专利名称：一种基于瓜环的核酸水解切割剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种核酸切割剂，具体属于一种基于瓜环的核酸水解切割剂。
背景技术：
作为遗传信息的携带者与基因表达的基础，核算在生物的生长、发育、繁殖等生命活动中具有十分重要的作用。2000年HGP的完成，标志着人类医药学将进入一个基因分子时代，困扰人类几千年的生命的秘密、遗传病、分子病、癌症、艾滋病以及血液供应、器官供应等都可找到科学的诠释和解决的出路。而这一切的核心是对DNA核酸分子的识别、剪裁、和连接。因此，人工核酸切割试剂的研究一直以来都是生物化学和分子生物学中最活跃的热点前言研究课题。核酸切割，就是通过化学反应将长链的核酸分子断裂成较短的碎片。研究核酸切割试剂具有非常重要的理论和应用价值。首先，对人工核酸切割试剂的切割机理的研究将大大有助于我们对核酸酶催化机理的透彻理解。其次，切割试剂在疾病的基因治疗中有十分重要的应用。而且，核酸切割试剂可以作为重要的分子生物学工具，可以用来研究核酸高级结构的探针。
关于人工核酸切割试剂，按照切割机理的不同，主要分为自由基切割试剂、酯水解切割试剂和消去型切割试剂，如下归类1、自由基机理切割核酸的试剂都能产生某种自由基进攻核酸的糖环或是碱基，夺去氢原子而导致其氧化破坏，进而使核酸链发生断裂。例如，EDTA-Fe2+/H2O2体系(Rokita，S.E.；Romero-Fredes，L Nucleic.Acids.Res.，1992，20，3069)、Cu2+/还原剂体系(Reed，C.J.；Douglas，K.T.Biochem.Biphys.Res.Commun.，1989，162，1111)、光化学切割体系(Carter，P.J.；Breiner，K.M.；Thorp，H.H.Biochemistry.，1998，37，13736)、抗生素(Burger，R.M.Chem.Rev.，1998，98，1153)等体系。该类切割试剂破坏核酸链上的某些戊糖环乃至核苷酸，结果使原有的信息部分丢失。因此，该类切割试剂存在切割的碎片很难被进一步利用、切割的专一性比较差、毒副作用强、体系复杂等诸多缺点。(万荣，赵刚，陈晶，麻远，赵玉芬， 科学通报，2000，45，785)。
2、消除机理切割核酸的试剂赖色赖三肽KWK(Behmoaras，T.；Toulme，J.J.；Helene，C.Nature，1981，292，858)可以通过消除的方式切割核酸。该类切割试剂极为少见，不具备普遍性。
3、以酯水解机理切割核酸的试剂切割试剂直接进攻提供某种亲核基团进攻核酸中磷酸二酯键的磷原子，从而发生亲核取代反应使得核酸水解。例如Cu(II)-L-组氨酸配合物按水解机理切割核酸(Ren，R.；Yang，P.；Zheng，W.J.；Hua，Z.C.Inorg.Chem.，2000，39，5454)；双核金属离子的络合物水解核酸(高飞，阴彩霞，杨频，科学通报，2004，49，1471)丝组二肽可以在中性条件下水解超螺旋型的DNA。(Li，X.H.；Wan，R.；Zhang，Q.et.a1.Clncinnati Section American Chemical Society，Cininnati，Ohio，1998，130)水解切割试剂排除了自由基切割试剂的多中缺陷，而且具备普遍性，可以说是人工水解酶的最佳的模拟天然核酸酶的切割系统。但迄今为止，能有效催化水解DNA的水解的人工酶体系相对较少的。而且，绝大部分是金属离子的络合物，这些含有金属离子的化学核酸酶，多数是要求有一个酸性的最佳pH以及这些酶的活性要受金属离子控制，这些都阻碍了它们在螯合缓冲液或者有金属螯合剂出现时的应用。因此，需要寻找不同类型的核酸酶，这种酶在pH＝7.0或pH＝7.0附近有一个最佳的pH，而且其发挥活性不需要金属离子。相对于含金属离子得水解切割试剂，不含金属离子的核酸切割试剂有其相对更为重要的理论意义和应用潜力(钟儒刚，赵丽娇，赵玉芬，化学学报，2004，62，2444)。在这里，我们开发了一种新型的不含金属离子的基于瓜环的DNA人工核酸酶。
