专利名称：一种提高l-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法
一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种通过PCR技术改造工程质粒且对改造后 质粒的宿主菌采用Red系统进行介导来提高L-苯丙氨酸产酸率的方法。
背景技术：
L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)简称L-Phe，为白色结晶粉末，是人体和动物不能 在体内自行合成的必须的氨基酸之一，广泛应用于食品、饲料、医药和化妆品等领域，尤其 是低热量、高甜度的二肽甜味剂阿斯巴甜(Aspartame)应用日益广泛，作为合成阿斯巴甜 两种原料之一的L-苯丙氨酸的市场需求量迅速增加。另外L-苯丙氨酸也是抗肿瘤药物和 氨基酸输液制剂的必需原料，随着其在医药领域的不断开发，需求量也不断增加。因此，对 L-苯丙氨酸生物合成途径的研究、L-苯丙氨酸产生菌的改良和对其工业化生产的研究越 来越受到人们的重视。国内外L-Phe的生产方法主要有水解抽提法、化学合成法、酶法和发酵法等。由于 天然蛋白中L-苯丙氨酸含量较低，水解抽提法很少使用；化学合成法的工艺复杂，成本较 高，在国外基本上被酶法和发酵法取代。但由于底物和酶的价格较高且来源有限，酶法应用 也受到限制；由于微生物直接发酵法可利用廉价易得的原料，又可在常温常压下进行，是目 前国内外生产L-Phe的主流方法，具有较大的竞争优势。其中大肠杆菌以其繁殖迅速、培养 简单、操作方便、遗传背景清楚等特点被广泛改造为适应于外源基因表达的安全的基因工 程受体生物。但是由于L-Phe等终产物对野生菌株体内的芳香族氨基酸合成代谢途径上的 关键酶有着强烈的反馈抑制作用，使其细胞不能大量蓄积苯丙氨酸。同时，多条竞争支路也 相对分流了 L-Phe的能量流向，从而使得L-Phe的收率有限。因此若要进行实际发酵生产， 就必须改造野生菌株，解除支路代谢调控，使其目的代谢终产物能过量蓄积。传统的菌株选育是从自然界中高通量筛选产酸能强的菌株，但是该方法获得的氨 基酸种类和产量有限，后来在确立突变技术和阐明氨基酸合成系统调节机制的基础上发展 为营养缺陷变异株的选育。利用常规诱变育种的方法，其盲目性大，工作量繁重，而且不能 增加基因的拷贝数量，且突变株一般都携带多种营养缺陷，使进一步提高产量受到限制。近年来，随着分子生物学研究的不断深入，有机体越来越多的生物合成途径被人 们所认识，一些微生物基因组全序列的测定及多基因之间的协同作用和代谢网络的多方面 性研究、代谢工程和生物信息学研究的兴起，基因、宿主有机体、载体系统和分子生物学工 具的发展，通过代谢途径的修饰不仅可以提高细胞己有的化学物质产量或产生宿主细胞本 身不能合成的新物质，而且可以扩展细胞的底物使用范围，提高一些有重要经济价值的初 级代谢产物和次生代谢产物。其中此类方法中以提高氨基酸的产量最具有成功的典范。 大肠杆菌直接发酵法合成L-苯丙氨酸，生物合成途径分为共同途径和分 支途径，共同途径为分支途径提供前体物质。以葡萄糖为起始物经赤藓糖-4-磷酸 (Erythrose-4-phosphate, E4P，五碳糖磷酸途径的中间产物)和糖酵解过程的中间产 物——磷酸烯醇式丙酮酸(Phophoenol pyruvate,PEP) 二者缩合形成一个七碳酮糖开链磷酸化合物，称为3-脱氧-α -阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(3-deoxy- α -arobinoheptulosona te-7-phosphate, DAHP)。这是芳香族氨基酸生物合成的共同代谢途径，也是决定其产率和 产量的关键步骤。