专利名称：一种新型、有效的启动子探针构建及在产酶溶杆菌组成型强启动子克隆中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种新型、有效的启动子探针构建及在产酶溶杆菌组成型强启动子PB500克隆中的应用。
背景技术：
产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)是溶杆菌属(Lysobacter)的模式种，属于黄单胞科(Xanthomonadaceae),该菌菌落黏性、黄色、富含G+C%、有滑行能力，能产生蛋白酶、几丁质酶、β -I, 3-葡聚糖酶，纤维素酶等多种胞外酶,对真菌、卵菌和线虫等多种植物病原物都有很好的拮抗活性。目前，仅有4株产酶溶杆菌菌株(3. 1Τ8、Ν4-7、C3和0Η11)被报道应用于植物真菌或卵菌病害的生物防治。菌株3. 18Τ对植物病原真菌及多种腐霉菌都表现出·强烈的抑制作用；菌株Ν4-7能有效防治由Magnaporthe poae引起的草皮草叶斑病；C3菌株能防治草坪草褐斑病(病原为Rhizoctonia solani)、酥油草叶斑病(病原为Bipolaris sorokiniana)以及菜豆镑病(病原为 Uromycesappendiculatus)。此外，0zlem&Yuen(2003)曾报道，C3菌株具有诱导草坪草对褐斑病菌的抗性。OHll菌株分离于辣椒根际土壤，是国内首次报道的一株生防细菌菌株。该菌株对水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)、黄瓜腐霉(Pythiumultimum)、辣椒疫霉(phytophthora capsici)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、小麦赤霉病菌(Fusarum solani)、南方根结线虫(Meloidogyneincognita)等多种植物病原物均具有强烈的拮抗活性。在温室盆栽试验中，OHll对辣椒疫病防治效果达到了 83. 6%。然而，到目前为止，仍未见产酶溶杆菌防治植物细菌病害的报道。细菌的QS (Quorum sensing)系统是细菌通过分泌可溶性信号分子(autoinducer, Al)来监测群体密度并调控细菌生物功能的信息交流机制。当种群密度达到一定阈值时，细菌通过细胞内受体感知Al的存在，随着种群密度的增加，环境中积累的Al信号分子的浓度也成比例地增高，当达到一定阈值水平时细菌作出反应，对这些信号分子进行检测，在群体范围内调控一系列相关基因的表达。研究表明，大多数革兰氏阴性细菌利用酰基高丝氨酸内酯(AHL)类信号分子来调控细菌的多种生理生化功能，包括细菌毒性、接合、色素的形成、抗生素的产生和生物膜的形成。已有大量数据表明，多数革兰氏阴性植物病原细菌均利用AHL类信号分子来调控自身在寄主植物上的致病性。这些细菌包括大白菜软腐病菌(Pectobacteriumcarotovorum subsp. carotovorum)、西瓜果斑病菌(Acidovoraxavenae subsp. citrulli)、菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)、梨火疫病菌(Eamylovora)、玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp. stewartii)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)等，在这些植物病原细菌中，敲除AHL类信号分子的编码基因即IuxI的同系物，所构建的突变株丧失或者显著降低AHL的产生能力，使病菌丧失或显著降低在寄主植物上的致病性。因此，通过干扰或破坏植物病原细菌的QS系统即群体淬灭(Quorum quenching, QQ),降低病原细菌在寄主植物上致病性，可以作为防治植物细菌病害的一种新机制。细菌的群体淬灭是指干扰或者破坏细菌QS的过程。目前，细菌QQ机制中研究最为深入的是酶解机制，即利用相关酶类来降解细菌QS信号分子，起到干扰或破坏细菌QS的目的。在现有报道的降解酶中，研究最为透彻的是AiiA蛋白。该蛋白最早分离于Bacillussp. 24菌株，能够降解不同碳链分子的AHL类信号分子。