专利名称：快速检测猪瘟抗体的试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种检测动物疾病的试纸条，尤其涉及一种快速检测猪痘抗体的试 纸条，本发明还涉及该试纸条的制备方法和应用方法，属于动物疾病检验检疫领域。
背景技术：
猪瘟是由猪痘病毒引起的一种急性，热性、接触性、烈性传染病，不论任何品 种、日龄的生猪都可发生，也没有季节性；该病一旦发生，病死率高，损失巨大， 世界动物卫生组织(OIE),将其列为A类传染病，我国将其纳为一类动物传染病进 行管理，对该病的防制工作十分重视。目前，公知的猪瘟抗体快速检测试剂盒(ELISA法)，系采用酶联免疫技术检测 样品(血清)中猪瘟抗体的方法。即采用猪瘟灭活弱毒或弱毒疫苗抹经纯化、浓 缩制成的抗原包被微孔板，在试验中，加入稀释的对照血清和待检血清，经温育后， 若样品中含有猪痘特异性抗体，则将与微孔板上抗原结合，经洗涤除去未结合的抗 体和其他成分后；再加入酶标二抗，与微孔板上抗原抗体复合物发生特异性结合； 再经洗涤除去未结合的酶结合物，在孔中力口TMB或OPD底物液，与酶反应形成有色 产物，加入终止液反应后，用酶标仪固定波长(450nm或630nm )测定各反应孔中 的OD值。ELISA适合大批样品的检测，成为了一种常规的检测方法。但是，该方法 抗原的制备过程必须经过病毒的细胞培养、病毒纯化等繁瑣模式，特异性不高、稳 定性差，而且成本高；检测时需要专门的仪器设备如酶标仪来配合使用，检测操作 人员需要经过专业培训；操作过程相对比较复杂；检测所需要时间比较长；检测所 需费用高。发明内容本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的问题，提供一种能够快速检 测猪瘟抗体的试纸条，该试纸条不需要专业的技术人员进行操作，方法筒便易学， 不用任何仪器进行辅助检测，检测结果特异性高，重复性好。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种快速检测猪瘟抗体的试纸条，由样品垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜(NCM)、吸水垫和支持物组成；所述的硝酸纤维素膜含有一条由猪痘E2蛋白包被 而成的检测线和由兔抗猪痘抗体包被而成的对照线；所述的玻璃纤维膜结合有胶体 金标记的猪瘟E2蛋白；玻璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水垫按照以下次序相连接并附 着在支持物上玻璃纤维膜与靠近硝酸纤维膜检测线的一端相连接，吸水垫与靠近 硝酸纤维膜对照线的一端相连接；样品垫附着在玻璃纤维膜上，样品垫的一端与硝 酸纤维素膜相衔接。其中，所述的支持物只要具有一定的硬度，将样品垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维 素膜和吸水垫负载于其上，达到支持和负载的目的即可作为本发明的支持物，可以 选用各种材料作为本发明的支持物，例如塑料板(优选为PVC)、硬纸板、铝板等。所述的猪瘟E2蛋白可按照常规的基因工程方法进行制备或表达，这些方法都是 本领域技术人员所能掌握或通晓的。所述的兔抗猪瘋抗体可参考以下方法制备得到用猪疸弱毒采用多点注射法免 疫阴性家兔3只，每隔2周加强免疫1次，共进行3次，最后一次免疫10天后釆血，分 离血清，纯化后得兔抗猪痘IgG。所述硝酸纤维素膜(该硝酸纤维素膜也可由尼龙膜来替换)上的检测线和对照 线之间的间隔优选为3-5mm，更优选为4mm。