通过去除显性表位b8r重组痘苗病毒的方法及其病毒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物基因工程及免疫领域，具体设及一种通过去除显性表位B8R重组 痘苗病毒的方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 免疫优势指机体对抗原表位的呈递的不一致性。病原体通常能够表达成百上千种 抗原，感染病原体后机体对运些抗原表位的呈递并非均一，某些抗原表位能够诱导机体产 生非常强烈的免疫应答，有些只能引起中等免疫应答，而有些只能引起轻微免疫应答甚或 不引起免疫应答。我们将那些能诱导强烈应答的表位称为显性表位（dominantepitope)， 其他表位称为次要表位（sub-dominantepitope)。免疫优势通常用免疫系统对一系列表位 应答强度的等级梯度（dominanthierarchy)来描述。当原本占优势的显性表位被去除后， 一些次要表位往往会代替原来的显性表位，产生新的免疫优势。目前疫苗研发中的一个突 出问题，就是载体自身的免疫优势对外源目的性抗原的有效表达和免疫原性产生显著的抑 审IJ，载体的免疫优势效应成为制约疫苗有效性的主要因素之一。
[0003] 痘苗病毒（vacciniavirus,VACV)是目前应用最为广泛的基因治疗和疫苗的载 体之一。在痘苗病毒诱导的巧7BL/6小鼠杀伤性T细胞（杀伤性T细胞）应答中，B8R表 位居免疫梯度的首位，去除B8R可望有效降低痘苗病毒载体的免疫优势，提高重组疫苗中 外源目的抗原的表达和功能。B8R基因编码蛋白是一种干扰素丫（IFN-丫）的特异性受体， IFN-丫作为重要的免疫诱导和调节因子在一系列免疫应答中发挥重要的作用；B8R的缺失 可能对痘苗病毒的毒力和机体的抗病毒免疫造成影响。本发明将包含H-2Kb限制性CD8 +表 位（0VA257 2M)的OVA作为外源基因替换痘苗病毒的B8R，构建了含外源目的抗原OVA的重 组痘苗病毒。B8R基因缺失对于病毒的感染复制不产生显著影响；将外源基因OVA导入B8R 基因缺失的痘苗病毒后，OVA诱导免疫应答的能力较之在野生型痘苗病毒中显著改善，并跃 居免疫优势梯度的首位。在今后的应用中可用各种外源基因取代0VA，构建高效表达目的抗 原的重组活疫苗。
【发明内容】
[0004]为解决作为疫苗载体的痘苗病毒的免疫优势问题，提高重组痘苗病毒疫苗的安全 性和有效性，本发明提供了一种通过去除显性表位B8R重组痘苗病毒的方法。去除B8R对 外源抗原免疫原性的抑制，可有效降低痘苗病毒的免疫优势效应，增加外源性抗原的免疫 原性。去除痘苗病毒本身的显性表位，可为疫苗和基因治疗提供更为有效的载体。 阳0化]本发明的目的是提供一种通过去除显性表位B8R从而降低痘苗病毒自身免疫优 势并提高安全性的方法，及用该方法构建的重组痘苗病毒。
[0006] 本发明的另一目的是提供上述重组痘苗病毒作为疫苗和基因治疗载体的应用。
[0007] 本发明所述的重组痘苗病毒，是将野生痘苗病毒的B8R基因替换为带有LacZ标记 的OVA基因得到的重组痘苗病毒。
[0008] 在本发明的实例中，所述野生痘苗病毒为野生型WR株痘苗病毒，所述的野生型WR 株痘苗病毒的基因组DM序列为GenBank号为AY243312. 1的序列（V化14-MAR-2006)。
[0009] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
[0010] 通过去除显性表位B8R重组痘苗病毒的方法，包括如下步骤： W11] S1、构建质粒PSB8R-0VA;
[0012] S2、在CV-1细胞中与野生型痘苗病毒重组； 阳01引 S3、筛选纯化获得重组病毒（VACV-0VA+B8R)。
[0014] 其中，所述步骤S1的具体步骤为：
[0015]S11、根据野生型痘苗病毒的B8R基因及其侧翼序列，设计引物，W病毒基因组为 模板，PCR获得B8R基因的左右臂同源序列B8化和B8RR。
[0016] S12、将获得的B8化和B8RR分别替代pSCl1质粒的T化和TKR，获得中间质粒 pSC-Bo
[0017]S13、根据OVA基因序列，设计引物，WVACV-0VA+病毒基因组为模板，PCR获得 OVA基因，将获得的OVA基因插入pSC-B质粒的P7. 5启动子后，得到痘苗病毒重组工具 PSB8R-0VA。
[0018] 其中，所述步骤S2的具体步骤为：
[0019] S21、在T25培养瓶中培养CV-1单层细胞，至80%覆盖。
[0020]S22、用野生型痘苗病毒感染CV-1细胞。 W21] S23、采用脂质体法将质粒PSB8R-0VA转染至感染细胞，野生型痘苗病毒与 PSB8R-0VA在B8R基因左右侧位置发生同源重组。
