雨生红球藻的破壁方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种淡水藻细胞壁的破碎方法，具体是涉及从雨生红球藻 (Haematococcus pluvialis H)中获得最大破孢率及奸青素产率的细胞壁破碎方法。
【背景技术】
[0002] 虾青素（Astaxanthin)是一种广泛存在于自然界中的酮式类胡萝卜素，具有很好 的着色功能，在三文鱼、鲑鱼、甲壳类动物、磷虾等水产动物中分布广泛，但水产动物本身无 法合成虾青素，因此虾青素在水产饲料添加剂方面有重要的应用价值。此外，虾青素具有 "超级维生素E"之称，其抗氧化性能是维生素E的500倍。虾青素极强的抗氧化性和清除 自由基能力使其对人类身体的健康起着重要的作用，可有效防止组织、细胞和DNA被氧化 损伤 [1]。超强的抗氧化能力、多样的生物活性以及艳丽的红色赋予了虾青素在水产、家禽养 殖、食品、保健品、化妆品和医药等行业广泛的应用前景和市场潜力。
[0003] 目前市场上的虾青素，大部分是化学合成的，化学合成虾青素过程复杂，且结构与 天然虾青素不同，在动物体内不能转化成天然的反式结构，吸收效率较低 [2]。随着天然虾青 素的推广，人们越来越关注天然虾青素的功效。天然虾青素有三大类来源，分别是甲壳类动 物中提取、红发夫酵母发酵生产以及雨生红球藻培养生产。甲壳类废弃物具有地域性限制 及提取过程存在有机溶剂残留等问题，因此没有得到广泛应用。红法夫酵母是应用较多的 虾青素生产菌种，易于实现高密度发酵，但是红法夫酵母的虾青素含量很低，无法满足产业 化生产的需求。雨生红球藻是近年来被研宄最多也是应用最广泛的一种，其体内的虾青素 含量可达细胞干重的3. 0 %左右，最高可达4%，是虾青素含量最高的微生物，被看作是天 然虾青素的"浓缩品" [3]，其虾青素的积累速率和生产总量较其它绿藻高，且所含虾青素及 其酯类的配比与水产养殖动物自身配比极为相似，这是通过化学合成和利用酵母菌等提取 的虾青素所不具备的优势。因此，雨生红球藻被公认为是自然界中虾青素的最佳来源之一。
[0004] 利用雨生红球藻生产虾青素引起了当前许多科研工作者的兴趣。目前主要研宄 内容集中在藻种诱变、培养条件优化、培养基成分和浓度优化、胁迫条件优化、虾青素分析 的方法研宄、提取工艺优化等几方面。但是如何获得最大细胞破碎率及虾青素提取率方面 还有待研宄，故本试验从破碎条件优化入手，寻求最优雨生红球藻破碎方法。细胞破碎常 用的方法有酶解法、化学渗透法、高压匀浆法、超声破碎和高速珠磨法等。雨生红球藻中虾 青素的提取一般采用物理的方法，以避免生物试剂和化学物质参入虾青素中，增加分离和 纯化的难度。工业上多采用匀浆器，常用方法有单罐多次重复萃取和索氏提取法。专利CN 101381337A采用气流粉碎破壁，破壁率约为90%。专利CN 102012363A采用高压均质机在 80~90Mpa (约13KPSI)压强下破壁。万庆家等[4]采用200~300Mpa (约40KPSI)超高压 进行破壁，破壁率高。姜玲等[5]研采用超声破碎，提取率高，但需结合酸加热的方式，导致 提取过程复杂。
[0005] 参考文献：
[0006] [1]魏东，严小君.天然虾青素的超级抗氧化活性及其应用[J].中国海洋药 物，2001，82:45-50.
[0007] [2]BowenJ,L.S.Comparisonofastaxanthinaccumulationinrainbow trout(Oncorhvnchusmvkiss)fedalgalandsyntheticastaxanthin.Abstractsofthe 12th.InternationalCarotenoidSymposium[J].Cairus,Australia, 1999:201-208.
[0008] [3]蔡明刚，王杉霖.利用雨生红球藻生产虾青素的研宄进展[J].台湾海 峡，2003, 22(4) : 537-544.
[0009][4]万庆家，饶高雄，史晓晨等.超高压一步法萃取雨生红球藻孢子中虾青素工艺 研宄[J].辽宁中医药大学学报，2010, 12(11) : 24~25.