发明内容
本发明的目的在于提供一种不含金属离子的高效的核酸水解切割剂。
本发明提供的核酸水解切割剂，是准轮烷分子化合物(pseudorotaxane)，它的化学分子式C36H36N24O12·C12H20N4·2X·nH2O，其中X＝Cl、H2PO4、HSO4、NO3、Br；n≥1；化学结构式(I) 本发明核酸切割剂，具体可用作分子生物学研究的人工核酸酶用于核酸切割，另外也可以进一步研究开发成基因治疗的药物。
本发明核酸水解切割剂的制备方法包括如下步骤(1)将甘脲，甲醛以摩尔比1∶2混合，在浓度为9摩尔/升的硫酸H2SO4溶液，70-75℃反应24小时，然后升温至95-100℃，继续反应12小时，冷却至室温，将反应液倒入10倍反应液体积的水中，加入6-10倍量体积的丙酮，析出白色固体，静置，抽滤收集所得固体。所得固体分散于一定体积的水中，加入等体积的丙酮，搅拌静置，抽滤所得白色固体用60℃的水充分洗涤后用少量丙酮淋洗，抽干后，真空干燥得白色固体，即为瓜环主体分子(cucurbit[6]uril)。反应式 (2)将咪唑加入四氢呋喃中溶解，再加入氢化钠混合，咪唑与氢化钠摩尔比1∶1.2-2，搅拌1-2小时，加入0.3-0.5倍咪唑摩尔数量的1，6-二溴己烷，搅拌12-24小时，减压除去溶剂得糊状固体，加入水使固体溶解，该溶液用氯仿(CHCl3)分三次充分萃取，合并氯仿液，用无水Na2SO4干燥，过滤，减压除去氯仿，得黄褐色油状液体，该液体为1，6-二咪唑基己烷；将1，6-二咪唑基己烷溶于体积比为1∶1的强酸溶液，回流1-3小时，减压浓缩溶液体积至1/3-1/5，加入四氢呋喃至析出白色固体，过滤干燥得客体分子1，6-二咪唑基己烷二酸盐(用G表示)。反应式 (3)将瓜环主体分子和1，6-二咪唑基己烷二酸盐客体分子G按照摩尔比1∶1-1.2混合，加入蒸馏水溶解，搅拌12-24小时；减压浓缩至溶液体积为起始体积的1/3-1/5，加入6-10倍量体积的四氢呋喃，析出白色固体，抽滤收集该固体，用少量丙酮淋洗，真空干燥，得准轮烷分子化合物(用P表示)。反应式
本发明准轮烷分子化合物，其中包括瓜环(C36H36N24O12，cucurbit[6]uril)主体分子和客体分子1，6-二咪唑基己烷二盐酸盐(G1)、1，6-二咪唑基己烷二磷酸盐(G2)、1，6-二咪唑基己烷二硫酸盐(G3)，1，6-二咪唑基己烷二硝酸盐(G4)、1，6-二咪唑基己烷二氢溴酸盐(G5)所分别形成的准轮烷分子化合物(分别用P1、P2、P2、P4、P5表示)。
本发明准轮烷分子化合物可用作分子生物学研究的人工核酸酶用于核酸切割，切割的条件是将切割试剂溶于一定pH值缓冲体系成溶液，然后与切割底物混合，并使缓冲剂和底物的终浓度保持在一定范围内，置于一定温度下保温，实现对底物核酸的切割。本发明的切割试剂是一类不含金属离子的高效的核酸水解切割剂，在生理条件下，在较低的浓度下，较短的时间内可以对核酸进行切割。本发明的切割试剂也可以在制备基因治疗药物中应用，进一步用于基因治疗药物的研究开发。
本发明核酸水解切割剂准轮烷分子化合物对DNA的切割溶液的配制
(1)0.5M EDTA(pH8.0)溶液的配制在800ml蒸馏水中加入181.6g二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2·2H2O)，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节pH值至8.0，然后定容至1000ml.分装后高压灭菌备用。
(2)Tris-乙酸(50×TAE)电泳缓冲液的配制242gTris(三羟甲基氨基甲烷)碱和57.1ml丙乙酸溶解于100ml 0.5M的EDTA溶液中，加去离子水调至1000ml。
(3)反应缓冲液的配制1.2lgTris溶于800ml去离子水中。加入0.363gNaCl，用浓盐酸调pH为7.18定容至1000ml配制成10mM Tris，6.2mM NaCl溶液备用。
(4)EB溶液称取EB(溴化乙啶)0.1g于棕色瓶中，以100ml去离子水溶解并定容，贮存于冰箱4℃保存备用。
