度就可以 判断干扰载体的转染效率及靶基因的干扰效率，由于采用红光和绿光两种不同荧光分别 标记干扰载体及靶基因，使得干扰序列筛选过程省时高效，结果更直观可靠，而且可以 同时筛选多条序列。
图1为pRNTR/CMV-GFP/U6-shRNA质粒凝胶电泳分析图2 为 pRNTR/CMV-GFP/U6-shRNA 酶切鉴定图3为pGM-T-ATGL双酶切鉴定图4为pDsRedl-CI-ATGL阳性转化子的PCR鉴定；图5 为 pDsRedl-CI-ATGL 酶切鉴定；图6为RNA干扰序列的筛选(200X)，其中A组、B组、C组、D组分别为 shRNA-NC、shRNA-422、shRNA-1148、shRNA-600 序列的干扰效果检测；1 (Al、 Bi、Cl、Dl)、2(A2、B2、C2、D2)分另Ij 为 pENTR/CMV_GFP/U6-shRNA 干扰 载体与pDsRedl-Cl-ATGL靶基因表达载体共转染HEK 293细胞48小时后荧光显微 镜下绿色荧光及红色荧光表达情况；3(A3、B3、C3、D3)为对照组，即单独转染 pDsRedl-Cl-ATGL靶基因表达载体48小时后荧光显微镜下红色荧光表达情况。
具体实施例方式以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。第一步编码目的shRNA的单链DNA寡核苷酸片段的设计、合成；根据本实验室克隆得到的西农萨能羊ATGL序列，利用在线SiRNA选择 程序(http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/home.php)设计三条 ATGL—siRNA 及 1 条阴性对照序列，艮口 s i RNA-422 TCCGGAGCTGCCTGCTGAA(SEQID NO 1) ； siRNA-600 CCTCATCCCCCCTTCCTTC (SEQ ID NO 2) ； siRNA-1148 CCACGGCCATGATGGTGCC (SEQ I D NO 3)； 阴性对照 siRNA-NC ACTACCGTTGTTATAGGTG (SEQ ID NO 4)。在 siRNA 基础上，将 19bp 的寡核苷酸以 正反向组合，中间添加0八0丁八^^(含3(^1酶切位点，以便载体构建中进行鉴定)的发 夹环序列间隔，使寡核苷酸内部可形成发夹结构，每对寡核苷酸两端分别带有BamH I和 Xho I酶切位点，其中正义链的3’端添加TTTTTT终止信号，即得到ShRNA的正、反义 链模板，见表1 表IATGL特异的编码ShRNA的寡核苷酸序列
权利要求
1.一种甘油三酯水解酶基因有效ShRNA的筛选方法，其特征在于，包括以下步 骤Al:编码目的ShRNA的单链DNA寡核苷酸片段的设计、合成；A2 : pENTR/ CMV-GFP/U6-shRNA 载体的构建；A3: pDsRedl-Cl-ATGL 载体的构建；A4 shRNA有效序列的筛选。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤Al具体执行以下操作根据 GenBank公布的西农萨能羊ATGL序列，设计三条ATGL-siRNA及1条阴性对照序列， 在SiRNA基础上，将19bp的寡核苷酸以正反向组合，中间添加GAGTACTG的发夹环序 列间隔，使单链DNA寡核苷酸内部形成发夹结构，每对单链DNA寡核苷酸两端分别带 有BamH I和XhoI酶切位点，其中正义链的3’端添加TTTTTT终止信号，得到shRNA 的正、反义链模板。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤A2具体执行以下操作 A21 单链DNA寡核苷酸退火反应生成双链；将合成的单链DNA寡核苷酸序列用灭菌无 离子水溶解成浓度为200 μ M的溶液，然后进行退火反应，退火条件是95°CX4分钟， 取出置室温逐渐冷却，即获得浓度为50 μ M的双链寡核苷酸序列，分别标记为ds422、 ds600、dsll48 ；再分别取少量稀释成浓度为5nM的工作浓度，A22 :构建穿梭载体；用 BamHI及XhoI双酶切pRNTR/CMV-GFP/U6载体并切胶回收，然后将所述ds422、所 述ds600和所述dsll48分别与pRNTR/CMV-GFP/U6载体酶切回收产物连接反应，反应 条件为4°C连接过夜，得到连接产物；A23:连接产物转化；取IOyL所述连接产物加入 100 μ L感受态DH5 α细菌，冰浴30分钟，42°C热激90秒，置冰浴12分钟，加入600 μ L LB培养液，37°C温和震荡培养45分钟，将细菌涂布于含50 μ g/mL卡那霉素的琼脂平板 上，置于37°C温箱孵育；A24:筛选穿梭载体克隆。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述连接反应体系为如下 pENTRTM/U6, 2 μ L ； ds oligos (5nM)，1 μ L ； 5 X 退火缓冲液，4 μ L ； T4DNA 连接 酶，IyL;不含 DNase/Rnase 的水，12yL;总体积 20.0 μ L