因此，在大肠杆菌L-苯丙氨酸生物合成中，DAHP是L-苯丙氨酸生物合 成过程中第一个也是最重要的代谢中间物，能否把中心代谢流有效地导向DAHP的合成是 决定芳L-苯丙氨酸生物合成产量高低的决定因素。催化这一关键反应的酶称之为脱氧阿 拉伯糖型庚酮糖磷酸合酶(DS)，是分别由ar0F、ar0G和aroH三个基因编码的三个同功酶， 分别受酩氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的反馈抑制，同时DAHP合成酶还受到苯丙氨酸和酪氨酸 的协同抑制。共同途径之后，分支酸是芳香族氨基酸合成途径的分支点，在分支酸以后又分为两条途径，其中一条形成苯丙氨酸和酪氨酸，另一条形成色氨酸。分支酸在分支酸变位酶作用下，转变为预苯酸，经脱水、脱梭后形成苯丙酮酸，后 者在转氨酶作用下，与谷氨酸进行转氨形成苯丙氨酸。分支酸途径是人们较早对L-苯丙氨 酸改良进行遗传操作的重要环节。分支酸变位酶(CM)是与预苯酸脱水酶(PD)形成的双功 能酶，其活性态是两个PheA基因编码的大小为43000D的亚基构成的同源二聚体；CM/PD酶 在Phe浓度较高时形成二聚体和四聚体的混合物，使酶活性降低或完全丧失，所以它受产 物Phe的反馈抑制，Tyr对此酶也有协同抑制。化学计量分析表明葡萄糖的吸收需要糖_磷酸基转移系统，一分子葡萄糖需一 分子PEP，合成一分子的分枝酸需两分子的PEP，所以PEP成为DAHP理论产量的限制性底 物，PEP的供应量多少决定了 Phe的生物合成。而PEP又是PEP羧化酶、丙酮酸激酶、糖-磷 酸基转移酶和DAHP合成酶的竞争性底物。Imol葡萄糖进入细胞要将Imol的PEP转变成 丙酮酸，同时PEP又可在丙酮酸激酶和PEP梭化酶的作用下分别生成丙酮酸和草酞乙酸。 丙酮酸在生物体内因为高能障而不能自发地转变回PEP，使大量的碳流就经丙酮酸而生成 有机酸、二氧化碳和细胞的内容物。为了使代谢流流向Phe生成的方向，往往采取以下几 种策略1)在Phe生产菌中克隆表达PEP合成酶(PpsA)和转酮酶(tktA)以及PEP羧化激 酶(PckA)的基因；2)钝化PEP的消耗酶如丙酮酸激酶(Pyk) ；3)磷酸转移酶系统的改造 (PTS)。L-苯丙氨酸的生物合成是复杂的系统工程，要提高L-苯丙氨酸生产菌种的合成 产量仅仅克隆几个基因还是不够的，还应该注重菌种本身的整体代谢调控策略、工艺控制 等方面进行多方面的改造工作。其中利用基因敲除方法是L-苯丙氨酸生物合成菌株的宿 主改造当中的一门非常重要的技术。基因敲除亦称基因打靶、基因置换技术，是八十年代后半期发展起来的技术，主要 是利用活细胞染色体DNA与外源DNA的同源序列发生同源重组的性质以达到定点敲除修饰 的目的。Red同源重组技术的原理是将一段携带与靶基因两翼各有40_60bp同源序列的 PCR片段导入宿主菌细胞，利用λ噬菌体Red重组酶的作用，使导入细胞的线性DNA片段与 染色体(或载体)的特定靶序列进行同源重组，靶基因被标记基因置换下来，从而达到目的 基因敲除的目的。这种重组技术是最近发展起来的一项可在染色体水平上进行遗传操作的 新技术，只需较短的同源序列，而不需要特定的限制性酶切位点，即可在生物体内完成重组 过程，省去了体外DNA酶切、连接等步骤。实验证明，这种基因打靶技术是基因功能研究和新菌株构建的有力工具。利用微生物代谢工程方法包括去除生成副产物的酶、解除别构酶的反馈调控、抑 制或高表达相关途径的关键酶、DNA重组或其他方法导入异源基因等。但这些方法要求克服 细 胞内的调控机制。自由生活状态下的细菌也在单个代谢途径上通过特殊步骤调控代谢， 并利用整体代谢网络调控许多代谢途径，从而协调代谢流的分配。整体代谢网络通过对细 胞基因组的一些基因的表达调控，使细胞整体的生理、代谢对外环境迅速做出反应。然而， 这种强力有效的调控系统在株系改良上却很少应用。芳香族氨基酸生物合成中，PEP和E4P是合成关键性中间产物DAHP的限制性底 物。因为细胞内的中心代谢途径是互相关联的，许多代谢反应多可能影响这些前体物的生 成。