将外源的aiiA基因转入软腐病菌(Pectobacterium carotovorum)能显著降低该菌在大白菜和马铃薯上的致病性。转aiiA基因的大白菜和马铃薯能大幅度提高对软腐病菌的抗性。此外，转aiiA的生防细菌，如荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、伯克氏菌 KJ006 (Burkholderia sp. KJ006),均能大幅度降低软腐病菌在寄主植物上的致病性。尽管产酶溶杆菌对植物真菌和卵菌病害具有较好的防治效果，但对植物细菌病害防效低或没有防治效果，这极大地限制了产酶溶杆菌的生防范围，对其生防菌剂的产业化生产和田间应用也具有一定的阻碍作用。为拓宽产酶溶杆菌的生防范围，使其对植物细菌病害也具有较好的防治效果，在前期的工作中，我们利用大肠杆菌的Ipp启动子和广宿主 载体pBBRl-MCS5，构建了基于质粒的表达系统，实现了外源基因aiiA在产酶溶杆菌中的重组表达。重组表达的产酶溶杆菌对大白菜软腐病菌、西瓜细菌性果斑病等细菌病害具有了较好的防治效果，表明遗传改良可以实现产酶溶杆菌对植物细菌病害的防治。然而，含有外源质粒的工程菌株，因为质粒上往往含有抗生素编码基因，导致这类工程菌株在田间应用存在一定的风险，如抗性基因可能会水平转移，也可能会破坏土壤或植物根围的微生物群落组成。针对这种情况，替代的方案是将外源优良基因整合到生防细菌的染色体上，构建出无抗生素标记的工程菌株。为构建出无抗生素标记的、并能有效防治植物细菌病害的产酶溶杆菌工程菌株，我们在前期工作中将融合基因Plpp_aiiA定向整合到菌株OHll的16SrDNA后，发现外源基因aiiA的表达量显著下降，在染色体上重组表达的AiiA蛋白无法有效降解植物病害细菌产生的信号分子，故无法破坏细菌的群体感应系统，导致生防效果较低。这一结果表明 位于染色体上的外源基因aiiA基因不能在Plpp启动子的带动下得到高效表达。因此，为了实现外源基因aiiA在产酶溶杆菌染色体上的高效表达，必须使用其他具有更高活性的启动子来代替Plpp。
发明内容
I、本发明的目的是以IacZ为报告基因，构建出一个新型、有效的克隆细菌启动子的探针。2、利用本发明构建的启动子探针，从产酶溶杆菌OHll菌株的启动子文库中克隆出组成型表达的强启动子PB500。3、利用该启动子实现外源基因aiiA在OHll菌株中的高效表达。4、有益效果本发明提供的新型启动子探针是基于IacZ为报告基因的一个广宿主载体，具有操作简便、经济的特点，能从不同种类的细菌(如植物病原细菌、动物病原细菌和环境相关细菌等)中克隆启动子，可以作为克隆启动子的一个通用、有效工具。另外，本发明提供的强启动PB500是来源于产酶溶杆菌本身，更适合于在染色体上启动表达外源基因，为后续通过遗传改良构建无抗生素标记、多功能的产酶溶杆菌工程菌株奠定了坚实的基础。
图I :重组载体pBBRLACZF和pBBRLACZR的双酶切验证。图2 pBBRLACZF和pBBRLACZR的质粒图谱及其转化菌株对5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)的降解。图3 :产酶溶杆菌OHll菌株的启动子文库构建。图4 :启动子阳性克隆对X-gal的降解效果。图5 :转化pBBRLACZRl和pBBRLACZR2的OHll菌株对X-gal的降解效果。图6 pBBRLACZRl中外源插入片段的启动子功能域预测。·图7 :启动子功能片段PB500的序列分析。图8 PB500 的 PCR 扩增图9 PB500与pBBRLACZR连接转化大肠杆菌菌株Top 10后对Χ-gal的降解效果。图10 :转化pBBRLACRII的OHll菌落在LB平板(含Χ-gal)的表型
具体实施例方式以下通过具体实施对本发明作进一步阐述，但不限制本发明实施例I :一种新型、有效的克隆细菌启动子的探针构建I材料和方法I. I试验材料本试验所用的大肠杆菌菌株ToplO购置大连宝生物公司(TaKaRa)，SMlO λ pir和DH5a λ pir菌株由南京农业大学生命科学学院朱军教授惠赠。产酶溶杆菌由发明人分离并保存。载体PJZ352和pBBRl-MCS5由南京农业大学生命科学学院朱军教授惠赠。大肠杆菌菌株的培养使用LB培养基，培养温度为37°C，液体培养的转速为225rpm/min。产酶溶杆菌的培养使用LB培养基，培养温度为30°C，液体培养的转速为225rpm/min。