一种制备本发明的检测猪瘟抗体的试纸条的方法，包括(1) 用喷膜机将胶体金标记的猪瘟E2蛋白复合物喷涂在玻璃纤维膜上，备用；(2) 将猪瘟E2蛋白和兔抗猪痘抗体IgG依次间隔3-5mm喷在硝酸纤维膜上， 分别作为检测线和对照线，将包被好的硝酸纤维膜封闭其余蛋白结合位点，洗涤， 干燥，备用；(3) 将硝酸纤维膜、玻璃纤维膜、样品垫、吸水垫按照以下次序粘贴在支持 板上将玻璃纤维膜连接在靠近硝酸纤维膜检测线的一端，边缘附着在硝酸纤维素 膜上；样品垫附着在玻璃纤维膜上，与硝酸纤维素膜衔接；吸水滤纸板连接在硝酸 纤维素膜的另一端，边缘附着在硝酸纤维素膜上；(4) 将粘好的支持板材料切成60mm长、4mm宽的试纸条，即得。 本发明试纸条4全测猪瘟抗体的方法l操作方法在检测前先将样本和试纸条放在室温条件下放置一段时间(IO分 钟)，使其恢复至室温；从铝箔袋中取出检测试纸条；在椭圓形加样孔内加入3—5滴(100—200/d )待检猪血液或血清样品；将试纸条平放在桌面上，在室温下静置 20分钟判定结果； 2结果判断无效在对照线和;险测线都不出现色线；阴性在对照线出现一条色线，在检测线不出现色线；弱阳性在对照线出现一条颜色较深的紫红色线，而在检测线出现一条颜色很 浅的紫红色线；阳性在对照线和检测线各出现一条颜色较深的紫红色线，样品中的抗体表达 水平越高，检测线色线颜色越深。本发明利用基因工程技术表达猪瘟E2蛋白，采用酶联免疫原理和膜层析技术制 成快速检测猪血液或血清中的猪痘抗体的试纸条。与ELISA和IFA相比，本发明试 纸条具有以下明显的优势安全性好，无需培养病毒本身，避免了因操作病毒造成 的病毒扩散；可以大批量制备，工艺简单，生产成本低廉；抗原成分稳定均一，操 作简便省力，不用仪器，检测结果特异性高，重复性好。整个实验仅需15分钟。操 作简便、快速、准确、灵敏度高、直观、结果容易判定。本发明结合胶体金标记技术和膜层析技术，可快速检测样本中可能存在的猪 瘟抗体，达到快速检测、及时控制疫情的目的，为下一步的分离鉴定创造了有利条 件，节省了大量的人力物力，方便、快速、简便，不需特殊仪器设备，不需专业培 训，结果清晰易辨；操作简单、易于推广、适合基层以及突发事件的大批量现场检 测，适合流行病调查，对猪瘋病毒感染诊断起到辅助作用。
图1 本发明试纸条的正面示意图； 图2 本发明试纸条的侧面示意图；图3 检测结果示意图从左至右依次为检测线和对照线显色为阳性；对照 线显色为阴性；检测线和对照线两条带未显色为无效。附图标记说明l-吸水垫；2-硝酸纤维膜(6:包被基因工程表达的猪痘E2蛋 白；7:包被兔抗猪瘟抗体IgG ) ; 3-含有胶体金标记抗原的玻璃纤维膜；4-样品垫； 5-反应支持物。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本 领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方 案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1 本发明检测猪癍抗体试纸条的制备 1猪疯E2蛋白的制备 ①材料来源(1) 病毒来源。猪痘弱毒(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所制备)。(2) 载体、受体菌和试剂来源。受体菌BL21:中国农业科学院哈尔滨兽医研 究所诊断与流行病学中心；PET-30a、限制性内切酶及各种修饰酶购于大连宝生物/> 司；IPTG、卡那霉素上海生工。(3) 引物合成。