大肠杆菌csrA基因，即碳贮存调控因子A，其编码一个61个氨基酸的小分子蛋白，包含 了一个RNA结合结构域KH的特殊结合蛋白。CsrA的敲除可以增加糖异生和糖原的生物合 成，降低糖酵解。有研究表明，csrA突变株可以比野生菌株在细胞内多聚集20倍的糖原浓 度。CsrA也调控直接参与PEP代谢的三个酶的活性水平正调控丙酮酸激酶(PykF)，负调 控PEP梭化酶(pckA)和PEP合成酶。与此同时，一些非直接影响PEP的酶也被CsrA所调 控。单一基因(csrA)的改变可以使碳代谢流大大的向莽草酸途径转化。因为整体代谢网 络协调多个酶的活性和代谢途径的代谢流，且简单有效又易于操作，在株系改良的遗传操 作上是理想的选择。并且，整体代谢调控因子所调控的反应及代谢途径有可能执行不同的 甚至相反的作用，这就使既增强了理想代谢途径又抑制了竞争代谢途径成为可能。将工程 质粒的改造和工程宿主本身的改造结合起来，既对关键的限速功能酶进行加速反应和高表 达前体物合成相关酶的同时，又通过对整体代谢网络基因的修饰进行多种酶的协调，从而 进一步增强目的产物的表达和积累，实现进一步提高L-苯丙氨酸产率的可能。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于提供一种L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方 法，不仅增强了芳香族氨基酸前体物之一的PEP的积累，而且能够使碳代谢流大量的向莽 草酸途径转化，保证芳香族氨基酸的代谢流较大化的流向L-苯丙氨酸的合成，进一步提高 工程菌发酵L-苯丙氨酸的能力。本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的一种提高L-苯丙氨酸基因工 程菌产酸率的方法，采用PCR技术将L-苯丙氨酸的原始工程质粒MDphe-2构建成新一代工 程质粒MDphe-3 ；并通过Red系统对该工程质粒MDphe_3的工程宿主菌的整体代谢网络调 控基因csrA进行缺失构建；然后将工程质粒MDphe-3植入整体代谢网络调控基因csrA缺 失的工程宿主菌内以构建新的L-苯丙氨酸基因工程菌；最后对该新的L-苯丙氨酸基因工 程菌的遗传稳定性及产酸进行验证。进一步地，该方法包括以下几个步骤步骤一将设计的带有酶有酶切位点的pckA基因采用PCR技术进行扩增；步骤二 将步骤一扩增后所获得的pckA基因进行电泳回收，并对回收的片段采用 T-A克隆法克隆，且将连接后的阳性克隆载体进行连接方向筛选，以获得PMDpckA载体；步骤三通过在PMDpckA载体中融合温控启动子Pl序列及T7强终止子序列，最终 获得pckA基因的完整表达元件；
步骤四将L-苯丙氨酸的原始工程质粒MDphe-2进行序列分析，接着在该工程质 粒MDphe-2的1293bp位点处进行平末端化后再串联插入平末端化后的pckA基因完整表达 元件的平末端，以构建新一代工程质粒MDphe-3 ；步骤五采用Red系统的同源重组功能对工程质粒MDphe-3的工程宿主菌整体代 谢网络调控基因csrA进行缺失；步骤六将工程质粒MDphe-3植入csrA基因缺失的工程宿主菌当中进行表达，以 完成新的L-苯丙氨酸基因工程菌的构建；并对该新的L-苯丙氨酸基因工程菌的遗传稳定 性及产酸进行验证。进一步地，所述步骤三的具体操作如下取PMDpckA载体与PBV220质粒通过酶切 法构建PBVpckA载体，之后取该PBVpckA载体与pET28a质粒通过酶切法构建pETpckA28载 体；然后将该PETpckA28载体作为模板，并设计一对融合PCR的引物；接着把该模板及引物 混合后进行PCR扩增，获得完整的pckA基因表达元件，最后通过T-A克隆法及酶切法验证 所获得的PckA基因表达元件的完整性。