[0010][5]姜玲，董庆霖，邢向英等.雨生红球藻细胞破碎的工艺优化[J].食品研宄与 开发，2010, 31 (7): 72 ~75.
【发明内容】
[0011] 本发明的目的在于提供操作简单、破壁效果好、使用范围不同的雨生红球藻的破 壁方法。
[0012] 所述雨生红球藻可购自中国科学院野生生物种质库一一淡水藻种库；地址：武汉 珞珈山东湖南路7号中科院水生生物研宄所淡水藻种库；电话：027-68780871。
[0013] 本发明包括以下步骤：
[0014] 1)藻种平板培养；
[0015] 在步骤1)中，所述藻种平板培养的具体方法可为：在BBM(Bold's Basal Medium) 平板培养基中按质量百分比加入15 %琼脂粉，121 °C灭菌20min后，冷却至50 °C，倒入平板； 使用接种环从该平板中挑取少量藻体，涂画于新平板中；将新平板置于温度为23. 8°C、光 照强度为20 y mol photos nT2s4的光照培养箱中，培养7~10天；最后，将新平板置于避 光条件下保存，每2个重新涂画一次平板，进行传代培养后再保存，以保持藻种活性；
[0016] 所述 BBM 平板培养基组成可为 NaN032. 9mM，MgS040. 3mM，NaCl 0. 43mM， K2HP04 ? 3H200. 43mM，KH2P041. 29mM，CaCl2 ? 2H20 0? 17mM，KOH 0? 55mM，H3B030. 18mM， EDTA-Na20. 12mM，ZnS04 ? 7H20 0? 0307mM，MnCl2 ? 4H20 0? 0073mM，冰钼酸钠 0? 0049mM， CuS04 ? 5H20 0? 0063mM，C〇(N03)2 ? 6H20 0? 0017mM，EDTA-Fe3+1. 8mM，琼脂 15 ~20g/L，pH 6. 8,121°C 灭菌 20min。
[0017] 2)通过血球计数板对低温保存的藻液进行计数，按初始藻细胞密度为 5X 104cells/ml的细胞密度接种至装有一级种子BBM+V培养基的三角瓶中，放置于光照培 养箱中培养，每天定期手动摇瓶2次，以防微藻粘壁，待藻体长至对数生长期（7-10d)，得一 级种子液。
[0018] 在步骤2)中，所述一级种子BBM+V培养基的用量可为10mL; -级种子BBM+V培 养基组成可为 NaN032. 9mM，MgS040. 3mM，NaCl 0? 43mM，K2HP04 ? 3H20 0? 43mM，KH2P041. 29mM， CaCl2 ? 2H20 0. 17mM，KOH 0. 55mM，H3B030. 18mM，EDTA-Na20. 12mM，ZnS04 ? 7H20 0. 0307mM， MnCl2 ? 4H20 0? 0073mM，冰钼酸钠 0? 0049mM，CuS04 ? 5H20 0? 0063mM，Co (N03) 2 ? 6H20 0. 0017mM, EDTA-Fe3+1. 8mM, thiamine l.Oppm，biotin 2. 5bpm, Vitamin B121.5bpm,pH 6.8, 121°C灭菌20min ;所述培养的条件可于22°C，20ymol photos 光照/12h黑暗条 件下培养。
[0019] 3)取一级种子液接种至装有二级种子BBM+V培养基的三角瓶中培养，每天手摇2 次，以防藻粘壁，得二级种子液；
[0020] 在步骤3)中，所述一级种子液的用量可为5mL;所述二级种子BBM+V培养基的 用量可为 50mL;二级种子BBM+V培养基组成可为NaN032. 9mM，MgS040. 3mM，NaCl0. 43mM， K2HP04 ? 3H20 0. 43mM，KH2P041. 29mM，CaCl2 ? 2H20 0. 17mM，KOH0. 55mM，H3B030. 18mM， EDTA-Na20. 12mM，ZnS04 ? 7H20 0? 0307mM，MnCl2 ? 4H20 0? 0073mM，冰钼酸钠 0? 0049mM， CuS04 ? 5H20 0? 0063mM，Co(N03)2 ? 6H20 0? 0017mM，EDTA-Fe3+1. 8mM，thiamine1.Oppm， biotin2. 5bpm，VitaminB121.5bpm，pH6.8,121°C灭菌20min;所述接种的量按质量百分比 可为一级种子液的10% ;所述培养的条件可于22°C，20ymolph