扩增含编码B/C抗原区的基因片段所用的引物P上游 (5'tcgaattcatgcgtctagcctgca 3'); P下游(5'tggtgagtgagtaaagcccccttat 3'),上、下游引物分别包含设计为五coRI、尸M酶切位点，扩增E2基因的第l位氨基酸至第76位氨基 酸。(4) 试剂来源。TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶和各种限制性核酸内切酶 Takara〃^司；其它试剂均为国产。②猪瘟E2蛋白的诱导表达(1) 病毒RNA的提取和基因的RT-PCR扩增RNA的提取按Trizol试剂盒说明 书进行；根据GeneBank中猪瘟病毒设计一对针对B/C基因的特异性引物(见上)，反 转录按反转录试剂盒说明书进行。取5/xl cDNA产物用作PCR反应。(2) 表达载体的构建将PCR产物胶回收后，与PMD18-T载体连接，转化后得到阳性重组质粒，命名 为TB/C。利用上游引物的酶切位点和载体上的酶切位点，双酶切后回收B/C基因和 同样处理的原核表达载体PET30a进行T4 DNA连接酶连接，转化BL21菌种制备的感 受态。小量提取质粒。(3 ) PCR阳性菌林的诱导表达将含有重组质粒PETB/C的BL21菌种在含卡那霉素的LB平板上划线，37。C培养 过夜，挑取单个菌落，于含卡那抗生素的LB中37。C摇床培养至OD600为0.6-0.7时， 加入诱导剂IPTG至终浓度lmM,继续振摇培养3-6小时，收获细菌。离心后将菌体 用0.5MNaCl、 20mMTris'Cl(pI^7.6)洗两次，然后用PBS悬浮细胞。(4)猪痘E2蛋白的纯化将超声裂解后的菌体以10000r/min离心，经0.22um微孔滤膜过滤后，加入lmL 4臬亲合层析基质，装柱，4。C作用30min。依次用10 ~ 20倍柱床体积、含10mM咪唑 和20mM咪唑，500mMNaCl的磷酸盐缓冲液洗涤3次；再用含IOO ~ 500 mM咪唑的 磷酸盐缓冲液洗脱含His2tag的重组E2蛋白，分管收集，洗脱流速控制在2 ~ 3ml7min。2制备兔抗猪痘高免血清用猪瘟弱毒(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所生产)采用多点注射法免疫阴 性家兔3只，每隔2周加强免疫1次，共进行3次，最后一次免疫10天后采血，分离血 清，纯化后得兔抗猪痘IgG。3胶体金颗粒制备将氯化金(中国医药集团上海化学试剂公司)配制成0.01%水溶液，取100ml煮 沸2 min后，边搅拌边加入柠檬酸三钠(1%)2 ml,煮沸至溶液颜色变成酒红色后， 继续煮沸至适宜浓度(00535 =0 . 93 1 2),冷却后加入双蒸馏水恢复到原体积，置4。C保 存。4胶体金标记E2蛋白制备及纯化将待标记E2蛋白倍比稀释，分别取100/xl加入l ml胶体金中，10min后加入10% NaC1100/d， 4。C静止lh。取胶体金颜色没有发生改变的最高稀释倍数为准，在此基 础上加30%为最佳标记量。取一定量调配好的月交体金用0.2 mo1/ L K2C03调至pH = 9.0，按最佳标记量加入表达抗原E2蛋白，室温作用20min，加入Tris-HCl (pH 8.0， 20mmo1/ L)配制的BSA,使终浓度为1%, 4。C放置2 h后使用。将金标抗原3000 r/ min 离心30min,取上清，60000 g离心60 min,沉淀用0.02 mo1/L pH7.2含0.1。/。BSA的 PBS溶解，恢复到原体积。再超离l次，沉淀用少许上述PBS溶解，使005350 = 1.5。 0.22/mi滤膜过滤，4"C保存备用。