专利名称：一种分子量内标的制备方法及用该方法制备的分子量内标的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种分子量内标及其制备方法。
背景技术：
人类基因组计划开始以来，基因扫描和基因分型技术发展迅速。在致病基因筛查，疾病基因连锁和关联分型，肿瘤等疾病早期诊断、法医学个体识别等方面都广泛应用。基因分型技术重要的手段就是利用DNA测序仪或遗传分析仪分析基因片段的分子量。这类仪器分析分子量时需要一个分子量标准来对样品进行计算，也就是分子量内标，又称为分子量内对照(Internal Lane Standard)。
跟传统的分子量标准(marker)相比，分子量内标属于内对照，而传统的分子量标准属于外对照，内对照与待测样品在同一泳道电泳，二者运动规律完全一致，因此校对结果更加准确。另外，分子量内标的精确度更高，传统分子量标准的电泳介质往往是琼脂糖凝胶和分辨率较低的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)，分辨率在几十个bp左右，而分子量内标的电泳介质是测序的PAGE或毛细管电泳胶，分辨能力可以达到1个bp，因此，这就要求分子量内标的自身分子量非常准确，不能有1个碱基的差别。另外，由于需要将待测样品与分子量标准区分开，分子量内标需要进行荧光标记，才能被仪器识别，并且标记的荧光分子在分析不同标记的样本时需要不同的标记，而传统的分子量标准不带有荧光标记，无法用做内对照。
由于荧光标记的分子量要求分子量精确到1个核苷酸，还需要带有荧光标记，其制作方法也和传统分子量标准差别很大。常规的制备分子量标准方法难以得到大量、准确的荧光标记分子量内标。
发明内容
本发明针对上述领域中的不足，提供一种经济快捷制备分子量内标的方法，同时还提供了由该方法制得的一种全新的分子量内标产品。
一种分子量内标的制备方法，以pUC18质粒为模板，固定上游引物5′GCGAAACCCGACAGGACTA 3′，选取相应距离设计下游引物，扩增得到多个核苷酸片段。
所述下游引物分别为70R5′ACAGGAGAGCGCACGAGG 3′；
80R5′CAGGGTCGGAACAGGAGAG 3′；100R5′GACAGGTATCCGGTAAGCGG 3′；120R5′TTCCCGAAGGGAGAAAGGC 3′；140R5′GCTATGAGAAAGCGCCACG 3′；160R5′CTGAGATACCTACAGCGTGAGC 3′；180R5′AGCGAACGACCTACACCGA 3′；200R5′GTGCACACAGCCCAGCTTG 3′；240R5′TACCGGATAAGGCGCAGC 3′；280R5′GATAAGTCGTGTCTTACCGGGT 3′；320R5′CGCTCTGCTAATCCTGTTACCA 3′；360R5′GCCACCACTTCAAGAACTCTGT 3′；400R5′CAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGT 3′；450R5′ATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCC 3′；490R5′ACAAAAAAACCACCGCTACCA 3′；500R5′CTGCTTGCAAACAAAAAAACC 3′；分别扩增得到70bp，80bp，100bp，120bp，140bp，160bp，180bp，200bp，240bp，280bp，320bp，360bp，400bp，450bp，490bp，500bp片段。
所述扩增反应条件为94℃2min；30cycles94℃20sec，58℃40sec，72℃40sec；70℃10min。
所述上游引物带有荧光标记物。
所述荧光标记物为ROX，FAM，HEX，JOE，TMR，TET，VIC，LIZ或Cy5。
上述方法制备得到的分子量内标。
本发明通过一个广泛使用的质粒载体(pUC18)作为DNA模板。用Primer Premier 5.0软件分析pUC18质粒全序列，(见附录SEQ ID NO1)发现在其927bp处至1425bp处，ATGC含量均一，没有特殊二级结构，选取该500bp左右的区域，在上游(5’)设计一条固定引物5′GCGAAACCCGACAGGACTA 3′，在下游设计一系列引物，使扩增产物为一系列核苷酸片段。本发明通过固定上游引物，依次向下设计下游引物的方法得到一系列长度不等的片段。这样可以降低成本，节约时间，提高工作效率。