(5)酶解终止液的配制0.05％溴酚蓝，50％(v/v，体积比)甘油水溶液，0.1M EDTA(6)切割试剂的配制用所配制的缓冲溶液配制5mM的切割试剂溶液。
切割实验(1)混合反应取洁净的Eppendorf管，分别依次加入预定量的缓冲溶液双蒸水、切割剂、质粒DNA(pBR 322DNA)，用离心机将所有的成分甩至Eppendorf管底部，使终浓度分别为Tris-HCl10mM；切割试剂150μM；pBR 322DNA0.014mg/mL，放在恒温37℃的水浴中避光反应4小时。
(2)凝胶制备称取0.32gAgarose(琼脂糖)加50×TAE0.8ml，加双蒸馏水至40ml，微波炉加热2min使其完全溶解，待溶液温度降至约70℃时，加EB溶液25μL，使EB终浓度约为0.5μg/ml，摇匀。温度进一步降至40-50℃左右时，迅速倒入放好梳孔和挡板的平板电泳床中，待凝固后，注入电泳缓冲液，慢慢的拔去梳子和挡板。
(3)电泳待测反应体系在37℃水浴恒温槽中恒温一定时间后，将其恒温槽中取出，各加入4μL溴酚蓝指示剂，用微量进样器将Eppendorf管内的溶液分别点样于平板电泳床的点样空中，电压50V条件下跑2-3h，看到指示剂已移动到凝胶中部，切断电源，取出凝胶，在SYNGENE GENE GENIUS BIO IMAGING SYSTEM凝胶成像系统仪上进行摄像。
图1不同浓度的切割试剂P1切割pBR 322DNA的电泳图。
10mM Tris-HCl，6.2mM NaCl，pH7.18在37℃恒温4h；泳道1DNA对照；泳道2-5分别10μM，25μM，50μM，150μM的切割试剂。分析结果见表1。
图2浓度为150μM的切割试剂P1、P2、P3、P4、P5对pBR 322DNA切割电泳图。
10mM Tris-HCl，6.2mM NaCl，pH7.18在37℃恒温4h；泳道1DNA对照。
具体实施例方式实施例1-5为切割剂制备实施例；实施例6-10切割剂切割DNA实施例。
实施例1步骤一.主体瓜环分子的合成11.4g甘脲(80mmol)于100ml四口圆底烧瓶中，加入40ml浓度为9M(摩尔/升)的硫酸H2SO4溶液，油浴升温至70℃，开始滴加14ml，37％的甲醛水溶液，滴加时注意保持温度在70-75℃之间，滴加完毕后保温70-75℃反应24小时，然后升温至95-100℃，继续反应12h后，冷却至室温，将反应液倒入400ml水中，加入丙酮2L，析出白色固体，静置20min后，抽滤收集所得固体。所得国体分散于200水中，加入丙酮200ml，搅拌20min，静置，抽滤所得白色固体用60℃的水300ml洗涤三次后用约50ml丙酮淋洗，抽干后，白色固体真空干燥的6.5g，产率，48％。
步骤二.客体分子1，6-二咪唑基己烷二盐酸盐(G1)的合成50ml的单口圆底烧瓶中加入20ml干燥的四氢呋喃(THF)液，加入1.5g咪唑，搅拌溶解后，慢慢分次加入95％的NaH，室温搅拌2h后，反应体系呈悬浊液，然后加入2.44gl，6-二溴己烷，室温搅拌24h后处理。减压除去溶剂得糊状固体，加入100ml水，固体溶解呈淡黄色溶液，该溶液用120ml氯仿(CHCl3)分三次萃取，合并氯仿液，用无水Na2SO4干燥4h，过滤，将氯仿溶液减压除去，得黄褐色油状液体，该液体为1，6-二咪唑基己烷。将1，6-二咪唑基己烷溶于10ml水中，加入10ml浓盐酸，回流2h，减压浓缩溶液体积为5ml左右，加入四氢呋喃30ml，析出白色固体，得客体分子G1，1，6-二咪唑基己烷二盐酸盐。1HNMR核磁共振(300MHz，25℃，D2O，TMSP)δ8.71(s，2H)，7.50(s，1H)，7.46(s，1H)，4.23(t，4H，CH2)，1.89(m，4H，CH2)，1.33(m，4H，CH2)；13C NMR(300 MHz，D2O)δ134.13，121.56，119.48，49.05，28.94，24.75；元素分析(calcd.％)for C12H20N4Cl2C，49.48；N，19.24；H，6.87.FoundC，49.86；N，19.44；H，6.53.
