专利名称：一种产共轭亚油酸微生物发酵剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种产共轭亚油酸微生物发酵剂及其制备方法，具体涉及一种发酵亚油酸制备共轭亚油酸的发酵剂及其制备方法，属生物工程领域。
背景技术：
共轭亚油酸(conjugated linoleic acid, CLA)是一类含有顺式或反式共轭双键的十八碳二烯酸，是近年人类发现的最重要的功能性油脂酸之一。CLA具有抗癌、减肥、抗动脉粥样硬化、防治糖尿病、调节血脂、增强机体免疫能力和促进生长等多种生理活性。c9， til CLA和tlO，cl2CLA是最具生理活性。然而，CLA的来源十分局限，仅在反刍动物的乳和肉产品中存在，而非反刍动物产品中含量极低。目前，工业化生产的CLA产物是多种异构体的混合物，选择性差，质量难以保证， 而且安全性受到质疑。但利用微生物转化法生产CLA反应条件温和，异构体组成较单一，利于产品的开发应用。人们将获得CLA的注意力更多地转向了可食用的微生物，特别是能转化生成CLA的乳酸菌发酵剂。因此，生物转化法生成CLA已成为研究热点。本发明采用植物乳杆菌为出发菌株，经逐级递增浓度亚油酸富集培养、驯化，获得共轭亚油酸高转化率菌株，制备一种产共轭亚油酸微生物发酵剂。本发明方法制备的发酵剂为兼性厌氧菌，易培养，无毒，可食用，因此本产品具有较高的实用价值和应用前景。
发明内容
本发明目的在于提供一种产共轭亚油酸微生物发酵剂及其制备方法。本发明的目的是这样实现的本发明中所涉及的百分比除另有注明之外为重量比，本发明的产品采用这样的方法来制备的1.发酵菌株的选择及培养基的制备本发明选用植物乳杆菌CICC23138，购于中国工业微生物菌种保藏中心。植物乳杆菌基础培养基为蛋白胨10. 0g、牛肉提取物10. 0g、酵母提取物5. 0g、葡萄糖20. 0g、无水乙酸钠5. 0g、柠檬酸三胺2. 0g, Tween-801. OmL、磷酸氢二钾2. 0g、硫酸镁 0. 02g、硫酸锰 0. 05g、蒸馏水 1. 0L, ρΗ6· 0 6. 5，121°C灭菌 20min。2.发酵剂的制备过程2.1出发菌株活化分别量取0. 9%的生理盐水IOml试管内，经121°C灭菌20分钟冷却至30°C，将植物乳杆菌CICC23138安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0. 9%的生理盐水中，震荡使其溶解，在30°C恒温箱中静止活化30分钟，备用。2. 2植物乳杆菌CICC23138驯化量取植物乳杆菌基础培养基100ml于250ml三角瓶内，然后按基础培养基体积的 0. 添加亚油酸，121°C灭菌20分钟冷却至37°C，按基础培养基体积的5%接种2. 1步骤中已经活化的菌种，在37°C厌氧箱内静止培养30小时，作为一级驯化菌株；然后量取植物乳杆菌基础培养基IOOml于250ml三角瓶内，按基础培养基体积的0. 2%添加亚油酸，121 °C 灭菌20分钟冷却至37°C，按基础培养基体积的5%接种一级驯化菌株，在37°C厌氧箱内静止培养30小时，作为二级驯化菌株；以此类推，以上一级驯化菌株为种子，接种量按基础培养基体积的5%，进行逐级驯化，进行每一级驯化时，基础培养基中的亚油酸添加量按基础培养基体积的0. 1 %的剂量递增，直至七级驯化，基础培养基中的亚油酸添加量达0. 7 %， 结束七级驯化后获得七级驯化菌株。2. 