上游引物5′GCGAAACCCGACAGGACTA 3′，退火温度58℃。以上游引物为起点，在其下游相应距离找下游引物的终点，下游引物的长度和序列要保证有较好的特异性同时退火温度跟上游引物接近，GC含量在20-40％之间，没有复杂二级结果，与上游引物不能形成二聚体。本发明选择核苷酸片段的长度分别为70、80、100、120、140、160、180、200、240、280、320、360、400、450、490、500bp，最终确定下游引物序列如下引物名称引物序列(5′-3′)70R 5′ACAGGAGAGCGCACGAGG 3′80R 5′CAGGGTCGGAACAGGAGAG 3′100R5′GACAGGTATCCGGTAAGCGG 3′120R5′TTCCCGAAGGGAGAAAGGC 3′140R5′GCTATGAGAAAGCGCCACG 3′160R5′CTGAGATACCTACAGCGTGAGC 3′180R5′AGCGAACGACCTACACCGA 3′200R5′GTGCACACAGCCCAGCTTG 3′240R5′TACCGGATAAGGCGCAGC 3′280R5′GATAAGTCGTGTCTTACCGGGT 3′320R5′CGCTCTGCTAATCCTGTTACCA 3′360R5′GCCACCACTTCAAGAACTCTGT 3′400R5′CAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGT 3′450R5′ATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCC 3′490R5′ACAAAAAAACCACCGCTACCA 3′500R5′CTGCTTGCAAACAAAAAAACC 3′通过摸索，最终确定扩增反应条件为94℃2min；30cycles94℃20sec，58℃40sec，72℃40sec；70℃10min。在这一条件下各个片段都能有较高的扩增效率和好的特异性。
由于上游引物一致，下游引物的长度和退火温度与上游相近，所以全部片段扩增条件都基本一致，可以在同一基因扩增仪上用同一反应程序同时扩增，使得操作更加简便，节约时间，提高了工作效率，适于大规模制备。
本发明制备分子量内标的过程中上游引物的荧光标记物可以是ROX，也可以时是FAM(羧基荧光素)，HEX(六氯-6-甲基荧光素)，JOE(4，5二氯-6-羧基荧光素)，TMR(4-甲基-6-羧基-罗丹明)或TET，VIC，LIZ，Cy5等荧光标记物，并用这一方法制备分子量内标。由于荧光标记引物合成造价较高，保存时间有限，所以可以只合成上游的固定端引物，这样可以大大降低引物合成成本和生产成本。
本发明制备得到一种带有荧光标记的核酸分子量内标，由长度为70、80、100、120、140、160、180、200、240、280、320、360、400、450、490、500bp的16个双链DNA片段组成，每个片段有一条DNA链带有荧光标记物，经过电泳分离后，激光激发产生激发光能够被荧光检测仪(如日立FMBIO荧光检测仪、ABI 3100遗传分析仪等)检测到，用来分析同一泳道中目的DNA片段的大小。这种分子量内标可以用来计算和校对长度为70bp到500bp之间的核酸片段的分子量。由于产物带有荧光素标记，需要在pH大于8.0的缓冲体系中低温冷冻保存，并且不能够反复冻融。低pH环境和反复冻融会导致荧光标记物脱落，从而引起检测信号降低，灵敏度变差。
利用该方法制作的分子量内标是双链DNA分子，其中只有一条带有荧光标记物，在进行变性凝胶电泳前需要变性成为单链分子。一般方法是加入去离子甲酰胺，95℃加热3-5分钟变性，迅速置于冰上冷却3分钟。
本发明制备的内标可以用于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳。
图1带有ROX荧光标记的分子量内标电泳图谱图2采用本发明作为分子量内标与Goldeneye 16A等位基因阶梯共同电泳后检测分型结果图3采用Promega公司的ILS600作为分子量内标与Goldeneye 16A等位基因阶梯共同电泳后检测分型结果具体实施方式
实施例1 制备分子量内标1.1设计上游引物并合成ROX标记的上游引物。
选用的DNA模板是pUC18质粒(Takara公司，货号D3218)。选择927bp处5′GCGAAACCCGACAGGACTA 3′为上游引物，退火温度58℃。ABI 394核酸合成仪合成引物，并在引物的5’用ROX标记，HPLC法纯化引物。
1.2根据片段长度来设计下游引物。
选择一系列长度不等片段70、80、100、120、140、160、180、200、240、280、320、360、400、450、490、500共16个片段。还可以是927-1425bp之间长度不等的多个核苷酸片段。ABI 394核酸合成仪合成引物，PAGE纯化。下游引物选择序列如下引物名称 引物序列(5′-3′)70R 5′ACAGGAGAGCGCACGAGG 3′
80R 5′CAGGGTCGGAACAGGAGAG 3′100R5′GACAGGTATCCGGTAAGCGG 3′120R5′TTCCCGAAGGGAGAAAGGC 3′140R5′GCTATGAGAAAGCGCCACG 3′160R5′CTGAGATACCTACAGCGTGAGC 3′180R5′AGCGAACGACCTACACCGA 3′200R5′GTGCACACAGCCCAGCTTG 3′240R5′TACCGGATAAGGCGCAGC 3′280R5′GATAAGTCGTGTCTTACCGGGT 3′320R5′CGCTCTGCTAATCCTGTTACCA 3′360R5′GCCACCACTTCAAGAACTCTGT 3′400R5′CAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGT 3′450R5′ATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCC 3′490R5′ACAAAAAAACCACCGCTACCA 3′500R5′CTGCTTGCAAACAAAAAAACC 3′1.3摸索扩增反应条件，用该条件扩增得到产物并检测，扩增反应在Bio-Rad iCycler基因扩增仪上进行。