步骤三.切割试剂超分子化合物准轮烷分子P1的合成50ml的单口圆底烧瓶，加入12lmg(0.1mmol)的瓜环，29.2mg(0.1mmol)的客体分子G1，加入20ml蒸馏水，80℃保温搅拌24h。冷却，减压浓缩溶液体积为5ml左右，加入四氢呋喃30ml，析出白色固体，抽滤收集该固体，用少量丙酮淋洗，真空干燥，得准轮烷分子化合物P1，产率86％。1HNMR核磁共振(300MHz，25℃，D2O，TMSP)δ9.16(s，2H)，7.92(s，2H)，7.37(s，2H)，5.78(d，12H)，5.58(s，12H)，4.32(d，12H)，3.99(t，4H)，1.18(m，4H)，0.57(m，4H)；13C NMR(300MHz，D2O)δ155.8，135.2，123.3，116.8，71.1，51.2，48.6，28.6，27.3；ESI-MS电喷雾质谱608.7为双电荷阳离子，1215.4为单电荷阳离子.元素分析(calcd.％)for C36H36N24O12·C12H20N4·2Cl·8H2OC，40.22；N，27.37；H，5.03.FoundC，39.99；N，27.12；H，4.97.晶体为单斜晶系，P2l/c空间群，a＝12.369(4)，b＝20.115(6)，c＝12.578(4)，β＝113.664°，V＝2866.3(15)，Z＝2，Dc＝1.659g·cm-3，Rint＝0.0223，F(000)＝1500，M＝1432，偏差因子为R1＝0.0664，wR2＝0.1900实施例2步骤一. 重复实施例1步骤一，得所用主体瓜环。
步骤二. 用浓磷酸替代实施例1步骤二所用浓盐酸获得客体分子G2，1，6-二咪唑基己烷二磷酸盐。元素分析(calcd.％)for C12H24N4P2O8C，34.78；N，13.53；H，5.80.FoundC，34.91；N，13.74；H，5.73.
步骤三.用客体分子G2替代客体分子G1，重复实施例1步骤三，得准轮烷分子化合物P2，产率86％。元素分析(calcd.％)for C36H36N24O12·C12H20N4·2H2PO4·12H2OC，35.42；N，24.11；H，5.17.FoundC，35.59；N，24.32；H，5.07.
实施例3步骤一. 重复实施例1步骤一，得所用主体瓜环。
步骤二. 用浓硫酸替代实施例1步骤二所用浓盐酸获得客体分子G3，1，6-二咪唑基己烷二硫酸盐。元素分析(calcd.％)for C12H22N482O8C，34.78；N，13.53；H，5.31.FoundC，34.78；N，13.64；H，5.22.
步骤三. 用客体分子G3替代客体分子G1，重复实施例1步骤三，得准轮烷分子化合物P2，产率84％。元素分析(calcd.％)for C36H36N24O12·C12H20N4·2HSO4·10H2OC，36.23；N，24.65；H，4.91.FoundC，36.39；N，24.72；H，4.88.
实施例4步骤一. 重复实施例1步骤一，得所用主体瓜环。
步骤二. 用浓硝酸替代实施例1步骤二所用浓盐酸获得客体分子G4，1，6-二咪唑基己烷二硝酸盐。元素分析(calcd.％)for C12H20N6O6C，41.86；N，24.41；H，5.81.FoundC，41.96；N，24.44；H，5.93.
步骤三. 用客体分子G4替代客体分子G1，重复实施例1步骤三，得准轮烷分子化合物P4，产率88％。元素分析(calcd.％)for C36H36N24O12·C12H20N4·2NO3·9H2OC，38.35；N，27.96；H，4.93.FoundC，38.39；N，28.02；H，5.03.
