专利名称：一种人工核酸水解酶及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种人工核酸水解酶，本发明还涉及该 人工核酸水解酶的制备方法。
背景技术：
在生理和非酶催化条件下，核酸中的磷酸二酯键是相当稳定的。现在广泛使用的 限制性内切酶识别位点一般为少数几个核苷酸，而且只能在特定位点断裂核酸，其使用受 到一定限制。化学合成的DNA/RNA定位断裂化合物是国际上发展起来的水解工具，它们能 有效进攻和水解磷酸二酯键并生成5’ -，3’ -寡核苷磷酸。人工核酸酶能够有效清除细菌和 病毒等致病微生物的污染；另外在现代分子生物学如反义核酸、基因沉默和RNA干扰等技 术中有非常重要的应用价值。人工核酸水解酶是化学合成的一类过渡金属化合物，通常情况下为铜、铁、钴、镍、 锌、铈、镧系金属配合物。现有的人工核酸水解酶存在以下的不足首先配合物金属中心 的配位数高、空间位阻大，它们与核酸结合的亲和力较弱，通常只能水解分子量小的寡核苷 酸；其次配合物的溶解性差，导致了对核酸的催化水解反应的速率慢、时间长，同时水解反 应效率也低(通常不大于36%)；另外现有的核酸水解反应通过氧化型的途径进行，反应过程 复杂。人工合成的金属配合物在体外催化核酸水解时，在反应体系中需要添加氧化物，形成 了大量的自由基；现有的水解技术需要的条件十分苛刻，通常在加热、紫外线照射、并有强 酸介质参与下完成；最后，因为现有金属配合物缺乏核酸的选择性识别因子，通常存在选择 性低、特异性差的缺点，与核酸作用时几乎所有的磷酸二酯键均发生断裂。近年来的研究热点转向水解型核酸的断裂。这种途径能够极大地提高核酸的降解 速率，其速率常数可增加IO17倍；同时反应条件温和，在模拟生理条件下(pH 7.0，37 ° C) 即可实现反应。在水解型的途径中，对核酸酶的设计尤其关注结合位点和水解中心的选择 性。核酸水解酶应该同时具备以下三个结构组件水解中心如金属配合物，生物连接和靶向 识别基团。然而，这类人工核酸水解酶的分子设计仍然面临极大的挑战。在研究工作中，很 难得到同时满足以上结构组件的金属配合物。利用水解型人工核酸切割酶的靶向识别和生 物连接基团，按照特定的序列选择性连接到核酸的高级结构区域，金属配合物进一步攻击 并水解附近的磷酸二酯键。不同的核酸碱基序列编码特定的氨基酸或短肽，依据天然的编 码特性，在配合物中设计氨基酸或短肽基团可以提高对核酸的靶向识别功能。另一方面，金 属配合物的氨基酸或短肽基团可以增加对核酸的生物适应性、减小毒副作用，更好地应用 在分子生物学技术中。此外，由于核酸中的η电子插入是常见的有效连接方式，因此通过 引入含氮原子的共轭碱(如大环、并环的咪唑、邻二氮杂菲、哌嗪及其含杂氮原子的内酯)基 团可以有效提高对核酸的连接功能。目前，具备以上功能要素的金属配合物不易通过化学 手段合成，相关的研究报道非常少。金属配合物的物化特性决定了核酸水解酶的活力。溶解度和相对分子量是人工核 酸酶高效利用的制约因素。人工核酸酶的溶解度小，在溶液介质中容易合成并分离到纯化产品。然而溶解度小，金属配合物对水溶性核酸的亲和力通常也小，导致水解酶的活力不 高。与此相反，金属配合物的溶解度大，在溶液介质中不易得到合成产物。通过现有的分离、 提纯手段如挥发法、扩散法等较难达到纯化目的。通常情况下，金属配合物的收率也很低。 此外，相对分子量大不利于金属配合物对核酸进行有效的连接。现有的研究工作仍未解决 人工核酸酶的溶解度、分子大小和活力之间的制约关系。在核酸酶的应用技术中，通过化学、仪器分析方法检测断裂产物。光吸收和电化学 测定、粘度和凝胶电泳分析是常采用的分析方法。例如，测定核酸水解前后的光吸收(紫外 和荧光)强度的变化只能间接表征断裂碎片。在核酸水解的过程中，酶催化剂与反应介质 不能够实现较好地分离，金属配合物的η电子连接基团会对核酸及其水解产物的光吸收 强度产生很大的干扰。因此，该方法在实际应用中具有很大的局限性。采用凝胶电泳检测 核酸断裂碎片，实验步骤繁琐、费时，很难在金属配合物催化水解核酸的反应中实现动态监 测。