煮沸30 min，以纱布滤 去残渣，滤液加水补足至1000 ml;加入15-20 g琼脂加热溶化后再加20 g葡萄糖溶解、分 装、121°C灭菌20 min后备用。不加琼脂者为相应液体培养基（PDB)。
[0026]固体培养基：麸皮，15 g;KH2P04,2 g ;MgS04,0. 5 g;蒸馏水 10 mL，pH 6. 0 ~6. 5。
[0027] 实施例1 5/7 NX002 的筛选过程： 取高等盐生植物毕氏海蓬子的根部，用1% TWeen80,5%H202分别处理5min，无菌水洗 涤，无菌研磨加入液体种子培养基(加80ppm链霉素）中富集培养Id后，将经过富集培养 后的菌液稀释到1〇_4,取稀释液，在初筛培养基上涂平板培养；培养4-7d后，用接种针挑出 同一平板上不同形态的真菌菌落，再转接到平板上进行单菌落分离，最终得到多株菌；将每 株菌分别接种于液体种子培养基中，在28°C恒温培养箱中培养7d。收集丝体发酵液，4°C， 5000g离心15min。菌丝体和50ml纯发酵液立即保存-70°C。菌丝体用于菌株鉴定（ITS rDNA测序），发酵液用于检测GA。发酵液冻干处理，然后用lmL无菌水溶解，用于抗盐胁 迫筛选。选择健康、有活力的菠菜种子，在70%乙醇中消毒5min，用无菌水洗涤3遍，将种 子放置菠菜种子培养基，在人工培养箱中使其萌发，发芽至三叶一心。将10uL CF内生真菌 加入萌发种子作为试验组，不加内生真菌萌发种子组作为对照组，培育2周后，测定叶片长 度、鲜重和干重，用于真菌筛选。选出在盐胁迫下生长状况良好植物，将其添加真菌命名为 5/7 NX002。图1为5/7 NX002菌株添加到盐胁迫菠菜中生长情况； 图2为5/7 NX002菌株添加到盐胁迫白菜天津青麻叶中生长情况。
[0028] 实施例2 5/7 NX002生产并应用到植物抗盐胁迫的方法： (1) 真菌培养 将5/7 NX002接种于斜面初筛培养基，27°C培养2d后转接液体种子培养 基，27°C条件下培养5d ; (2) 抗盐胁迫真菌的处理和代谢产物测定 将发酵液以5000g的转速冷冻离心15min，收集菌丝体，接种于固体培养基(其为一 种发酵培养基)，在27°C下培养40d，将发酵产物冷冻干燥，粉碎，lmL无菌水溶10ug，得 到抗盐胁迫真菌产品NX002,用于反接于植物；所述的固体培养基的组成为：麸皮，15 g ; KH2P04,2 g ;MgS04,0. 5 g ;蒸馏水 10 mL，pH 6. 0 ~6. 5。
[0029] 固体发酵产物通过乙酸乙醋浸提，HPLC分离可以得到长懦孢醇helminthosporol 和懦抱酸helminthosporalacid(图 3-5) 〇
[0030] (3)植物与内生真菌互相作用和抗胁迫作用 取15mg内生真菌5/7 NX002接种到萌发植物中，在中度盐胁迫30mM NaCl 培养下，植物可良好生长（图6-7)。
[0031] 实施例3 从5/7 NX002菌株中提取的次级代谢产物： (l)Ar(Ari/?itt? 5/7 NX002在固体培养基发酵 将发酵液以5000g的转速冷冻离心15min，收集菌丝体，接种于固体培养基，在27°C 下培养40d,将发酵产物冷冻干燥，粉碎，lmL无菌水溶10ug，得到抗盐胁迫真菌产品 NX002 ； {2、Arthriniumspmm2 分离 Arthrinium sp NX002固体发酵产物用乙酸乙酯萃取5次，用旋转蒸发仪将乙酸乙酯萃 取相减压蒸馏浓缩并旋干得到粗浸膏，浸膏尽量用少量的甲醇(准确称量体积）加热回流溶 解，按体积比85 :15(甲醇：水）滴加蒸馏水，搅匀，于一 20°C冰箱放置过夜，抽滤去除蜡脂 和油类滤液减压蒸馏得浸膏。除蜡之后得到浸膏9.8g。将浸膏用硅胶柱、S印hadex LH-20 凝胶柱和0DS反相柱层析，以及高效液相反复分离纯化，得到长懦孢醇helminthosporol 0? 5mg/g (即每g浸膏中含0? 5mg长懦孢醇，以下同）和懦孢酸helminthosporal acid0.0 1mg/g〇
[0032] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化、均 应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种抗盐胁迫真菌菌株，其为节孢霉属，保藏编号为CCTCCNo.M2014462,分类命名 %ArthriniumspNX002〇
2. 根据权利要求1所述的一种抗盐胁迫真菌菌株，其特征是：该菌株从盐生植物毕氏 海蓬子的根部分离培养而得，该菌株的次级代谢产物包括赤霉素、长蠕孢醇和蠕孢酸。