实施例5步骤一. 重复实施例1步骤一，得所用主体瓜环。
步骤二. 用氢溴酸替代实施例1步骤二所用浓盐酸获得客体分子G5，1，6-二咪唑基己烷二氢溴酸盐。元素分析(calcd.％)for C12H20N4Br2C，37.89；N，14.74；H，5.26.FoundC，37.86；N，14.69；H，5.35.
步骤三. 用客体分子G5替代客体分子G1，重复实施例1步骤三，得准轮烷分子化合物P5，产率91％。元素分析(calcd.％)for C36H36N24O12·C12H20N4·2Br·8H2OC，37.89；N，25.78；H，4.73.FoundC，37.48；N，25.42；H，4.61.
实施例6在生理条件下，当质粒pBR 322DNA与切割试剂P1，37℃恒温4小时后，超螺旋DNA降解为三种形态，由超螺旋supercoiled(S)变为缺刻nicked circular(C)，继而降解转变为线型linear(L)。如图1所示DNA的起始浓度为0.05mg/ml，切割试剂P1的浓度范围是0～150μM。随着P1浓度的增加，可以看到质粒pBR 322DNA从超螺旋S逐渐转变为缺刻C和线型L，最终超螺旋S几乎全部转变为缺刻C和线型L。转变的结果见表1。由此结果可以看出当切割剂P1浓度为150μM时为切割的最佳浓度。
实施例7在实施例1的基础上，选取最佳的实验条件，将切割试剂的浓度定为150μM，其余的条件重复实施例1中条件，用P2替代实施例1中的P1所的切割图见图2泳道P2。
实施例8在实施例1的基础上，选取最佳的实验条件，将切割试剂的浓度定为150μM，其余的条件重复实施例1中条件，用P3替代实施例1中的P1所的切割图见图2泳道P3。
实施例9在实施例1的基础上，选取最佳的实验条件，将切割试剂的浓度定为150μM，其余的条件重复实施例1中条件，用P4替代实施例1中的P1所的切割图见图2泳道P4。
实施例10在实施例1的基础上，选取最佳的实验条件，将切割试剂的浓度定为150μM，其余的条件重复实施例1中条件，用P5替代实施例1中的P1所的切割图见图2泳道P5。
表1、不同浓度的切割试剂P1切割pBR 322DNA
基于上述的实验结果，本发明所指的切割试剂可用作分子生物学研究的人工核酸酶用于核酸切割，可以进一步研究开发成基因治疗的药物。
权利要求
1.一种核酸水解切割剂，其特征在于它是准轮烷分子化合物，它的化学分子式C36H36N24O12·C12H20N4·2X·nH2O，其中X＝Cl、H2PO4、HSO4、NO3、Br；n≥1；它的化学结构式(I)
2.按照权利要求1所述的一种核酸水解切割剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)用甘脲，甲醛在酸溶液条件下制备瓜环主体分子；(2)将咪唑加入四氢呋喃中溶解，再加入氢化钠混合，咪唑与氢化钠摩尔比1∶1.2-2，搅拌1-2小时，加入0.3-0.5倍咪唑摩尔数量的1，6-二溴己烷，搅拌12-24小时，除去溶剂得糊状固体，加水溶解，用氯仿充分萃取，干燥，过滤，除去氯仿，得1，6-二咪唑基己烷；将1，6-二咪唑基己烷溶于强酸溶液，回流，浓缩，加入四氢呋喃，析出白色固体，过滤，干燥得1，6-二咪唑基己烷二酸盐客体分子；(3)将瓜环主体分子和1，6-二咪唑基己烷二酸盐客体分子按照摩尔比1∶1-1.2混合，加入蒸馏水溶解，搅拌12-24小时；浓缩，加入四氢呋喃析出白色固体，抽滤收集该固体，干燥，得准轮烷分子化合物。
3.按照权利要求1所述的一种核酸水解切割剂的用途，用作分子生物学研究的人工核酸酶用于核酸切割。
4.按照权利要求1所述的一种核酸水解切割剂的用途，在制备基因治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及瓜环(cucurbit[6]uril)与1，6－二咪唑基二酸盐所生成的准轮烷分子化合物，它的化学分子式C
文档编号A61K48/00GK1935829SQ20061004839
公开日2007年3月28日 申请日期2006年9月30日 优先权日2006年9月30日
发明者霍方俊, 阴彩霞, 杨频 申请人:山西大学