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤Α24具体执行以下操作 (1)穿梭载体克隆的质粒酶切鉴定ds oligos的黏性末端与试剂盒提供的线性载体 PENTRTM/U6的黏性末端互补，经连接反应后，形成环形质粒；于卡那霉素琼脂平板上 挑取单克隆菌落，转种于4mL的含50 μ g/mL卡那霉素的LB培养液中，37°C振荡培养 12-16小时，取菌液2mL提取质粒，大小符合的再进行Sca I及EcoR V双酶切鉴定，产 物以1.2%的琼脂糖凝胶电泳观察；(2)穿梭载体克隆的测序鉴定取(1)中双酶切鉴定 正确的单克隆菌液，送测序公司以ABI377型DNA自动荧光序列分析仪进行序列测定， 引物为测序引物U6或M13。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A3具体执行以下操作 A31 构建pDsRedl-Cl-ATGL克隆载体；将回收的目的基因片段与pGM_T载体连 接，16°C恒温过夜，连接产物转化感受态E.C0liDH5ci菌株，涂布于含氨苄青霉素和 X-gal/IPTG的LB培养平皿中，于37°C培养过夜，挑取白色单菌落摇菌，同时进行菌落 PCR,反应结束后取IOyL反应液进行琼脂糖凝胶电泳鉴定；将阳性克隆菌液利用 碱裂解法抽提质粒，然后用Xho I和Sal I内切酶进行双酶切鉴定，酶切反应体系如下 IOXH Buffer, 2.0 μ L ； Xho I, 0.7 μ L ； Sal I, 0.7 μ L ； pGM-T-gATGLlAl, 10.0 μ L ；ddH20, 6.6uL ；总体积20.0μ ; 37°C水浴反应过夜，取全部反应液在1 %琼脂糖凝胶 上电泳，回收带有设计酶切位点的目的基因片段；A32:构建pDsRedl-Cl-ATGL表达载体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤A32具体执行以下操作(1) 配制pDsRedl-Cl酶切反应体系并进行37°C水浴反应过夜；(2)酶切反应结束后，取全 部反应液进行琼脂糖凝胶电泳，回收pDsRedl-Cl载体酶切后的线性化片段；(3)将 载体片段与目的基因片段连接，16°C反应过夜；(4)将pDsRedl-Cl-ATGL转化至E.coli DH5a感受态细胞，涂布含卡那霉素的平皿，37°C孵育过夜，挑取单菌落摇菌，同时进 行菌落PCR鉴定，然后提取质粒，进行酶切鉴定。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述酶切反应体系为IOXHBuffer， 2.0 μ L ； Xho I, 0.7 μ L ； Sal I, 0.7 μ L ； pDsRedl—Cl—ATGL，5.0μ L ； ddH20, 11.6μ L ；总体积 20.0 μ L。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A4具体执行以下操作 A41 去内毒素质粒提取；A42 细胞的复苏；A43细胞传代培养A44 细胞转染。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤A41具体执行以下操作(1) 柱平衡向吸附柱中加入500 μ L的平衡液，吸附柱放入收集管中，12000rpm(13400Xg) 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；(2)取5-15mL过夜培 养的菌液加入离心管中，12000rpm(13400Xg)离心1分钟，吸除上清液；(3)向留有菌体 沉淀的离心管中加入500 μ L已加入RNaseA的溶液Ρ1，使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌细 胞沉淀；(4)向离心管中加入500 μ L溶液Ρ2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解；(5)向离心管中加入700yL溶液Ρ3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混勻，出现白色 絮状沉淀，12000rpm(134(K)Xg)离心10分钟，在离心管底部形成沉淀，收集上清液；(6)将(5)中收集的上清液分次加入过滤柱，过滤柱放入收集管中，12000rpm(13400Xg) 离心2分钟，将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱中；(7) 12000rpm(13400Xg) 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；(8)向吸附柱中加入500μ1 去蛋白液，12000rpm(13400Xg)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集 管中；(9)按照3倍体积向漂洗液中加入无水乙醇，向吸附柱中加入700yL所述漂洗 液，12000rpm(13400Xg)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中； (10)向吸附柱中加入500 μ L漂洗液，12000rpm(13400Xg)离心1分钟，倒掉收集管中的 废液；(11)将吸附柱重新放回收集管中置于12000rpm(13400Xg)离心2分钟，将吸附柱 中残余的漂洗液去除；(12)将吸附柱置于一干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空 滴加100-300 μ L洗脱缓冲液，室温放置2分钟，12000rpm(13400 Xg)离心1分钟后将质 粒溶液收集到离心管中。
全文摘要
本发明公开了一种甘油三酯水解酶基因有效shRNA的筛选方法，其包括以下步骤A1编码目的shRNA的单链DNA寡核苷酸片段的设计、合成；A2pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA载体的构建；A3pDsRed1-C1-ATGL载体的构建；A4shRNA有效序列的筛选；由于采用红光和绿光两种不同荧光分别标记干扰载体及靶基因，使得干扰序列筛选过程省时高效，结果更直观可靠，而且可以同时筛选多条序列。
文档编号C12N15/55GK102021190SQ20101053500
公开日2011年4月20日 申请日期2010年11月9日 优先权日2010年11月9日
发明者滕炎玲, 王伟, 罗军, 赵旺生 申请人:西北农林科技大学