3生产发酵剂的制备首先配置10%的脱脂奶乳浊液，向脱脂乳中加入2%的液态甘油、2%低聚木糖、 2%葡萄糖，121°C灭菌20分钟冷却至37 °C，分别按2%体积比例接种七级驯化菌株，37°C厌氧培养30——36小时，检测生产发酵剂活菌数，活菌数> 101°个/ml，视同为发酵成熟，如果活菌数< 1010个/ml，继续培养，直至达到101°个/ml。2. 4发酵剂粉末冻干菌剂的制备将成熟的生产发酵剂在无菌条件下导入玻璃安瓶中，液面高度低于1cm，加盖瓶塞后放入-30°C冰柜速冻，冻结后将玻璃安瓶用托盘乘装，放入冻干机进行冷冻干燥，制成发酵剂粉末冻干菌剂。3.应用效果下面通过具体实验来证明本发明专利的应用效果采用植物乳杆菌CICC23138作为对照，培养基采用植物乳杆菌基础培养基添加不同浓度的亚油酸，厌氧发酵30小时后，通过紫外分光光度计检测培养基中共轭亚油酸含量，结果如表3-1。表3-1本发明产品的应用效果
发酵菌种接种量(g/100mL基亚油酸底物浓度共轭亚油酸检测转化率作)础培养基)(g/L)浓度(g/L)CICC231380.11.50.4630.7本发明产品0. 11. 51. 2885.3CICC231380.32.50. 3212.8本发明产品0.32. 52. 3594.0CICC231380.53. 50.154.3本发明产品0.53.52.2664.6本发明产品与CICC23138相比，共轭亚油酸的转化率大幅度提高，当亚油酸底物浓度2. 5g/L时，本发明产品转化率高达94%，因亚油酸对发酵菌种具有一定的抑制作用， 故对照菌株CICC23138的转化能力随亚油酸底物浓度的增高而降低，当亚油酸底物浓度超过3. 5g/L时，对本发明产品的菌株活力也有一定的抑制作用，最适底物浓度为2. 5g/L。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作更详细的描述
本发明的产品采用这样的方法来制备的1.发酵菌株的选择及培养基的制备本发明选用植物乳杆菌CICC23138，购于中国工业微生物菌种保藏中心。植物乳杆菌基础培养基为蛋白胨10. 0g、牛肉提取物10. 0g、酵母提取物5. 0g、葡萄糖20. 0g、无水乙酸钠5. 0g、柠檬酸三胺2. 0g, Tween-801. OmL、磷酸氢二钾2. 0g、硫酸镁 0. 02g、硫酸锰 0. 05g、蒸馏水 1. 0L, ρΗ6· 0 6. 5，121°C灭菌 20min。2.发酵剂的制备过程2. 1出发菌株活化分别量取0. 9%的生理盐水IOml试管内，经121°C灭菌20分钟冷却至30°C，将植物乳杆菌CICC23138安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0. 9%的生理盐水中，震荡使其溶解，在30°C恒温箱中静止活化30分钟，备用。2. 2植物乳杆菌CICC23138驯化量取植物乳杆菌基础培养基100ml于250ml三角瓶内，然后按基础培养基体积的 0. 添加亚油酸，121°C灭菌20分钟冷却至37°C，按基础培养基体积的5%接种2. 1步骤中已经活化的菌种，在37°C厌氧箱内静止培养30小时，作为一级驯化菌株；然后量取植物乳杆菌基础培养基100ml于250ml三角瓶内，按基础培养基体积的0. 2%添加亚油酸，121°C 灭菌20分钟冷却至37°C，按基础培养基体积的5%接种一级驯化菌株，在37°C厌氧箱内静止培养30小时，作为二级驯化菌株；以此类推，以上一级驯化菌株为种子，接种量按基础培养基体积的5 %，进行逐级驯化，进行每一级驯化时，基础培养基中的亚油酸添加量按基础培养基体积的0. 1 %的剂量递增，直至七级驯化，基础培养基中的亚油酸添加量达0. 7 %， 结束七级驯化后获得七级驯化菌株。2. 