分别合成上述上游引物及下游引物(ABI 394核酸合成仪完成)，将引物用TE稀释至10μM，摸索反应体系中引物浓度、模板DNA浓度和Taq酶用量，最终确定反应体系配制方法如下表
退火温度通过设置温度梯度，从54、56、58、60℃分别扩增，检测反应效率和反应特异性，最终确定反应条件是94℃2min；30cycles94℃20sec，58℃40sec，72℃40sec；70℃10min。在这一条件下各个片段都能有较高的扩增效率和好的特异性。
1.4调整产物量，使各个条带峰值均衡，结果见图1。
通过调整各个条带的含量使其达到等摩尔比例，峰值比较均一，ABI 3100遗传分析仪进行检测。检测方法如下1)取0.5μl与9.5μl Hi-Di甲酰胺混合，95℃变性3分钟，立即置于冰上；2)ABI3100遗传分析仪检测(参数设置进样电压1千伏，进样时间15秒，电泳电压15千伏，电泳时间1400秒)3)各片段峰高大于500RFU，各片段之间高度差异小于10％。
1.5产物纯化和冷冻保存。上述经过检测峰值均衡的DNA片段混合物中含有蛋白和盐离子，会导致DNA片段降解，不利于长期保存，因此需要将其纯化去除杂质。利用天根生化公司的离心柱型DNA纯化试剂盒完成，操作方法如下1)将各反应产物混到一起；估计产物的体积，向其中加入10倍体积的结合液，温和的充分混匀。
2)将上一步所得溶液加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2分钟，13000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
3)向吸附柱中加入700μl的漂洗液，13000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
4)向吸附柱中加入500μl的漂洗液，13000rpm离心30-60秒，倒掉废液。
5)将吸附柱重新放回收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温和58℃温箱数分钟，彻底晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
6)取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量65-70℃水浴预热的洗脱缓冲液，室温放置2分钟。13000rpm离心1分钟，收集溶液。溶液中即含有作为分子量内标的16个DNA片段。
实施例2.用ROX标记的分子量内标分析基因片段并检验准确度利用其进行分子量校正分别由FAM，HEX，TMR标记的长度在100-480bp之间的等位基因阶梯(基点认知技术(北京)有限公司的Goldeneye 16A身份鉴定试剂盒组分之一)，共包含210个等位基因片段，计算每个片段的平均大小和方差。对照实验采用美国Promega公司的产品ILS 600(货号DG2611)分析该等位基因阶梯。ILS 600由ROX标记的22条60-600bp的双链DNA组成，其中大小为60-200bp的片段之间相隔20bp，200-500bp的片段之间相隔25bp，500-600bp的片段之间相隔50bp。
电泳检测在ABI 3100遗传分析仪上完成，电泳电压15kV，收集时间1400秒。样品分别在12个泳道中同时电泳，结束后用gene mapper 3.2软件分析每个泳道中每个等位基因片段的分子量，然后计算每个片段的分子量标准差。
根据Promega公司提供的产品检验标准可知，用内标分析等位基因ladder的片断大小，重复上样12次，分析ladder中每个位点的每个基因型的12个数值，取平均数并计算标准偏差(SD)，SD值应小于0.1个碱基，但Penta D，Penta E，FGA和D18S51位点的SD值可在0.1至0.2个碱基之间。用GeneScan软件和Local Southern Method方法所计算的内标线性方程中，R2的值应大于0.9999。
分析结果表明，用本发明分析等位基因阶梯的12次结果，每个片段长度的标准差都小于0.10(0.03-0.07之间)，R2的值为0.999999(3号泳道分析图谱见图2)。用ILS 600分析的结果与之相似，每个样品的标准差小于0.10(0.03-0.07之间)，R2的值为0.999999(3号泳道分析图谱见图3)。可见，本发明所制备的内标已经达到了Promega公司的产品检验指标，可以用于分子量校对。
