一种利用磁力搅拌培养蛹虫草液体菌种的方法
【技术领域】
本发明涉及一种蛹虫草液体发酵技术，特别涉及一种利用磁力搅拌培养蛹虫草液体菌种的方法。
【背景技术】
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)，属子囊菌门(Ascomycota)肉座菌目(Hypocreale)麦角菌科(Clavicipitaceae)虫草属(Cordyceps)是中国传统的名贵中药材，有调节免疫系统功能、抗肿瘤、抗疲劳等多种功效。冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫，主要产于中国青海、西藏、四川、云南、甘肃和贵州等省及自治区的高寒地带和雪山草原，自然资源十分稀少且子实体不能人工培养。
[0003]蛹虫草(Cordycepsmilitaris)属子囊菌门(Ascomycota)肉座菌目(Hypocreale)麦角菌科(Clavicipitaceae)虫草属(Cordyceps)，主要分布在东北、华北、西北等省份，云南、贵州、四川、重庆等南方省区也有分布，生长在较低海拔的平原地域。蛹虫草是与冬虫夏草同属的食药用真菌，世界上天然资源分布数量少。蛹虫草与冬虫夏草具有相似的药用和滋补功能，蛹虫草中的虫草素、虫草酸与虫草多糖具有抗菌消炎、抗衰老、抗肿瘤、免疫调节等作用，而且比冬虫夏草更易于进行人工栽培。因此蛹虫草被选为冬虫夏草的最佳替代品而进行大量的人工培育。蛹虫草菌种的制备是生产过程中的一个重要环节。一般蛹虫草菌种的生产采用三级制种方法。即母种、原种、生产种。要想生产出合格的菌种，必须先培育出母种，而后由母种制成原种，由原种制成生产种，而后用生产种转接至小麦培养基，再进行培养子实体管理。其中原种和生产种可利用液体发酵技术进行制种。
液体发酵技术是现代生物技术之一，它是指在生化反应器中，模仿自然界将菌株在生育过程中所必需的糖类、有机和无机含有氮素的化合物、无机盐等一些微量元素以及其它营养物质溶解在水中作为培养基，灭菌后接入菌种，提供适于菌体代谢所需要的环境，并控制适宜的外界条件，进行大量培养繁殖的过程。工业化大规模的发酵培养即为发酵生产，亦称深层培养或沉没培养。发酵液直接供作药用或供分离提取，也可以作液体菌种。传统液体发酵方法主要为摇床培养、吹气培养及发酵罐三种方法:摇床培养具有设备占用空间大、噪音大等缺点，而且摇床要配合500mL三角瓶使用，单瓶容量低，影响菌种产量；吹气培养具有生产成本高、生物量低、工艺复杂、易染杂菌等缺点，而且一旦感染杂菌会使整批液体菌种感染，严重影响生产进度；发酵罐培养为搅拌与吹气培养相结合，但操作复杂、体量大应用不灵活。
磁力搅拌是利用永磁体与搅拌子相互作用对目标液体进行搅拌的一种方法，通常用磁力搅拌器与搅拌子配合使用。将液体倒入容器，同时将搅拌子放入液体中，当磁力搅拌器工作时，带动搅拌子成圆周循环运动从而达到搅拌液体的目的。近年来，蛹虫草的保健功能越来越得到人们的认可，产量一直不断增加，但随着生产规模的扩大，液体菌种的产量受限于技术原因，生产量一直较低。
【发明内容】
为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用磁力搅拌器培养蛹虫草液体菌种的方法，采用本发明能够提高蛹虫草液体菌种的产量和生产效率。
本发明的技术方案是:一种利用磁力搅拌生产蛹虫草液体菌种的方法，如下:
(1)、培养液的配制:土豆200g、葡萄糖20g、蛋白胨10g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁lg、柠檬酸三铵lg、维生素B1 0.05g，加水配制成IL培养液；
(2)、将培养液倒入玻璃瓶中；其有益效果是:把培养液进行分装，防止整批菌种感染杂菌影响生产进度。
(3)、在培养液中放入搅拌子，用无菌透气封口膜封口，灭菌；其有益效果是:搅拌子灭菌后配合磁力搅拌器培养蛹虫草液体菌种。
