一种抗盐胁迫真菌菌株及选育方法和其应用
【专利说明】
[0001]
技术领域
[0002] 本发明涉及微生物学、植物学、发酵工程等领域，具体涉及一种抗盐胁迫真菌菌株 及选育和其应用的方法。本发明选育的真菌及其产物主要应用于植物抗逆、生态修复及生 物催化等领域。
【背景技术】
[0003] 盐生植物是一种逆境植物，它们生活在被盐碱化的土壤中。已有大量报道内生真 菌改善植物耐盐作用。Frank等发现从印度沙漠分离到一株真菌 侵染植物根系后能显著提高单子叶植物耐盐水平和产量（PNAS，2005，13386 - 13391); Helmut等进一步发现植物侵染后耐盐作用改善与抗氧化酶活力 (0拟1?、041\]\?拟1?、61?、4?乂.和]\?拟1〇增强有关（#￡^/%_衫〇/〇^/ >^，2008,501 - 510);内生 真菌5/7/7.侵染植物/^steca 能显著改善后者盐碱耐受能力（J 5bi/ 5bi. 2010，77$ 952 - 957)，揭示内生真菌参与盐碱环境植物的耐盐 作用。Abdul等从植物sa(ira>s根部分离内生真菌sp能产生赤霉素 GA1, GA3, GA4、GA7等九种成分，从而改善其对胁迫抗性腫，2011， 329 - 343.)。内生真菌的分离培养是菌种鉴定和进一步转染的基础。目前已经进行了多种 内生真菌的体外培养，许多新的特性为人们所认识。例如，顶孢霉属的种类在体外培养基上 可以产生分生孢子，这就为其种属鉴定提供了依据。另外，内生真菌体外培养所需的基本培 养基以及特殊的营养需求也有报道。
[0004] 在认识内生真菌作用的基础上，用内生真菌人工侵染植物是今后对其利用的有效 手段。Latch和Christensen用5种内生真菌进行了人工侵染实验，发现在幼苗期侵染能够 实现，而成熟植株的侵染没有成功。Johnson等用愈伤组织培养的方法也进行了侵染实验， 发现有17%的再生植株被感染。内生真菌与植物之间共生关系研宄方面已成为热点，但研 宄大多局限于生物学现象方面，更多有价值抗盐内生真菌有待发现，同时用于生产应用的 抗盐胁迫真菌生产和应用方法未见报道。
[0005]
【发明内容】
针对现有技术的不足，本发明的目的在于，提出一种抗盐胁迫真菌菌株及选育方法和 其应用，该菌株属植物内生真菌，侵染植物不引起植物病害，同时产生的代谢产物可以提高 植物抗盐胁迫能力。并通过固体发酵生产方法大量生产可以应用的内生真菌用于植物侵 染，提高抗盐胁迫能力。
[0006] -种抗盐胁迫真菌菌株及选育方法和其应用分为3项发明创造，每一项发明创造 都具有相同的特定技术特征：抗盐胁迫的5/7 NX002真菌菌株，解决了在高盐环 境下植物的良性生长和抗胁迫能力的技术问题，属于一个总的发明构思，可以作为一件申 请提出。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种抗盐胁迫真菌菌株，其为节 孢霉属，保藏编号为CCTCC NO.M2014462,分类命名为5/7 NX002。
[0008] 进一步地，该菌株从盐生植物毕氏海蓬子的根部分离培养而得，该菌株的次级代 谢产物包括赤霉素GA、长懦抱醇helminthosporol和懦抱酸helminthosporal acid。
[0009] -种抗盐胁迫真菌菌株的选育方法，其特征是，所述方法包括以下步骤： (a) 取盐生植物根部，用1% Tween80和5%H202分别浸泡处理5min，经无菌洗涤，无菌研 磨后加入液体种子培养基中富集培养Id后，将经过富集培养后的菌液稀释到1(T 4,取稀释 液，在初筛培养基上涂平板，其中液体种子培养基加80ppm链霉素； (b) 培养4-7d后，用接种针挑出同一平板上不同形态的真菌菌落，再转接到平板上进 行单菌落分离，最终得到多株菌； (c) 将每株菌分别接种于液体种子培养基中，在28°C恒温培养箱中培养7d ;收集菌丝 体发酵液，冷冻离心分离得到菌丝体和纯发酵液并保存；发酵液冻干处理，然后用无菌水溶 解，记作CF，用于抗盐胁迫菌株筛选。
[0010] (d)选择健康、有活力的普通植物种子，消毒并洗涤后将种子放置在植物种子培 养基，在人工培养箱中使其萌发，发芽至三叶一心；将10 yL CF加入萌发种子作为试验组， 以不加CF的萌发种子组作为对照组，培育2周后，测定叶片长度、鲜重和干重，筛选得到 ArthriniumspNX002〇
[0011] 进一步地，上述步骤（a)和步骤（c)中，所述液体种子培养基的组成为：NaN03 2 g、 K2HP041 g、KCl 0.5 g、MgS04 0.5 g、FeS04 0 . 01 g、蔗糖 30 g、酵母膏 1 g，加水溶解至 1000 ml、分装、灭菌后备用。