进一步地，所述步骤四的具体操作如下(1)完整的pckA基因表达元件及L-苯丙氨酸的原始工程质粒MDphe-2的预处理A.采用PCR技术对完整的pckA基因表达元件进行扩增，扩增过程以载体 pETpckA28为模板，并利用融合PCR引物进行扩增；PCR扩增结束后用Dpn I酶在37°C下处 理lh，消化PCR扩增的模板；最后对目的片段进行电泳回收，回收片段即为完整的pckA基 因表达元件的平末端；B.将L-苯丙氨酸的原始工程质粒MDphe-2进行序列分析，并将该工程质粒 MDphe-2进行单酶切消化反应，反应结束后对其进行电泳回收，回收片段即为含平末端缺口 的MDphe-2核苷酸片段；(2)新一代工程质粒MDphe-3的构建A.将回收的完整的pckA基因表达元件的平末端及含平末端缺口的MDphe-2核苷 酸片段采用连接酶进行连接反应，且该反应于16°C下进行并过夜，反应结束后先在冰中放 置15min后，取10μ 1直接转化成感受态E. coli JM109细胞，并对该感受态E. coli JM109 细胞进行LB+Kana抗性平板筛选，获得阳性克隆菌株；B.取获得的阳性克隆菌株进行质粒抽提，并进行Sty I酶切验证，酶切结束后进 行电泳，电泳结果显示除含完整的pckA基因表达元件的平末端片段外，同时还有另一质粒 片段，即为新一代工程质粒MDphe-3。进一步地，所述步骤五的具体操作如下(1)构建工程质粒MDphe-3的工程宿主菌整体代谢网络调控基因csrA的敲除组 件取pKD13质粒作为模板，并合成一对含有基因csrA的短同源片段序列作为PCR的引物， 接着进行并PCR扩增；PCR扩增结束后，于冰中放置15min后，对扩增产物用Dpn I酶于37°C 下处理lh，酶处理结束后再于冰中放置5min，接着进行电泳回收，并将回收片段进行测序 验证，序列结果显示其与理论相符，即csrA基因的敲除 组件构建成功；(2)将Red系统中编码有Red重组酶的pKD46质粒植入工程宿主菌后，把该工程宿 主菌制备成高效率的电转化感受态细胞；(3)将csrA基因的敲除组件导入(2)中的感受态细胞混勻后进行工程宿主菌的复苏操作，并对其进 行诱导以丢失PKD46质粒；(4)对所述工程宿主菌中csrA基因缺失进行验证及抗性基因的消除。进一步地，所述工程宿主菌为大肠杆菌。本发明一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法的有益效果在于在高效 表达产L-苯丙氨酸关键蛋白的工程质粒MDphe-2的基础上引入pckA基因的完整表达元 件，增强了芳香族氨基酸前体物之一的PEP的积累；同时，利用Red介导的同源重组基因敲 除方法构建csrA基因缺失的工程宿主菌，使碳代谢流大量的向莽草酸途径转化，保证芳香 族氨基酸的代谢流较大化的流向L-苯丙氨酸的合成，进一步提高工程菌发酵L-苯丙氨酸 的能力，从而为工业化生产带来更大的效益。
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。图1是本发明中工程质粒MDphe-3的构建流程图。图2是本发明中工程宿主菌整体代谢网络调控基因csrA缺失的构建流程图。
具体实施方式本发明一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法，其具体包括以下几个步 骤步骤一新一代L-苯丙氨酸工程质粒MDphe-3的构建，具体包括以下构建步骤 (请参阅图1)1.带有酶切位点的pckA基因的PCR扩增根据NCBI公布的完整的pckA基因序列(GenBank NO. EG10688)，设计带有酶切位 点的引物如下，并委托生物工程(上海)有限公司利用DNA合成仪合成pckA-F 5-ATGCGCGTTAACAATGGTTTG-3pckA-R 5-GCTCAGCTTACAGTTTCGGACCAGCC-3其中下游引物带有Esp 1酶切序列，PCR扩增的产物长度为1623bp，最佳退火温度 57. 5°C。PCR扩增反应体系如下IOXEx PCR Buffer (2. 5mM)5 μ 1dNTP Mix (2. 5mM)2. 5 μ 1正向引物(IOuM)2· 5 μ 1反向引物(IOuM)2. 5μ 1DNA 模板2 μ 1Ex Taq DNA Polymerase(51 μ 1