(4)、培养液冷却至室温，将蛹虫草母种接种在培养液中；其有益效果是:操作简便，降低由于操作原因引起感染杂菌的几率。
(5)、把接种后的培养液于培养室中20°C避光静置24小时，然后放在磁力搅拌器上300转/分钟、暗培养3?5天。其有益效果是:使菌丝充分与培养液及空气接触，提高培养效率、节省空间。
本发明同已有技术相比可产生如下积极效果:
1.本发明申请人通过研究发现，利用磁力搅拌生产蛹虫草液体菌种可以大大缩短液体菌种的生产周期，由原来的6?7天缩短到3?5天。
2.相比摇床培养本发明可充分利用空间，在生产房间高度允许的情况下，配合支架摆放可放置5到7层，而摇床由于设备本身原因只能摆放I到2层。
3.相比摇床培养本发明生产量更大，每瓶一次可生产I?2L液体菌种。而摇床培养由于设备限制最大只能用500mL摇瓶，每瓶一次只可生产200?300mL液体菌种。
4.相比吹气法培养本发明具有操作简单、感染杂菌率底等优点。
5.相比摇床培养和吹气法培养，本发明外力对菌丝的搅拌更加直接，搅拌子在培养液内对菌丝直接进行搅拌，在不破坏菌丝生理结构的前提下让菌丝更加零散，相同时间内菌丝繁殖的基数更大，可以使整瓶菌液的菌龄更加一致，生长更加快速。
6.相比发酵罐培养，本发明投入小，利用空间更加充分，应用更加方便、灵活，降低了灭菌难度和步骤，操作简单容易掌握。
【附图说明】
图1不同培养天数菌丝生物量图；
图2不同培养转速菌丝生物量图；
图3不同培养转速菌丝生物量图。
【具体实施方式】
下面结合附图举例对本发明作进一步说明。
实施例1:
为了确定本发明的最佳技术参数和验证本发明的技术效果，设计三组实验，具体方法如下: 一、利用磁力搅拌培养蛹虫草液体菌种最佳培养时间的确定
1、培养液的配制
取土豆200g，去皮切块加水煮熟，用8层纱布过滤土豆液，分别称取葡萄糖20g、蛋白胨10g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁lg、梓檬酸三钱lg、维生素B1 0.05g溶于土豆液，并加水定容至IL0
2、分装
将配制好的培养液分装至直径12cm，高30cm的玻璃瓶中，IL/瓶。并在瓶中放入一颗5cm的搅拌子，用无菌透气封口膜和橡皮筋封口，121°C灭菌20min。
3、接种
灭菌后待瓶中培养液冷却至室温，在超净工作台中将活化后的蛹虫草母种接种在培养液中。
4、培养
把接种后的培养液置于培养室中20°C避光静置24h，然后分别放在磁力搅拌器上600r/min避光培养，培养天数设置7个梯度，分别为:ld、2d、3d、4d、5d、6d、7d，每个梯度设3个重复。
5、生物量测定
把培养后的液体菌种5000r/min离心弃上清液，加入清水，5000r/min离心弃上清液，重复两次，把菌丝放入烘箱50°C烘干，称重。计算不同梯度每瓶菌丝生物量的平均值如图1o
结果:通过所得数据和观察得出，第3天菌丝生物量达到最大值，第4天菌丝生物量比较稳定，第5天有少量菌丝开始自溶，第6天时有大量菌丝自溶。因此认定利用磁力搅拌培养蛹虫草液体菌种最佳培养时间为3d。
实施例2:
利用磁力搅拌培养蛹虫草液体菌种最佳培养转速的确定
1、培养液的配制
取土豆200g，去皮切块加水煮熟，用8层纱布过滤土豆液，分别称取葡萄糖20g、蛋白胨10g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁lg、梓檬酸三钱lg、维生素B1 0.05g溶于土豆液，并加水定容至IL0
2、分装
将配制好的培养液分装至直径12cm，高30cm的玻璃瓶中，IL/瓶。并在瓶中放入一颗5cm的搅拌子，用无菌透气封口膜和橡皮筋封口，121°C灭菌20min。
3、接种
灭菌后待瓶中培养液冷却至室温，在超净工作台中将活化后的蛹虫草母种接种在培养液中。
4、培养