附录SEQ ID NO1(pUC18质粒的全序列)1TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG51 GAGACGGTCA CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG101 TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG151 CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC ACCATATGCG GTGTGAAATA201 CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC ATTCGCCATT251 CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT301 TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA351 ACGCCAGGGT TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGCCAA401 GCTTGCATGC CTGCAGGTCG ACTCTAGAGG ATCCCCGGGT ACCGAGCTCG451 AATTCGTAAT CATGGTCATA GCTGTTTCCT GTGTGAAATT GTTATCCGCT501 CACAATTCCA CACAACATAC GAGCCGGAAG CATAAAGTGT AAAGCCTGGG551 GTGCCTAATG AGTGAGCTAA CTCACATTAA TTGCGTTGCG CTCACTGCCC601 GCTTTCCAGT CGGGAAACCT GTCGTGCCAG CTGCATTAAT GAATCGGCCA651 ACGCGCGGGG AGAGGCGGTT TGCGTATTGG GCGCTCTTCC GCTTCCTCGC701 TCACTGACTC GCTGCGCTCG GTCGTTCGGC TGCGGCGAGC GGTATCAGCT751 CACTCAAAGG CGGTAATACG GTTATCCACA GAATCAGGGG ATAACGCAGG801 AAAGAACATG TGAGCAAAAG GCCAGCAAAA GGCCAGGAAC CGTAAAAAGG851 CCGCGTTGCT GGCGTTTTTC CATAGGCTCC GCCCCCCTGA CGAGCATCAC901 AAAAATCGAC GCTCAAGTCA GAGGTGGCGA AACCCGACAG GACTATAAAG951 ATACCAGGCG TTTCCCCCTG GAAGCTCCCT CGTGCGCTCT CCTGTTCCGA1001 CCCTGCCGCT TACCGGATAC CTGTCCGCCT TTCTCCCTTC GGGAAGCGTG1051 GCGCTTTCTC ATAGCTCACG CTGTAGGTAT CTCAGTTCGG TGTAGGTCGT1101 TCGCTCCAAG CTGGGCTGTG TGCACGAACC CCCCGTTCAG CCCGACCGCT1151 GCGCCTTATC CGGTAACTAT CGTCTTGAGT CCAACCCGGT AAGACACGAC1201 TTATCGCCAC TGGCAGCAGC CACTGGTAAC AGGATTAGCA GAGCGAGGTA1251 TGTAGGCGGT GCTACAGAGT TCTTGAAGTG GTGGCCTAAC TACGGCTACA1301 CTAGAAGAAC AGTATTTGGT ATCTGCGCTC TGCTGAAGCC AGTTACCTTC1351 GGAAAAAGAG TTGGTAGCTC TTGATCCGGC AAACAAACCA CCGCTGGTAG1401 CGGTGGTTTT TTTGTTTGCA AGCAGCAGAT TACGCGCAGA AAAAAAGGAT1451 CTCAAGAAGA TCCTTTGATC TTTTCTACGG GGTCTGACGC TCAGTGGAAC1501 GAAAACTCAC GTTAAGGGAT TTTGGTCATG AGATTATCAA AAAGGATCTT1551 CACCTAGATC CTTTTAAATT AAAAATGAAG TTTTAAATCA ATCTAAAGTA1601 TATATGAGTA AACTTGGTCT GACAGTTACC AATGCTTAAT CAGTGAGGCA1651 CCTATCTCAG CGATCTGTCT ATTTCGTTCA TCCATAGTTG CCTGACTCCC1701 CGTCGTGTAG ATAACTACGA TACGGGAGGG CTTACCATCT GGCCCCAGTG1751 CTGCAATGAT ACCGCGAGAC CCACGCTCAC CGGCTCCAGA TTTATCAGCA1801 ATAAACCAGC CAGCCGGAAG GGCCGAGCGC AGAAGTGGTC CTGCAACTTT1851 ATCCGCCTCC ATCCAGTCTA TTAATTGTTG CCGGGAAGCT AGAGTAAGTA1901 GTTCGCCAGT TAATAGTTTG CGCAACGTTG TTGCCATTGC TACAGGCATC1951 GTGGTGTCAC GCTCGTCGTT TGGTATGGCT TCATTCAGCT CCGGTTCCCA2001 ACGATCAAGG CGAGTTACAT GATCCCCCAT GTTGTGCAAA AAAGCGGTTA2051 GCTCCTTCGG TCCTCCGATC GTTGTCAGAA GTAAGTTGGC CGCAGTGTTA2101 TCACTCATGG TTATGGCAGC ACTGCATAAT TCTCTTACTG TCATGCCATC