[0022] S24、48小时后，收集病毒。
[0023] 其中，所述步骤S3的具体步骤为：
[0024] S31、在6孔板中培养CV-1细胞，至80%覆盖。 阳0巧]S32、采用步骤S24中的病毒感染CV-1细胞，并覆盖琼脂培养基。 阳0%] S33、2天后加入含X-gal的上层培养基，培养过夜；
[0027]S34、挑取孤立蓝斑，进行进一步筛选，步骤如S32至S34。连续单斑筛选5代。
[0028] S35、经PCR、基因测序和WesternBlot进行分子生物学鉴定无误后，进行重组病 毒的体外增殖，并将最终收获的病毒采用密度梯度离屯、纯化，保存于-80°C。
[0029] 本发明具有W下有益效果：
[0030] 去除B8R对外源抗原免疫原性的影响，可有效降低痘苗病毒的免疫优势效应，增 加外源性抗原的免疫原性，为W痘苗病毒为载体的活疫苗的研发提供工具。去除痘苗病毒 本身的显性表位，可为疫苗和基因治疗提供更为有效的载体。
【附图说明】
[0031] 图1为本发明实施例中质粒PSB8R-0VA的构建步骤。
[0032] 图2为本发明实施例中质粒PSB8R-0VA的酶切鉴定结果，其中泳道1为OVA基因 正确连接的酶切结果，泳道2为基因错误连接的酶切结果，均与使用VectorNTI分析的酶 切结果（右侧）一致。分子量标记DSOOOmarker。
[0033] 图3为本发明实施例中重组病毒形成的蓝斑。
[0034] 图4为本发明实施例中重组病毒的密度梯度离屯、纯化。
[0035] 图5为本发明实施例中重组病毒中B8R基因扩增。分子量标记Markerlll，泳道1 和2分别为野生型痘苗病毒和VACV-0VA+产生的B8R条带，泳道3显示VACV-0VA+B8R无特 异条带产生。
[0036] 图6为本发明实施例中重组病毒中OVA基因扩增。分子量标记D2000marker，泳道 1和2分别为VACV-0VA+和VACV-0VA+B8R产生的OVA条带，泳道3显示野生型痘苗病毒无 特异条带产生。
[0037] 图7为本发明实施例中OVA蛋白的表达。泳道1、2、3分别为VACV-〇VA\ VACV-0VA+B8R和野生型痘苗病毒感染后细胞中OVA蛋白的表达。
[0038] 图8为本发明实施例中野生型痘苗病毒在巧7BL/6小鼠体内诱导的杀伤性T细胞 应答的免疫优势等级梯度。
[0039] 图9为本发明实施例中重组病毒在CV-1细胞中的生长曲线。
[0040] 图10为本发明实施例中重组病毒在BSC-1细胞中的生长曲线。
[0041] 图11为本发明实施例中重组病毒感染CV-1细胞3天后的隧斑特性。
[0042] 图12为本发明实施例中重组病毒诱导的杀伤性T细胞免疫应答。
[0043] 图13为本发明实施例中小鼠感染重组病毒后的体重变化曲线。 W44] 图14为本发明实施例中小鼠感染重组病毒后的体征及神经行为评分变化曲线。
【具体实施方式】
[0045] 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，W下结合实施例对本发明进行进一步 详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明，并不用于限定本发 明。
[0046] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0047] 下述实施例中所使用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。 阳〇4引实施例
[0049] 本实施例中的野生型痘苗病毒WR株在西安医学院分子病毒与病毒免疫学实验室 (本实验室，下同）保藏，内嵌OVA基因的重组痘苗病毒（VACV-0VA+)由申请人构建并在本 实验室保藏。质粒pSCll由美国NIH的BernardMoss教授惠赠，细胞系CV-1和BSC-1购 自中国典型培养物保藏中屯、。所使用的小鼠为雌性6周龄巧7BL/6小鼠，体重18-22g，购自 中国预防医学科学院动物繁育中屯、，饲养于恒溫恒湿的SPF级鼠房。
[0050] 主要试剂和材料：
[0051] DMEM，胎牛血清，脂质体（lipofectamine2000)转染试剂均购自Invitrogen公 司，Taq酶、限制性内切酶及T4DNA连接酶均购自肥B公司，病毒基因组提取试剂盒购自 Biomiga公司，质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自AXYGEN公司。 阳05引 1、质粒PSB8R-0VA的构建和鉴定 阳05引将野生痘苗病毒WR株的基因组DNA序列的第169650-170606位（对应序列1的 1-957位，命名为上游同源左臂B8化）和第171345