目前，对于核酸水解产物的检测，仍然缺乏直观、快捷和简便的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是根据现有人工核酸酶的溶解度、分子结构、大小和 活力之间的制约关系，提供了一种人工核酸水解酶及其制备方法。在水相中通过一步化学反应由氯化铜(或氢氧化铜)、甘氨酸(或缩甘氨酸)和π电 子基团合成水溶性的功能金属配合物，所得产物为平面或四方锥构型，对核酸有很强的插 入和水解能力，同时具有很强的序列选择性和连接能力，利用混合溶剂挥发法，加快产物的 结晶效率，提高纯度和收率。在模拟生理条件下(ρΗ 7. 0，37 ° C)，利用合成的铜配合物实现酵母转录 RNA (tRNA)的快速、高效切割。反应为水解型途径，序列选择性的水解产物约为8-12个寡 核苷酸碎片、切割效率大于90%，能有效地应用在致病性微生物的清除以及现代分子生物学 的技术中。通过现代分析仪器，建立一种核酸水解产物的快速、简便的动力学检测手段。使用 毛细管电泳方法，能实现水解产物的及时、动态的检测，获得定性、定量的分析结果；利用原 子力显微扫描方法能直观观察并分析切割碎片的形貌和大小。人工核酸水解酶，包括人工核酸水解酶I甘氨酸铜邻二氮杂菲，分子式 C14H19Cl1Cu1N3O6,分子量 424. 32，单元池参数 a 7.0100 (14)、b 12.304 (3)、c 20.879 (5)、b 104.31(3)，空间群P21/c ；人工核酸水解酶II，甘氨酰甘氨酸铜1-甲基咪唑， 分子式 C8H13Cu1N4O4,分子量四2·76，单元池参数 a 7. 0981 (14)、b 8. 2360 (16), c 11. 257(2) ,b 88. 99 (3)，空间群 P-1。本发明是通过以下技术方案实现的
人工核酸水解酶的制备方法，包括以下步骤
(1)制备人工核酸水解酶I将甘氨酸、1，10-邻二氮杂菲和氯化铜按摩尔比1 1 1在 水相中搅拌混合，在C条件下反应30分钟，冷却至室温后过滤；
(2)制备人工核酸水解酶II将甘氨酰甘氨酸、1-甲基咪唑和新制的氢氧化铜按摩尔 比1 1 1搅拌混合在水相中，加热到55° C后反应30分钟，冷却后过滤；
(3)分别将步骤(1)和步骤(2)所制得的滤液按体积比1:3与N，N-二甲基甲酰胺)
4混合后，溶液出现混浊现象，然后逐滴滴加水后转为透明溶液，再次滴加3-5滴水后静置挥 发，其中步骤(1)产物静置挥发7天后得到紫色单晶分人工核酸水解酶I，甘氨酸铜邻二 氮杂菲，分子式 C14H19Cl1Cu1N3O6,分子量 424. 32，单元池参数 a 7.0100 (14)、b 12.304 (3)、c 20.879 (5)、b 104.31(3)，空间群P21/c ；步骤(2)产物静置挥发10天后得到 紫色单晶人工核酸水解酶II，甘氨酰甘氨酸铜1-甲基咪唑，分子式C8H13Cu1N4O4,分子量 292.76，单元池参数 a 7.0981 (14)、b 8.2360 (16)、c 11. 257(2), b 88.99 (3)，空间 群 P-I。步骤(1)所述的氯化铜可以用氢氧化铜代替。所述的甘氨酸可以用缩甘氨酸代替。步骤(2)所述的氢氧化铜可以用氯化铜代替。tRNA水解在tRNA储备液中，按1. 0 mg tRNA: 1. 0 mmol :1. Ommol配合物比例分 别滴加本发明所得到的人工核酸水解酶I和人工核酸水解酶II，在搅拌条件下，于4 ° C 下反应36小时，反应时通入高纯氩气，然后滴加乙醇停止反应，复合物沉淀过滤、乙醇洗涤 后低温真空干燥，准确称量一定质量复合物，配成1.0 mg/ml磷酸缓冲体系，在37° C条件 下进行水解，记录反应时间，定期取样进行毛细管电泳分析，反应完毕后，取样进行原子力 显微扫描测定。在线检测和原子力显微扫描高效毛细管电泳分析在20° C下进行，使用量程 为+30kV直流高压电源，在毛细管进样的一端供给+15kV的电极电位，根据荷质比大小在 不同的时间间隔流出毛细管另外一端。通过紫外检测器跟踪流出组分。样品采用电进 样方法注入毛细管柱。