把接种后的培养液置于培养室中20°C避光静置24h，然后分别放在磁力搅拌器上以不同转速避光培养3d，培养转速设置10梯度，分别为:100r/min、200r/min、300r/min、400r/min、500r/min、600r/min、700r/min、800r/min、900r/min、1000r/min，每个梯度设 3 个重复。 5、生物量测定
把培养后的液体菌种5000r/min离心弃上清液，加入清水，5000r/min离心弃上清液，重复两次，把菌丝放入烘箱50°C烘干，称重。计算不同梯度每瓶菌丝生物量的平均值如图2。
结果:通过所得数据和观察得出，培养转速为500r/min时生物量出现最大值，但300?600r/min之间无明显差异，随着培养转速的提高，生物量逐渐下降，可能是转速过快破坏了菌丝的生理结构，考虑更好的保护菌丝的生理结构，选择300r/min为利用磁力搅拌培养蛹虫草液体菌种的最佳培养转速。
实施例3:
利用磁力搅拌与其他方法培养蛹虫草液体菌种的对比试验
1、培养液的配制
取土豆200g，去皮切块加水煮熟，用8层纱布过滤土豆液，分别称取葡萄糖20g、蛋白胨10g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁lg、梓檬酸三钱lg、维生素B1 0.05g溶于土豆液，并加水定容至IL0
2、分装
将配制好的培养液分装至直径12cm，高30cm的玻璃瓶中，IL/瓶。并在用磁力搅拌方法培养瓶中放入一颗5cm的搅拌子。用无菌透气封口膜和橡皮筋封口，121°C灭菌20min。
3、接种
灭菌后待瓶中培养液冷却至室温，在超净工作台中将活化后的蛹虫草母种接种在培养液中。
4、培养
把接种后的培养液置于培养室中20°C避光静置24h，然后分别用磁力搅拌、摇床、吹气法三种方法培养，每个方法设3个重复。
5、生物量测定
把培养后的液体菌种5000r/min离心弃上清液，加入清水，5000r/min离心弃上清液，重复两次，把菌丝放入烘箱50°C烘干，称重。计算不同培养方法每瓶菌丝生物量的平均值如图3所示。
结果:通过所得数据和观察得出，在第三天时，应用于培养蛹虫草液体菌种的三种方法中，利用磁力搅拌培养蛹虫草液体菌种的生物量最高，为2.231g。
【主权项】
1.一种利用磁力搅拌生产蛹虫草液体菌种的方法，其特征在于，方法如下: (1)培养液的配制:土豆200g、葡萄糖20g、蛋白胨10g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁lg、柠檬酸三铵lg、维生素B10.05g，加水配制成IL培养液； (2)将培养液倒入玻璃瓶中: (3)在培养液中放入搅拌子，用无菌透气封口膜封口，灭菌； (4)培养液冷却至室温，将蛹虫草母种接种在培养液中； (5)把接种后的培养液于培养室中20°C避光静置24小时，然后放在磁力搅拌器上300转/分钟、暗培养3?5天。
【专利摘要】本发明涉及一种利用磁力搅拌培养蛹虫草液体菌种的方法。培养液的配制：土豆200g、葡萄糖20g、蛋白胨10g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g、柠檬酸三铵1g、维生素B1？0.05g，加水配制成1L培养液；将配制好的培养液倒入直径12cm，高30cm的玻璃瓶中，放入一个5cm的搅拌子，用无菌透气封口膜封口，121℃灭菌20min，待冷却至室温后在超净工作台中接种，接种后在磁力搅拌器上以300r/min培养3～5天。该方法制备蛹虫草液体菌种菌丝生长快、不染杂菌、操作简单、设备占用空间小。本发明克服了传统蛹虫草液体菌种制备方法的缺点，安全高效。
【IPC分类】C12R1/645, C12N1/14
【公开号】CN105087395
【申请号】CN201510553269
【发明人】张国财, 林连男, 张国珍, 邹传山, 赵博, 王婷玉, 毕冰, 赵金燕, 程功
【申请人】东北林业大学, 张国财
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月27日