抗生素庆大霉素(Gm)、5-溴-4-氯-3- Π引哚-β -D-半乳糖苷(X_gal)均购置南京助研生物公司。I. 2无自身启动子的IacZ基因的PCR扩增设计引物IacZ-Fl AAGGATTCATGACCATGATTACGGATTC (下划线为酶切位点 BamHI)；lacZ-F2 AAGCTTTTATTTTTGACACCAGACCA (下划线为酶切位点 HindIII)，以载体 pJZ352为模板，PCR扩增无启动子的IacZ基因(3075bp)，命名为lacZF。同时，另外设计引物 IacZ-Rl AAAAGCTTATGACCATGATTACGGATTC(下划线为酶切位点 HindIII) ；lacZ-R2 TTATTTTTGACACCAGACCA (下划线为酶切位点BamHI)，以载体pJZ352为模板，PCR扩增无自身启动子的IacZ基因，命名为lacZR。1.3启动子探针的构建将lacZF、lacZR、pBBRl_MCS5分别用BamHI和HindIII进行双酶切。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化。之后，将IacZF与pBBRl_MCS5于14°C酶连过夜，并转化大肠杆菌DH5a新鲜感受态细胞，涂布含有100 μ g/mL X-gal和25 μ g/mL Gm的LA平板上,检验IacZ基因表达产物(β _半乳糖苷酶)对X_gal的降解活性(若降解则菌落变蓝，否则菌落不改变自身颜色)。选取蓝色菌落，液体培养后提取重组质粒，用BamHI和HindIII进行双酶切验证是否有外源片段插入，以便确认菌落显蓝是否是由于无自身启动子的IacZ基因在载体中Pla。启动子的带动下成功表达，确认IacZF是一个无自身启动子的完整基因。降解活性确认后，将IacZR按照同样的方法克隆于PBBR1-MCS5中，检测阳性克隆对X-gal的降解情况(菌落是否变蓝)。选取白色菌落，提取重组质粒，用BamHI和HindIII进行双酶切验证是否有外源片段插入。最后，含有IacZR的pBBRl_MCS5载体即是以IacZ为报告基因的启动子探针，命名为pBBRLACZR。2结果显示利用引物lacZ-Fl/lacZ_F2 ;lacZ-Rl/lacZ_R2，通过PCR反应，成功扩增出无自身启动子的IacZF和IacZR基因，其PCR大小片段为3075bp。通过BamHI和HindIII双酶切后，分别将IacZF和IacZR与同样酶切的pBBRl_MCS5连接，转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，构建重组载体pBBRLACZF和pBBRLACZR。如图I所示，当用BamHI和HindIII双酶切 重组pBBRLACZF和pBBRLACZR后，均能酶切出两条DNA条带，其中大片段(约5kb)，与质粒PBBR1-MCS5的骨架区(4768bp)大小相符；小片段(约3kb)与IacZ基因(3075bp)大小相符，表明重组载体pBBRLACZF和pBBRLACZR构建成功。另外，在pBBRLACZF的质粒图谱中(图
2)可以发现IacZ基因的转录方向与Pla。启动子的转录方向一致，因此Pla。可以启动IacZ的表达，使得转化有pBBRLCZF的ToplO菌落呈蓝色，这一结果确认了 PCR扩增的IacZ基因是一个无自身启动子的完整基因。再此基础上，构建重组载体PBBRLACR。在其质粒图谱中(图2)，IacZ的转录方向与Pla。相反，因此，Pla。无法启动IacZ的表达，使转化pBBRLACZR的ToplO菌落呈白色，进一步说明无自身启动子的IacZ在无外源启动子的带动下无法表达。然而，一旦启动子功能的外源DNA片段插入到BamHI处，并且转录方向与IacZ —致，就能激活IacZ表达，导致转化子在X-gal平板上显蓝。根据这一特点，将pBBRLACZR作为启动子探针，从OHll的启动子文库中筛选组成型强启动子。实施例2 :构建的启动子探针在产酶溶杆菌组成型启动子克隆中的应用I材料和方法I. I试验材料同实施例I中的材料。I. 2产酶溶杆菌OHll菌株DNA启动子文库的构建及启动子克隆建立产酶溶杆菌OHll基因组DNA的Sau3AI酶切反应体系，控制酶量，使酶切片断集中在100-2000bp之间。