依据停留时间和流出峰面积对核酸切割碎片分别进行定性、定量 分析；核酸切割产物的原子力显微扫描的频率为1-3 Hz0测定采用敲击模式完成，标准 探针为RTESP 7 (Veeco, USA)，平均共振频率九=273. 77 kHz。制样基片采用绿云母片 (Ashville-Schoonmaker Mica, Mewport New, VA, USA)。测定在 20 ° C 和相对湿度低于 55 %条件下进行。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
(1)本发明所得到的配合物中心铜分别采用立体四方锥和平面四边形构型，如图1和 图2所示，赋有tRNA靶向识别(甘氨酸和甘氨腺甘氨酸)和生物连接(邻二氮杂菲和1-甲 基咪唑)基团，对核酸具有很强的结合常数，分别为2. 06X 105和LMXlO5 M—1，这些结合 常数远大于氧化型RNA水解酶的结合平衡常数(通常为XlO3 Μ"1)；
(2)在温和实验条件下，本发明所制得的铜配合物能够实现对核酸有效的催化切割， tRNA的水解效率分别为97. 0% (76小时，见图3)和90% (119小时，见图4)，因此它们为优 良的人工核酸水解酶；
(3)在线检测和显微扫描技术显示，tRNA经本发明所制得的铜配合物催化水解后，毛细 管电泳分析结果，分别见图5中d曲线和图6中f曲线，显示主要组分为低分子量的寡核苷 磷酸，原子力显微扫描结果显示，水解前的tRNA为连接螺旋构型，见图7 ；水解后切割产物 显示首尾间隔的碎片结构，分别见图8和图9，碎片约为8-12个核苷磷酸寡聚物，属序列选 择性的切割。
图1甘氨酸铜邻二氮杂菲的分子结构；
图2甘氨酰甘氨酸铜1-甲基咪唑的分子结构； 图3甘氨酸铜邻二氮杂菲的催化水解效率； 图4甘氨酰甘氨酸铜1-甲基咪唑的催化水解效率；
图5 tRNA切割反应的毛细管电泳分析结果(催化剂甘氨酸铜邻二氮杂菲，a 0小时， b 24小时，c 48小时和d 72小时水解)；
图6 tRNA切割反应的毛细管电泳结果(催化剂甘氨酰甘氨酸铜1-甲基咪唑，a 0小 时，b 19小时，c 45小时，d 79小时，e 108小时和f 129小时水解)； 图7 tRNA原子力显微扫描图片；
图8 tRNA切割碎片原子力显微扫描图片(催化剂甘氨酸铜邻二氮杂菲)； 图9 tRNA切割碎片原子力显微扫描图片(催化剂甘氨酰甘氨酸铜1-甲基咪唑)。
具体实施例方式人工核酸水解酶的制备方法，包括以下步骤
(1)制备人工核酸水解酶I将甘氨酸(或者缩甘氨酸)、1，10-邻二氮杂菲和氯化铜(或 者氢氧化铜)按摩尔比1:1:1在水相中搅拌混合，在55° C条件下反应30分钟，冷却至室 温后过滤；
(2)制备人工核酸水解酶II将甘氨酰甘氨酸、1-甲基咪唑和新制的氢氧化铜(或者氯 化铜)按摩尔比1 1 1搅拌混合在水相中，加热到55° C后反应30分钟，冷却后过滤；
(3)分别将步骤(1)和步骤(2)所制得的滤液按体积比1:3与N，N-二甲基甲酰胺) 混合后，溶液出现混浊现象，然后逐滴滴加水后转为透明溶液，再次滴加3-5滴水后静置挥 发，其中步骤(1)产物静置挥发7天后得到紫色单晶分人工核酸水解酶I，甘氨酸铜邻二氮 杂菲，子式 C14H19Cl1Cu1N3O6,分子量 424. 32，单元池参数 a 7. 0100 (14)、b 12.304 (3)、 c 20.879 (5)、b 104.31(3)，空间群P21/c ；步骤(2)产物静置挥发10天后得到紫色单晶 人工核酸水解酶II，甘氨酰甘氨酸铜1-甲基咪唑，分子式C8H13Cu1N4O4,分子量四2. 76，单 元池参数 a 7.0981 (14)、b 8.2360 (16), c 11. 257 (2), b 88.99 (3)，空间群 P-1。人工核酸水解酶I 名称甘氨酸铜邻二氮杂菲，分子式C14H19Cl1Cu1N3O6,分子 量 424. 32，单元池参数 a 7.0100 (14)、b 12.304 (3)、c 20.879 (5)、b 104.31(3)， 空间群P21/c，晶系单斜；人工核酸水解酶1为紫色晶体，在水中的溶解度最大 (64mg/100ml)，可溶于甲醇、乙醇和丙酮等极性溶剂。晶体学数据和结果