U/μ 1)ddH20 to50 μ 1反应条件如下95 "C5min
94 °C40 sec
57.5°C40 sec30 循环
72 °C1.5 min
72 °CIOmin4 °C保温2. PMDpckA载体的构建构建及验证将PCR扩增获得的带有酶切位点的pckA基因片段进行琼脂糖凝胶电泳回收，回收片段直接与PMD18-T(TAKARA公司)进行T-A克隆，方法参照PMD18-T说明书。连接后的阳 性克隆载体进行连接方向的筛选，取PMD18-T载体引物的上游引物与pckA基因引物的下游 弓丨物作为交叉引物进行阳性克隆的“正向”筛选，PCR体系与条件同上，获得“正向”克隆载 体即为构建的PMDpckA载体，同时将PMDpckA载体转化感受态细胞E. coli JM109，并进行测 序验证，序列分析证实确为pckA基因，确认成功构建PMDpckA载体。3. pckA基因融合带有温控启动子Pl序列及T7强终止子序列的完整表达元件的获 得(l)pBVpckA载体的构建以及验证取PMDpckA载体与pBV220质粒进行相同的EcoR I和Pst I的双酶切，并进行琼 脂糖凝胶电泳回收目的片段与质粒片段。酶切体系(50 μ 1酶切回收体系)如下IOXH buffer5μ 1EcoR I1 μ 1Pst I1 μ 1质粒23 μ 1 (质粒约2 μ g)dd Η20 to50 μ 137°C水浴酶切反应5h后，用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行电泳割胶回收所需 的DNA片段，即pckA基因和pBV220的线性片段；然后将目的片段用T4DNA连接酶进行体外 连接过夜，产物转化感受态细胞E. coli JM109，并挑取克隆提取质粒，进行同样酶切验证， 确认成功构建载体pBVpckA。(2)pETpckA28载体的构建及验证取构建成功的pBVpckA载体与pET28a质粒一起进行Bgl II与Esp I双酶切，并 进行琼脂糖凝胶电泳回收目的片段与质粒片段。酶切体系如下IOXK buffer5μ 10. 1 % BSA5μ 1Bgl II1 μ 1Esp I1 μ 1
质粒23 μ 1 (质粒约2 μ g)dd H20 to50 μ 137°C水浴酶切过夜反应后，用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行电泳割胶回收所 需的DNA片段，即PlpckA基因和pET28a的线性片段；然后将目的片段用T4DNA连接酶进行 体外连接过夜，产物转化感受态细胞E. coli JM109，并挑取克隆提取质粒，进行同样酶切验 证，确认成功构建载体pETpckA28。(3)融合Pl启动子序列及T7终止子序列的pckA基因的PCR扩增及其测序验证设计一对融合PCR的引物，且其两端同时带有酶切位点以便验证，该融合PCR引物 设计如下，并委托生物工程(上海)有限公司利用DNA合成仪合成