2151 CGTAAGATGC TTTTCTGTGA CTGGTGAGTA CTCAACCAAG TCATTCTGAG2201 AATAGTGTAT GCGGCGACCG AGTTGCTCTT GCCCGGCGTC AATACGGGAT2251 AATACCGCGC CACATAGCAG AACTTTAAAA GTGCTCATCA TTGGAAAACG2301 TTCTTCGGGG CGAAAACTCT CAAGGATCTT ACCGCTGTTG AGATCCAGTT2351 CGATGTAACC CACTCGTGCA CCCAACTGAT CTTCAGCATC TTTTACTTTC2401 ACCAGCGTTT CTGGGTGAGC AAAAACAGGA AGGCAAAATG CCGCAAAAAA2451 GGGAATAAGG GCGACACGGA AATGTTGAAT ACTCATACTC TTCCTTTTTC2501 AATATTATTG AAGCATTTAT CAGGGTTATT GTCTCATGAG CGGATACATA2551 TTTGAATGTA TTTAGAAAAA TAAACAAATA GGGGTTCCGC GCACATTTCC2601 CCGAAAAGTG CCACCTGACG TCTAAGAAAC CATTATTATC ATGACATTAA2651 CCTATAAAAA TAGGCGTATC ACGAGGCCCT TTCGTC
权利要求
1.一种分子量内标的制备方法，以pUC18质粒为模板，固定上游引物5′GCGAAACCCGACAGGACTA 3′，选取相应距离设计下游引物，扩增得到多个核苷酸片段。
2.根据权利要求1所述的分子量内标的制备方法，所述下游引物分别为70R5′ACAGGAGAGCGCACGAGG 3′；80R5′CAGGGTCGGAACAGGAGAG 3′；100R5′GACAGGTATCCGGTAAGCGG 3′；120R5′TTCCCGAAGGGAGAAAGGC 3′；140R5′GCTATGAGAAAGCGCCACG 3′；160R5′CTGAGATACCTACAGCGTGAGC 3′；180R5′AGCGAACGACCTACACCGA 3′；200R5′GTGCACACAGCCCAGCTTG 3′；240R5′TACCGGATAAGGCGCAGC 3′；280R5′GATAAGTCGTGTCTTACCGGGT 3′；320R5′CGCTCTGCTAATCCTGTTACCA 3′；360R5′GCCACCACTTCAAGAACTCTGT 3′；400R5′CAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGT 3′；450R5′ATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCC 3′；490R5′ACAAAAAAACCACCGCTACCA 3′；500R5′CTGCTTGCAAACAAAAAAACC 3′；分别扩增得至70bp，80bp，100bp，120bp，140bp，160bp，180bp，200bp，240bp，280bp，320bp，360bp，400bp，450bp，490bp，500bp片段。
3.根据权利要求2所述的分子量内标的制备方法，所述扩增反应条件为94℃2min；30cycles94℃20sec，58℃40sec，72℃40sec；70℃10min。
4.根据权利要求1所述的分子量内标的制备方法，所述上游引物带有荧光标记物。
5.根据权利要求4所述的分子量内标的制备方法，所述荧光标记物为ROX，FAM，HEX，JOE，TMR，LIZ或Cy5。
6.权利要求1至5任一所述的分子量内标的制备方法制备得到的分子量内标。
全文摘要
本发明涉及“一种分子量内标的制备方法及用该方法制备的分子量内标”。一种分子量内标的制备方法，以pUC18质粒为模板，固定上游引物5′GCGAAACCCGACAGGACTA 3′，选取相应距离设计下游引物，扩增得到多个核苷酸片段。本发明通过固定上游引物，依次向下设计下游引物的方法得到一系列长度不等的片段。由于荧光标记引物合成造价较高，保存时间有限，所以可以只合成上游的固定端引物，这样可以大大降低引物合成成本和生产成本。同时由于上游引物一致，下游引物的长度和退火温度与上游相近，所以全部片段扩增条件都基本一致，可以在同一基因扩增仪上用同一反应程序同时扩增，使得操作更加简便，节约时间，提高了工作效率，适于大规模制备。
文档编号C12N15/11GK101050474SQ20071006471
公开日2007年10月10日 申请日期2007年3月23日 优先权日2007年3月23日
发明者高阳, 陈初光, 马斌, 王曙光 申请人:鼎生科技(北京)有限公司, 基点认知技术(北京)有限公司