[0012] 进一步地，上述步骤（a)中，所述初筛培养基的制备步骤为：去皮马铃薯200 g切 碎成丁后加水煮沸30 min，滤去残渣，滤液加水补足至1000 ml;加入15-20 g琼脂加热溶 化后再加20 g葡萄糖溶解、分装、灭菌后形成初筛固体培养基；或者不加琼脂，其余步骤与 初筛固体培养基的制备相同，形成初筛液体培养基TOB。
[0013] 上述步骤（d)中，所述植物种子培养基的组成为：含30mM NaCl的灭菌沙土。
[0014] 所述的普通植物种子包括菠菜种子或青麻叶白菜种子。
[0015] 一种抗盐胁迫真菌菌株的应用方法，其特征是，所述方法包括以下步骤： (1) 真菌培养 将5/7 NX002接种于斜面初筛培养基，27°C培养2d后转接液体种子培养 基，27°C条件下培养5d得到发酵液； (2) 抗盐胁迫真菌的处理和代谢产物测定 将发酵液冷冻离心后，收集菌丝体接种于固体培养基，在27°C下培养40d，将发酵产物 冷冻干燥、粉碎，lmL无菌水溶10ug发酵产物，得到含5/7 NX002的产品，用于反 接于萌发植物； 固体发酵产物通过乙酸乙酯浸提、经HPLC分离得到长蠕孢醇和蠕孢酸。
[0016] (3)植物与内生真菌互作和抗胁迫作用 取15mg 5/7 NX002菌株接种到萌发植物中，在中度盐胁迫的30mM NaCl培 养基培养下，使植物生长。
[0017] 进一步地，在步骤（1)中，所述的斜面初筛培养基的制备步骤为：去皮马铃薯200 g切碎成丁后加水煮沸30 min，滤去残渣，滤液加水补足至1000 ml ;加入15-20 g琼脂加 热溶化后再加20 g葡萄糖溶解、分装、灭菌后形成初筛固体培养基；或者不加琼脂，其余步 骤与初筛固体培养基的制备相同，形成液体培养基PDB ; 所述的液体种子培养基的组成为：NaN03 2 g、K2HP04 1 g、KC1 0. 5 g、MgS04 0. 5 g、 FeS04 0 . 01 g、蔗糖30 g、酵母膏1 g，加水溶解至1000 ml、分装、灭菌后备用； 所述的固体培养基的组成为：麸皮，15 g ; KH2P04,2 g ;MgS04,0. 5 g ;蒸馏水10 mL，pH 6. 0 ~6. 5。
[0018] 所述的萌发植物通过选择健康、有活力的普通植物种子，消毒并洗涤后将种子放 置在植物种子培养基，在人工培养箱中使其萌发至三叶一心的方法而得到。所述的普通植 物种子包括菠菜种子或青麻叶白菜种子等。
[0019] 本发明的有益效果是： (1) 本发明所筛选到的5/7 NX002属于植物内生真菌，侵染植物不产生病 害，促进植物生长，提高其抗盐胁迫功能。该真菌适用于大规模固体发酵，发酵过程中产生 植物代谢激素，即赤霉素GA; (2) 从本发明5/7 NX002提取的长懦孢醇可达到0. 5mg/kg,与报道菌株相 比，具有更高的产量；在植物幼苗中加入5/7 NX002,在30mM NaCl胁迫下，能明 显改善植物生长状况，显示了良好的抗胁迫能力，在植物抗盐胁迫和耐干旱等领域具有良 好的应用前景。
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【附图说明】
[0021] 图1为5/7 NX002菌株添加到盐胁迫菠菜中生长情况对比图； 图2为5/7 NX002菌株添加到盐胁迫白菜天津青麻叶中生长情况图； 图 3 5/7 NX002 代谢产物结构式 helminthosporol 和 helminthosporal acid ； 图 4 为 helminthosporol 4 NMR 图； 图 5 为 helminthosporal acid 屯 NMR 图； 图6为NaCl和5/7 NX002处理对菠菜鲜重的影响图； 图7为NaCl和5/7 NX002处理对菠菜叶绿素和蛋白质含量的影响图； 序列表为5/7 NX002菌株的ITS rDNA序列鉴定结果。
[0022] 生物材料样品保藏： 办从5/7 NX002已保藏于中国武汉大学"中国典型培养物保藏中心"，即CCTCC， 保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏编号为M2014462,保藏日期为2014年10月9 曰。
[0023]
【具体实施方式】
[0024] 为进一步揭示本发明的技术方案，下面结合附图详细说明本发明的实施方式： 本发明中所用培养基为： 液体种子培养基的组成为：NaN03 2 g、K2HP04l g、KCl 0.5 g、MgS04 0.5 g、FeS04 0 . 01 g、鹿糖30 g、酵母膏1 g，加水溶解至1000 ml、分装、121°C灭菌20 min后备用。
[0025] 初筛培养基的组成为：去皮马铃薯（200 g)切碎成丁后加水