PlpckAT7-F :5-CCTAGGAGATCTCTCACCTACCAAACAATG_3PlpckAT7-R :5-CCTAGGATCCGGATATAGTTCCTCCTTTC_3其中CCTAGG为Sty I的酶切识别序列，主要为目的基因插入工程质粒的验证使用。以构建的pETpckA28质粒载体为模板，上述引物为上下游引物进行pckA基因、Pl 启动子以及T7终止子的PCR扩增，反应体系与条件同(2)。PCR扩增的产物经电泳检测，然后利用产物回收试剂盒进行目的片段的回收，检测 到片段大小约为2000bp，即pckA表达元件，将回收后的pckA表达元件与pMDIS-T载体进行 T-A克隆，以获得转化感受态E. coli JM109细胞，筛选阳性克隆子并对含有pckA表达元件 的阳性克隆子进程测序，以验证pckA表达元件是否在PCR扩增以及酶切操作过程中存在突 变或缺失，同时确认融合后的PckA表达元件的完整性。4.构建新一代工程质粒MDphe-3(1)完整的pckA基因表达元件及L-苯丙氨酸的原始工程质粒MDphe-2的预处理完整的pckA基因表达元件的预处理采用PCR技术对完整的pckA基因表达元件 进行扩增，扩增过程以载体pETpckA28为模板，并利用融合PCR引物对PlpckAT7_F/R对该 模板进行扩增；PCR扩增结束后用Dpn I酶在37°C下处理lh，消化PCR扩增的模板，防止模 板质粒的对后续筛选的干扰；最后对目的片段进行琼脂糖凝胶电泳回收，回收片段大小约 为2000bp，即为平末端化后的pckA基因表达元件。L-苯丙氨酸的原始工程质粒MDphe-2的预处理将L-苯丙氨酸的原始工程质粒 MDphe-2进行序列分析，并对质粒MDphe-2进行Nhe I的单酶切消化，Nhe I单酶切体系如 下(50 μ 1酶切回收体系)dd H20 to50 μ 1IOXM buffer5μ 1Nhe I2μ 1 质粒24 μ 1 (约含质粒2ug) 37°C水浴反应6h，反应结束后，65°C水浴终止反应lOmin，然后直接加入6 μ 1的 IOXKlenow Buffer, 2 μ 1 的 dNTP(2. 5mM)和 2μ 1 的 Klenow 大片段，并于 37°C 温度下反应 3h，反应结束后于65°C水浴中进行酶失活处理反应，IOmin后再加入7μ 1的IOXLoading Buffer以终止反应并进行电泳割胶回收；通过0.7%低熔点的琼脂糖电泳回收酶切目的片 段，回收片段即为含平末端缺口的MDphe-2核苷酸片段。
(2)新一代工程质粒MDphe-3的构建及其验证将回收的平末端化后的pckA基因表达元件及含平末端缺口的MDphe-2核苷酸片 段采用T4-DNA连接酶进行连接反应，连接反应体系如下dd H20 to20 μ 110XΤ4 Iig Buffer2μ 1pckA 片段2 μ 1 (约 70ng)线性化载体片段6 μ 1 (约180ng)T4 DNALigase1. 5μ 1且该反应于16°C下进行并过夜，反应结束后先在冰中放置15min后，取10 μ 1直接 转化成感受态Ε. coli JM109细胞，并对该感受态Ε. coli JM109细胞进行LB+Kana抗性平 板筛选，获得阳性克隆菌株。取获得的阳性克隆菌株进行质粒抽提，并进行Sty I酶切验证，酶切结束后进行电 泳，电泳结果显示除含约为2000bp大小的目的片段即完整的pckA基因表达元件的平末端 片段外，同时还有另一质粒片段，即为新一代工程质粒MDphe-3。因为在新一代质粒构建过程中采取的是平末端的连接插入方法，所以目的基因 pckA表达元件在插入至工程质粒MDphe-3中并没有插入方向的选择性，利用载体引物及融 合PCR引物的作为交叉引物进行不同方向的克隆鉴定，鉴定结果显示在连接的过程中确实 产生了目的基因PckA表达元件插入方向不同的质粒，而且不同的插入方向会对整个质粒 的复制与转录表达带来明显影响；通过实验证实，pckA表达元件在工程质粒MDphe-3中的 方向与复制起始序列一致时(称为正向插入)，具有较为良好的表达以及产酸效果；pckA表 达元件方向插入与工程质粒MDphe-3的复制起始序列相反时，会影响工程质粒的功能基因 在宿主中的表达，且产酸较低，但具体的影响机制并不明确。步骤二 采用Red系统的同源重组功能对工程质粒MDphe-3的工程宿主菌整体代 谢网络调控基因csrA进行缺失(请参阅图2)以大肠杆菌为工程质粒MDphe-3的工程宿主菌，则基因csrA为大肠杆菌的整体代 谢网络调控系统csr的效应因子A。