5、试纸条的组装(1 )用喷膜机将胶体金标记的猪瘟E2蛋白复合物喷涂在玻璃纤维膜上，备用；(2) 将猪瘟E2蛋白和兔抗猪瘟IgG依次间隔3-5mm喷在硝酸纤维膜上，分别 作为检测线和对照线，将包被好的硝酸纤维膜封闭其余蛋白结合位点，洗涤，干燥， 备用；(3) 将硝酸纤维膜、玻璃纤维膜、样品垫、吸水垫按照以下次序粘在支持板 上将玻璃纤维膜连接在靠近硝酸纤维膜检测线的一端，边缘附着在硝酸纤维素膜上；样品垫附着在玻璃纤维膜上，与硝酸纤维素膜衔接；吸水滤纸板连接在硝酸纤 维素膜的另一端，边缘附着在硝酸纤维素膜上；(4)将粘好的支持板材料切成60mm长、4mm宽的试纸条，即得。试验例1 本发明猪疸抗体快速检测试纸条的相关试验 1材料来源猪瘟病毒抗原中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供；猪瘟高免血清的制备用中国农业科学院哈尔滨兽医研究所生产的弱毒疫苗， 用多点注射法免疫阴性健康猪4头，每隔2周加强免疫1次，共进行3次，最后1 次免疫10后天采血；分离血清。参考血清猪圓环病毒(PCV)阳性血清、猪流型性腹泻病毒(PEDV)阳性血清、 猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阳性血清、猪轮状病毒(PRoV)阳性血清、猪伪狂犬病毒 (PRV)阳性血清、猪细小病毒(PPV)阳性血清。待检血清采自黑龙江、天津、福建等全国各地36个猪场的1285头份血清和 全血(其中460头为假设健康猪被采猪全血)，鸡血清、鸭血清、鹅血清、羊血清 各15份，共计825份血清和460份全血。并把上述血清、全血编号待才企；对照试剂盒猪瘟ELISA试剂盒由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供；血 凝法试剂盒，由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。一、 本发明试纸条^:感性试-验同一份猪瘟阳性高免血清，同时用本发明试纸条(实施例1所制备)和间接 ELISA试剂盒4企测；试验结果最低检出量，ELISA试剂盒为1:1920-3840，本发明试纸条(GICA) 为1:1920。壽文感性相似。用本发明试纸条、猪瘟抗体ELISA试剂盒和猪瘟间接血凝法抗原试剂盒分别对 上述1285份血清进行检测，结果基本一致。其中，825份猪血清中，阳性738份， 阴性147份。用本发明试纸条进行检测的结果与ELISA、间接血凝法两种方法检测 结果的符合率分别为99.86%和98.92%。二、 本发明试纸条特异性和符合率试验用本发明试纸条对猪圓环病毒(PCV)阳性血清、猪流型性腹泻病毒(PEDV)阳性 血清、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阳性血清、猪轮状病毒(PRoV)阳性血清、猪伪狂 犬病毒(PRV)阳性血清、猪细小病毒(PPV)阳性血清进行检测，检测结果均不出现红 色斑点，而用纯化的CSFV阳性高免血清和未纯化的CSFV阳性血清则出现红色斑 点。用本发明试纸条、猪瘟抗体ELISA试剂盒和猪疸间接血凝法抗原试剂盒分别 对上述1285份血清进行检测，结果基本一致，其中，885份猪血清中阳性738份， 阴性147份；而鸡、鸭、鹅、兔、羊血清共75份均为阴性。在作上述猪间接血凝 试验时，885份猪血清中，血凝滴度在1: 16以上的样品616份，血凝滴度在1: 16以下的样品122份。75份鸡、鸭、鹅、羊血清未能检出。三、批内和批间的重复性试验(一) 、(l)批内重复性试验3份阴阳血清样品在同一批次试纸条试验中每份 样品平行设6个重复；(2 )批间重复性试验在5个不同试验日重复测定6批产品;(二) 试验结果批内重复变异系数为3.1-8.6%之间；批间重复变异系数为 4.2-10.3%之间。四、保存期试验2003年1月以来对保存的纸条试剂盒进行了试^^,结果表明，试剂盒保存期均 在2年以上。建议试剂盒在-20。C，有效期为12-18个月。