选取尺寸为0.35 mmXO. 28 mmXO. 20 mm深蓝色长方形单晶，在室温下将其置于 Rigaku Raxis-IV X-射线单晶衍射仪上，使用经石墨单色器单色化了的Mo-K3射线Q= 0. 071073 nm)，以ω /2 0扫描方式在1. 94 ° < 0 <26. 96 °范围内共收集衍射点7588个，独 立衍射点3503个OPint= 0. 0313)，其中，可观测点3302个[/>2 σ (I)J0用于晶体结构解 析的全部强度数据经Zp因子及吸收校正。收集的数据实用软件SAINT来进行还原，吸收系 数通过SADABS软件来校正。全部氢原子均由差值Rmrier合成得到。晶体结构采用直接 法使用SHELXTL软件采用直接法解出，使用全矩阵最小二乘法对非氢原子坐标和温度因子进行修正，氢原子则通过理论计算加入。V = 1744.8(6) A3, Z = A, Dc= 1.482 mg ·πΓ3，μ = 1.411 mnT1，尸(000) = 804， 结构因子 W = 0.0890，wR= 0.2254，其中 r = l/{o2if) + (0· 0837/7) 2+5· 7772P]，P = if + 2^c2)/3,最佳吻合因子S = 1.290。差值Rmrier图中残余最高电子密度峰Pmax= 1.420 e - Α"3,最低为Pmin= -0.747 e · A_3。原子散射因子和反常散射系数取自国际晶 体学表。
表1-1.氢键和C-H…/7分子间相互作用*
D-H---ASymmetryD--A(A)BD-H...A(° )Ν(3)-Η(3Α)···0(2)-1/2-χ, 1/2+y, 1/2-ζ3. 1167136. 64N (3)-H(3Β)…O(IW)Ι/2-j-, 1/2+j, 1/2-ζ3. 0550167.17C(2)-H(2)...0(3W)-l/2+jr, 1/2-7，1/2+ζ3. 4314166. 63C(3)-H(3)...0(2)l/2+jr, 1/2-7，1/2+ζ3. 3838160. 41C(9)-H(9)... Cl(I)1-ζ, 1-7，1-Z3. 5551142. 79C (9)-H (9)…Cg (2)1—ζ, 1—7，ι—ζ3. 61996. 19
*Cg (2) Cu(I) -N(I) -C (5) -C (6) -N(2) 表1-2.晶体结构数据
EmpiricalformulaC14H19Cl1Cu1N3O6Formulaweight424. 32Temperature566 (2) KWavelength0. 71073ACrystalsystem, spacegroupMonoclinic, P21/cUnitcelldimensionsa=l. OlOO(H)A a=90°b=\2. 304(3)A 办=104.31(3)°c=20. 879(5)A ^=90°Volume1744. 8 (6) A3Ζ, Calculateddensity4，1. 482Mg/m3Absorptioncoefficient1. 411 mnf1,(000)804θ rangefordatacolIection1.94to26. 96°Limitingindices-8 彡 h 彡 8，-12 彡 k 彡 15, -22 ^ 1 ^ 25RefIectionscollected/unique7588/3503[R(int)=0. 0313]RefinementmethodFull-matrixleast-squareson/^Data/restraints/parameters3503/0/217Goodness-of-f iton/^1. 290FinaLWndices [/>2 σ (/)]Rl=O.0890, wR2=0. 2254"indices(alldata)Rl=O.0937, wR2=0. 2285Largestdiff. peakandhole1. 420and-0. 747e. ^3