1. csrA基因的敲除组件的构建根据NCBI公布大肠杆菌的基因组序列，合成的一对含有基因csrA的短同源片段 序列的引物上游序列39bp的同源序列，下游37bp的同源序列，并委托生物工程(上海) 有限公司利用DNA合成仪合成P13csrA-F :5_TTTGAGGGTGCGTCTCACCGATAAAGATGAGACGCGGAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3P13csrA-R :5_ATACAGAGAGACCCGACTCTTTTAATCTTTCAAGGAGCTGTCAAACATGAGAATTAA-3
其中划线部分序列为模板质粒pKD13带有FRT设别位点的抗性基因片段的PCR引 物部分。以pKD13质粒为模板，上述引物(P13csrA-F/R)为引物对进行PCR扩增，扩增反应 体系(50 μ 1体系)如下IOXpfu PCR Buffer(2. 5mM)5μ 1
dNTP Mix (2. 5mM)2. 5 μ 1Pl (IOuM)2. 5μ 1P2 (IOuM)2. 5 μ 1DNA 模板2μ1
pfu DNA Polymerase (5U/μ 1)1 μ 1ddH20 to50 μ 1反应条件如下95 °C5min
权利要求
1.一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法，其特征在于采用PCR技术将L-苯 丙氨酸的原始工程质粒MDphe-2构建成新一代工程质粒MDphe-3 ；并通过Red系统对该工 程质粒MDphe-3的工程宿主菌的整体代谢网络调控基因csrA进行缺失构建；然后将工程质 粒MDphe-3植入整体代谢网络调控基因csrA缺失的工程宿主菌内以构建新的L-苯丙氨酸 基因工程菌；最后对该新的L-苯丙氨酸基因工程菌的遗传稳定性及产酸进行验证。
2.如权利要求1所述一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法，其特征在于包 括以下几个步骤步骤一将设计的带有酶切位点的PckA基因采用PCR技术进行扩增；步骤二 将步骤一扩增后所获得的PckA基因进行电泳回收，并对回收的片段采用T-A 克隆法克隆，且将连接后的阳性克隆载体进行连接方向筛选，以获得PMDpckA载体；步骤三通过在PMDpckA载体中融合温控启动子Pl序列及T7强终止子序列，最终获得 pckA基因的完整表达元件；步骤四将L-苯丙氨酸的原始工程质粒MDphe-2进行序列分析，接着在该工程质粒 MDphe-2的1293bp位点处进行平末端化后再串联插入平末端化后的pckA基因完整表达元 件，以构建新一代工程质粒MDphe-3 ；步骤五采用Red系统的同源重组功能对工程质粒MDphe-3的工程宿主菌整体代谢网 络调控基因csrA进行缺失；步骤六将工程质粒MDphe-3植入csrA基因缺失的工程宿主菌当中进行表达，以完成 新的L-苯丙氨酸基因工程菌的构建；并对该新的L-苯丙氨酸基因工程菌的遗传稳定性及 产酸进行验证。
3.如权利要求2所述一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法，其特征在于所 述步骤三的具体操作如下取PMDpckA载体与PBV220质粒通过酶切法构建PBVpckA载体，之后取该PBVpckA载体 与pET28a质粒通过酶切法构建pETpckA^载体；然后将该pETpckA^载体作为模板，并设 计一对融合PCR的引物；接着把该模板及引物混合后进行PCR扩增，获得完整的pckA基因 表达元件，最后通过T-A克隆法及酶切法验证所获得的pckA基因表达元件的完整性。