3. -种抗盐胁迫真菌菌株的选育方法，其特征是，所述方法包括以下步骤： (a) 取盐生植物根部，通过表面软化和氧化预处理进行外植体消毒，经无菌洗涤，无菌 研磨后加入液体种子培养基中富集培养Id后，将经过富集培养后的菌液稀释到KT4,取稀 释液，在初筛培养基上涂平板，其中液体种子培养基加80ppm链霉素； (b) 在20-25°C下，培养4-7d后，用接种针挑出同一平板上不同形态的真菌菌落，再转 接到平板上进行单菌落分离，最终得到多株菌； (c) 将每株菌分别接种于液体种子培养基中，在28°C恒温培养箱中培养7d;收集菌丝 体发酵液，冷冻离心分离得到菌丝体和纯发酵液并保存；发酵液冻干处理，然后用无菌水溶 解，记作CF，用于抗盐胁迫菌株筛选； (d) 选择健康、有活力的普通植物种子，消毒并洗涤后将种子放置在植物种子培养 基，在人工培养箱中使其萌发，发芽至三叶一心；将IOyLCF加入萌发种子作为试验组， 以不加CF的萌发种子组作为对照组，培育2周后，测定叶片长度、鲜重和干重，筛选得到 ArthriniumspNX002〇
4. 根据权利要求3所述的抗盐胁迫真菌菌株的选育方法，其特征是，上述步骤（a)和步 骤（c)中，所述液体种子培养基的组成为：NaNO3 2g、K2HP04lg、KCl0. 5g、MgS04 0. 5g、 FeSO4 0.01g、蔗糖30g、酵母膏Ig，加水溶解至1000ml、分装、灭菌后备用。
5. 根据权利要求3所述的抗盐胁迫真菌菌株的选育方法，其特征是，上述步骤（a)中， 所述初筛培养基的制备步骤为：去皮马铃薯200g切碎成丁后加水煮沸30min，滤去残渣， 滤液加水补足至1000ml;加入15-20g琼脂加热溶化后再加20g葡萄糖溶解、分装、灭菌 后形成初筛固体培养基；或者不加琼脂，其余步骤与初筛固体培养基的制备相同，形成初筛 液体培养基I3DB。
6. 根据权利要求3-5任意一项所述的抗盐胁迫真菌菌株的选育方法，其特征是，上述 步骤（d)中，所述植物种子培养基的组成为：含30mMNaCl的灭菌沙土。
7. 根据权利要求3-5任意一项所述的抗盐胁迫真菌菌株的选育方法，其特征是，所述 的普通植物种子包括菠菜种子或青麻叶白菜种子。
8. -种抗盐胁迫真菌菌株的应用方法，其特征是，所述方法包括以下步骤： (1) 真菌培养 将5/7NX002接种于斜面初筛培养基，27°C培养2d后转接液体种子培养 基，27°C条件下培养5d得到发酵液； (2) 抗盐胁迫真菌的处理和代谢产物测定 将发酵液冷冻离心后，收集菌丝体接种于固体培养基，在27°C下培养40d，将发酵产物 冷冻干燥、粉碎，ImL无菌水溶IOug发酵产物，得到含5/7NX002的产品，用于反 接于萌发植物；发酵产物包括活性真菌孢子和代谢产物；应当可能导致范围不清楚，删除 之 固体发酵产物通过乙酸乙酯浸提、经HPLC分离得到长蠕孢醇和蠕孢酸； (3)植物与内生真菌互作和抗胁迫作用 取15mg 5/7NX002菌株接种到萌发植物中，在中度盐胁迫的30mMNaCl培 养基培养下，使植物生长。
9. 根据权利要求8所述的抗盐胁迫真菌菌株的应用方法，其特征在于，在步骤（2) 中，所述的固体培养基的组成为：麸皮，15g;KH2P04,2g;MgS04,0. 5g;蒸馏水10mL，pH 6. 0 ~6. 5。
10. 根据权利要求8所述的抗盐胁迫真菌菌株的应用方法，其特征在于，所述的萌发植 物通过选择健康、有活力的普通植物种子，消毒并洗涤后将种子放置在植物种子培养基，在 人工培养箱中使其萌发至三叶一心的方法而得到。
【专利摘要】本发明涉及微生物学、植物学、发酵工程等领域,公开了一种抗盐胁迫真菌菌株及选育方法和其应用，菌株保藏编号为CCTCC No.M2014462，分类命名为Arthrinium sp NX002；该菌株从盐生植物毕氏海蓬子的根部分离培养而得，该菌株的次级代谢产物包括赤霉素、长蠕孢醇和蠕孢酸。本发明提供了鉴定的菌株培养物的rDNA序列。本发明还提供了该菌株的生产培养基和培养条件，以及该菌株应用方法。本发明生产的抗胁迫内生真菌，生产成本低廉、易于大规模发酵，可广泛用于植物抗盐胁迫应用。CCTCC NO: M 201446220141009
【IPC分类】A01G7-06, A01N63-04, C12N1-14, C12R1-645, A01P21-00
【公开号】CN104762216
【申请号】CN201410830686
【发明人】周峰, 霍光明, 顾祝军, 华春
【申请人】南京晓庄学院
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2014年12月26日