将部分酶切片断抽提纯化沉淀后与经同尾酶BamHI酶切的脱磷探针酶连过夜后转化大肠杆菌DH5a新鲜感受态细胞，涂布含有100 μ g/mL X-gal和25 μ g/mL Gm的LB平板筛选转化子。挑取在选择性平板上的蓝色菌落，液体培养后，提取重组载体(命名为pBBRLACRI)，转化产酶溶杆菌OHll菌株(转化方法参照研究内容第一章)，以验证转化有重组载体的OHll菌落在LA平板(100 μ g/mL X-gal和200 μ g/mL Gm)上是否显蓝，并测定β_半乳糖苷酶活性(测定方法参照研究内容第二章I. 2.9小节)，进一步验证克隆启动子的有效性。之后，用EcoRI和HindIII双酶切重组载体pBBRLACRI，明确启动子探针中外源插入的DNA片段的大小。I. 3启动子片段的测序和分析
在IacZ 基因 5’ 端设计引物 CXIacZ-(5，-GGGTTTTCCCAGTCACG-3’ )对 pBBRLACRI
进行测序。测序序列通过以下在线分析网站进行阳性克隆载体中插入启动子片段的功能区域分析http://www.ncbi. nlm. nih. gov在线查询及核酸序列集成的数据库系统。http://www. fruitfly. org 在线启动子预测分析网站(Promoter Prediction-Μ.Reese)。I. 4启动子的亚克隆根据启动子功能域的预测结果，设计引物BamPBLAC. I (5，-CCGGATCCTGCGAGACAACTITITTCCG-3’)和BamPBLAC-2 (AAGGATCCGGATCGAATATTCCTGGTTT-3’),扩增包括启动子功能域的DNA片段(681bp)，命名为PB500。这里，下划线为酶切位点BamHI。获得PB500后，用BamHl分别酶切PB500和pBBRLACZR，纯化回收后进行酶连，转化ToplO感受态细胞，在·100 μ g/mL X-gal和20 μ g/mL Gm的平板上筛选蓝色菌落，以便验证扩增的PB500是否具有启动子的功能。同时，利用引物BamPBLAC-1/BamPBLAC-2对蓝色菌落进行PCR验证，以验证蓝色菌落中是否外源片段插入。最后，提取蓝色ToplO菌落中的重组载体，转化产酶溶杆菌OHll菌株,在100 μ g/mL X-gal和200 μ g/mL Gm的平板上筛选蓝色菌落，以验证PB500能否在OHll中有效识别并组成型表达。2、结果显示成功构建了产酶溶杆菌OHll的DNA启动子文库(图3)。将这些启动子文库克隆到构建的启动子探针上，从3025个转化子中筛选获得2个具有水解X-gal的阳性克隆(菌落蓝色；图4)，表明在这两个阳性克隆中，载体pBBRlLCR的BamHI位点插入了一段含启动子功能，并与IacZ转录方向一致的DNA片段。将这两个阳性克隆中的载体导入产酶溶杆菌OHll菌株，发现OHll菌株在X-gal和Gm的LB平板上菌落呈现明显的蓝色(图5)，表明这两个阳性克隆中插入的外源片段(即OHll的启动子)中包含可以在OHll中有效启动IacZ表达的启动子片段。对插入片段进行测序，发现在所获得序列中，具有5个启动子功能域，并且预测分值在O. 89-0. 97之间(图6 ;图7)。进一步PCR克隆含有5个启动子功能域的最小DNA片段，命名为PB500(700bp)(图8)，并再次克隆到启动子探针中，发现其仍具有启动子活性(即转化子能降解X-gal，菌落呈蓝色)(图9)。将含有PB500的载体导入OHll菌株，发现转化后的菌落均能在X-gal的LB平板上显蓝(图10)，表明PB500是一个DNA序列较小、在OHll中组成型表达的启动子。
权利要求
1.一种新型、有效的克隆细菌启动子探针的构建。
2.编码权利要求I所述的探针在产酶溶杆菌组成型启动子克隆中的应用。
3.含有权利要求2所述的产酶溶杆菌组成型强启动子PB500的核酸序列及特点。
全文摘要
本发明涉及一种新型、有效的克隆细菌启动子的探针构建，同时涉及该探针在产酶溶杆菌组成型启动子克隆中的应用，属于微生物基因工程领域。本发明提供的产酶溶杆菌组成型强启动子PB500，核苷酸序列681bp，预测具有5个启动子功能域，能在产酶溶杆菌中高强度启动外源基因lacZ的表达。
文档编号C12N15/74GK102925474SQ20121048924
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月27日 优先权日2012年11月27日
发明者刘凤权, 钱国良 申请人:南京农业大学