4.如权利要求2所述一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法，其特征在于所 述步骤四的具体操作如下(1)完整的PckA基因表达元件及L-苯丙氨酸的原始工程质粒MDphe-2的预处理A.采用PCR技术对完整的pckA基因表达元件进行扩增，扩增过程以载体pETpckA^ 为模板，并利用融合PCR引物进行扩增；PCR扩增结束后用Dpn I酶在37°C下处理lh，消化 PCR扩增的模板；最后对目的片段进行电泳回收，回收片段即为平末端的完整的pckA基因 表达元件；B.将L-苯丙氨酸的原始工程质粒MDphe-2进行序列分析，并将该工程质粒MDphe-2进 行单酶切消化反应，反应结束后对其进行电泳回收，以及平末端化处理，回收片段即为平末 端缺口 MDphe-2核苷酸片段；(2)新一代工程质粒MDphe-3的构建A.将回收的完整的pckA基因表达元件的平末端及含平末端缺口的MDphe-2核苷酸 片段采用连接酶进行连接反应，且该反应于16°C下进行并过夜，反应结束后先在冰中放置15min后，取10 μ 1直接转化成感受态Ε. coliJM109细胞，并对该感受态Ε. coli JM109细胞 进行LB+Kana抗性平板筛选，获得阳性克隆菌株；B.取获得的阳性克隆菌株进行质粒抽提，并进行Sty I酶切验证，酶切结束后进行电 泳，电泳结果显示除含完整的PckA基因表达元件的平末端片段外，同时还有另一质粒片 段，即为新一代工程质粒MDphe-3。
5.如权利要求2所述一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法，其特征在于所 述步骤五的具体操作如下(1)构建工程质粒MDphe-3的工程宿主菌整体代谢网络调控基因csrA的敲除组件取 PKD13质粒作为模板，并合成一对含有基因csrA的短同源片段序列作为PCR的引物，接着 进行PCR扩增；PCR扩增结束后，于冰中放置15min后，对扩增产物用Dpn I酶于37°C下处 理lh，酶处理结束后再于冰中放置5min，接着进行电泳回收，并将回收片段进行测序验证， 序列结果显示其与理论相符，即csrA基因的敲除组件构建成功；(2)将Red系统中编码有Red重组酶的pKD46质粒植入工程宿主菌后，把该工程宿主菌 制备成高效率的电转化感受态细胞；(3)将csrA基因的敲除组件导入(2)中的感受态细胞混勻后进行工程宿主菌的复苏操 作，并对其进行诱导以丢失PKD46质粒；(4)对所述工程宿主菌中csrA基因缺失进行验证及抗性基因的消除。
6.如权利要求1所述一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法，其特征在于所 述工程宿主菌为大肠杆菌。
全文摘要
本发明涉及一种提高L-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法，采用PCR技术将L-苯丙氨酸的原始工程质粒MDphe-2构建成新一代工程质粒MDphe-3；并通过Red系统对该工程质粒MDphe-3的工程宿主菌的整体代谢网络调控基因csrA进行缺失构建；然后将工程质粒MDphe-3植入整体代谢网络调控基因csrA缺失的工程宿主菌内以构建新的L-苯丙氨酸基因工程菌；最后验证并保留具高遗传稳定性及高产酸率的L-苯丙氨酸基因工程菌。本发明的优点在于增强了芳香族氨基酸前体物之一的PEP的积累，同时能够使碳代谢流大量的向莽草酸途径转化，保证芳香族氨基酸的代谢流较大化的流向L-苯丙氨酸的合成，进一步提高工程菌发酵L-苯丙氨酸的能力。
文档编号C12N1/21GK102041284SQ20101053467
公开日2011年5月4日 申请日期2010年11月5日 优先权日2010年11月5日
发明者吴伟斌, 吴松刚, 施巧琴, 施碧红, 蔡爱金, 陈炳生, 黄祥峰, 黄钦耿 申请人:福建省麦丹生物集团有限公司 被以下专利引用 (1),