3生产发酵剂的制备首先配置10%的脱脂奶乳浊液，向脱脂乳中加入2%的液态甘油、2%低聚木糖、 2%葡萄糖，121°C灭菌20分钟冷却至37 °C，分别按2%体积比例接种七级驯化菌株，37°C厌氧培养30——36小时，检测生产发酵剂活菌数，活菌数> 101°个/ml，视同为发酵成熟，如果活菌数< 101°个/ml，继续培养，直至达到101°个/ml。2. 4发酵剂粉末冻干菌剂的制备将成熟的生产发酵剂在无菌条件下导入玻璃安瓶中，液面高度低于lcm，加盖瓶塞后放入-30°C冰柜速冻，冻结后将玻璃安瓶用托盘乘装，放入冻干机进行冷冻干燥，制成发酵剂粉末冻干菌剂。
权利要求
1. 一种产共轭亚油酸微生物发酵剂及其制备方法，其特征是1)以植物乳杆菌CICC23138为出发菌株，量取0.9 %的生理盐水IOml试管内，经121 °C 灭菌20分钟冷却至30°C，将植物乳杆菌CICC23138安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0. 9%的生理盐水中，震荡使其溶解，在30°C恒温箱中静止活化30分钟，备用；2)量取植物乳杆菌基础培养基IOOml于250ml三角瓶内，然后按基础培养基体积的 0. 添加亚油酸，121°C灭菌20分钟冷却至37°C，按基础培养基体积的5%接种1)步骤中已经活化的菌种，在37°C厌氧箱内静止培养30小时，作为一级驯化菌株；然后量取植物乳杆菌基础培养基IOOml于250ml三角瓶内，按基础培养基体积的0. 2%添加亚油酸，121 °C灭菌20分钟冷却至37°C，按基础培养基体积的5%接种一级驯化菌株，在37°C厌氧箱内静止培养30小时，作为二级驯化菌株；以此类推，以上一级驯化菌株为种子，接种量按基础培养基体积的5 %，进行逐级驯化，进行每一级驯化时，基础培养基中的亚油酸添加量按基础培养基体积的0. 1 %的剂量递增，直至七级驯化，基础培养基中的亚油酸添加量达0. 7 %，结束七级驯化后获得七级驯化菌株；3)配置10%的脱脂奶乳浊液，向脱脂乳中加入2%的液态甘油、2%低聚木糖、2%葡萄糖，121°C灭菌20分钟冷却至37°C，分别按2%体积比例接种七级驯化菌株，37°C厌氧培养 30——36小时，检测生产发酵剂活菌数，活菌数> 101°个/ml，视同为发酵成熟，如果活菌数 < IOltl个/ml，继续培养，直至达到101°个/ml ；4)将成熟的生产发酵剂在无菌条件下导入玻璃安瓶中，液面高度低于1cm，加盖瓶塞后放入-30°C冰柜速冻，冻结后将玻璃安瓶用托盘乘装，放入冻干机进行冷冻干燥，制成发酵剂粉末冻干菌剂。
全文摘要
本发明提供了一种产共轭亚油酸微生物发酵剂及其制备方法，以植物乳杆菌CICC23138为出发菌株，0.9％的生理盐水活化后备用；按植物乳杆菌基础培养基的0.1％添加亚油酸，5％接种活化菌种，在37℃厌氧箱内静止培养30小时，作为一级驯化菌株；然后按植物乳杆菌基础培养基的0.2％添加亚油酸，5％接种一级驯化菌株，在37℃厌氧箱内静止培养30小时，作为二级驯化菌株；以此类推，以上一级驯化菌株为种子，进行逐级驯化，进行每一级驯化时，亚油酸添加量按0.1％的剂量递增，直至七级驯化后获得七级驯化菌株；脱脂乳中培养七级驯化菌株，活菌数≥1010个/ml为发酵成熟；将成熟的发酵菌种冷冻干燥制成发酵剂粉末。
文档编号C12R1/25GK102229904SQ20111015164
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月8日 优先权日2011年6月8日
发明者于微, 侯俊财, 刘艳平, 王玉堂, 王芳, 肖志刚 申请人:东北农业大学