权利要求
1、一种快速检测猪瘟抗体的试纸条，其特征在于包括样品垫(4)、玻璃纤维膜(3)、硝酸纤维素膜(2)、吸水垫(1)和支持物(5)；所述的硝酸纤维素膜含有一条由猪瘟E2蛋白包被而成的检测线(6)和由兔抗猪瘟抗体包被而成的对照线(7)；所述的玻璃纤维膜结合有胶体金标记的猪瘟E2蛋白；玻璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水垫按照以下次序相连接并附着在支持物上玻璃纤维膜与靠近硝酸纤维膜检测线(6)的一端相连接，吸水垫与靠近硝酸纤维膜对照线(7)的一端相连接；样品垫附着在玻璃纤维膜上，样品垫的一端与硝酸纤维素膜相衔接。
2、 按照权利要求l所述的试纸条，其特征在于所述的支持物(5)是塑料 ^反、》更纸4反或铝4反。
3、 按照权利要求l所述的试纸条，其特征在于所述的兔抗猪疸抗体按照以 下方法制备得到用猪瘟弱毒采用多点注射法免疫阴性家兔3只，每隔2周加强免疫 l次，共进行3次，最后一次免疫10天后采血，分离血清，纯化后得兔抗猪痘IgG。
4、 按照权利要求l的试纸条，其特征在于所述的硝酸纤维素膜能够由尼龙 膜替换。
5、 按照权利要求l的试纸条，其特征在于所述贿酸纤维素膜上的检测线和 对照线之间的间隔为3-5mm。
6、 按照权利要求5的试纸条，其特征在于所述硝酸纤维素膜上的检测线和 对照线之间的间隔为4mm 。
7、 一种制备权利要求l所述的检测猪疸抗体的试纸条的方法，包括(1 )用喷膜机将胶体金标记的猪瘟E2蛋白复合物喷涂在玻璃纤维膜上，备用； (2 )将猪瘋E2蛋白和兔抗猪疸抗体IgG依次间隔3-5mm喷在硝酸纤维膜上，分别作为检测线和对照线，将包被好的硝酸纤维膜封闭其余蛋白结合位点，洗涤，干燥，备用；(3)将硝酸纤维膜、玻璃纤维膜、样品垫、吸水垫按照以下次序粘在支持板 上将玻璃纤维膜连接在靠近硝酸纤维膜检测线的一端，边缘附着在硝酸纤维素膜 上；样品垫附着在玻璃纤维膜上，与硝酸纤维素膜衔接；吸水滤纸板连接在硝酸纤 维素膜的另一端，边缘附着在硝酸纤维素膜上；(4 )将粘好的支持板材料切成60mm长、4mm宽的试纸条，即得。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测猪瘟抗体的试纸条及其制备方法。本发明试纸条由样品垫(4)、玻璃纤维膜(3)、硝酸纤维素膜(2)、吸水垫(1)和支持物(5)组成；所述的硝酸纤维素膜含有一条由猪瘟E2蛋白包被而成的检测线(6)和由兔抗猪瘟抗体包被而成的对照线(7)；所述的玻璃纤维膜结合有胶体金标记的猪瘟E2蛋白。本发明试纸条可快速检测样本中可能存在的猪瘟抗体，达到快速检测、及时控制疫情的目的，为下一步的分离鉴定创造有利条件。使用方便、快速、简便，不需特殊仪器设备，不需专业技术人员操作，结果清晰易辨，易于推广，适合基层以及突发事件的大批量现场检测，适合流行病调查，对猪瘟病毒感染诊断可起到辅助作用。
文档编号G01N33/569GK101216489SQ200810000449
公开日2008年7月9日 申请日期2008年1月10日 优先权日2008年1月10日
发明者崔尚金 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所