表1-3.非氢原子的最终坐标参数(X104)和等效温度因子(AX IO3)
AtomXrZ"(eq)Cu(I)4377(1)9181(1)1648(1)38(1)C(I)3404(10)7698(6)473(3)44(2)C (2)2759(11)7489(7)-193(4)51(2)C (3)2208(10)8347(7)-596(3)46 (2)C (4)2256(9)9412(6)-352(3)38(1)C (5)2931(8)9542(5)324(3)32(1)C (6)3009(8)10601(5)613(3)34(1)C (7)2435(9)11517(6)233(3)39(1)C (8)1791(10)11362(7)-459(3)49(2)
权利要求
1.一种人工核酸水解酶，其特征是包括人工核酸水解酶I，名称为甘氨酸铜邻二氮杂 菲，分子式 C14H19Cl1Cu1N3O6,分子量 424. 32，单元池参数 a 7. 0100 (14)、b 12.304 (3)、 c 20.879 (5)、b 104.31(3)，空间群P21/c ；人工核酸水解酶II，名称为甘氨酰甘氨酸铜 1-甲基咪唑，分子式C8H13Cu1N4O4,分子量四2. 76，单元池参数a 7. 0981 (14)、b 8. 2360 (16)、c 11. 257(2) ,b 88.99 (3)，空间群 P-1。
2.权利要求1所述的人工核酸水解酶的制备方法，其特征是包括以下步骤(1)将甘氨酸、1，10-邻二氮杂菲和氯化铜按摩尔比1 1 1在水相中搅拌混合，在55° C 条件下反应30分钟，冷却至室温后过滤；(2)将甘氨酰甘氨酸、1-甲基咪唑和新制的氢氧化铜按摩尔比1:1:1搅拌混合在水相 中，加热到C后反应30分钟，冷却后过滤；(3)分别将步骤(1)和步骤(2)所制得的滤液按体积比1:3与N，N-二甲基甲酰胺) 混合后，溶液出现混浊现象，然后逐滴滴加水后转为透明溶液，再次滴加3-5滴水后静置 挥发，其中步骤(1)产物静置挥发7天后得到紫色单晶，分子式C14H19Cl1Cu1N3O6,分子量 424.32，单元池参数 a 7.0100 (14)、b 12.304 (3)、c 20.879 (5)、b 104.31(3)，空间群 P21/c ；步骤(2)产物静置挥发10天后得到紫色单晶，分子式C8H13Cu1N4O4,分子量四2. 76， 单元池参数 a 7.0981 (14)、b 8.2360 (16), c 11. 257 (2), b 88.99 (3)，空间群 P-1。
3.根据权利要求2所述的的人工核酸水解酶的制备方法，其特征是步骤(1)所述的氯 化铜可以用氢氧化铜代替。
4.根据权利要求2或3所述的的人工核酸水解酶的制备方法，其特征是所述的甘氨酸 可以用缩甘氨酸代替。
5.根据权利要求2或3所述的的人工核酸水解酶的制备方法，其特征是步骤(2)所述 的氢氧化铜可以用氯化铜代替。
全文摘要
本发明公开了一种人工核酸水解酶及其制备方法，属于生物化学技术领域，目的是根据现有人工核酸酶的溶解度、分子结构、大小和活力之间的制约关系，提供了一种高效的人工核酸水解酶及其制备方法。是在水相中通过一步化学反应由氯化铜、甘氨酸和π电子基团合成水溶性的功能金属配合物，所得产物为平面或四方锥构型，对核酸有很强的插入和水解能力，同时具有很强的序列选择性和连接能力，利用混合溶剂挥发法，加快产物的结晶效率，提高纯度和收率。本发明所得到的配合物中心铜分别采用立体四方锥和平面四边形构型，赋有tRNA靶向识别和生物连接基团，对核酸具有很强的结合常数；水解率高。
文档编号C12N15/55GK102120992SQ20101060115
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月23日 优先权日2010年12月23日
发明者乔元彪, 吴玉花, 杨卫民 申请人:乔元彪, 吴玉花, 杨卫民