专利名称：检测猪繁殖与呼吸综合症抗体的试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种检测动物疾病的试纸条，尤其涉及一种快速检测猪繁殖与呼吸综 合症抗体的试纸条，本发明还涉及该试纸条的制备方法和应用方法，属于动物疾病检 验检疫领域。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合症(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS )是 20世纪80年代末出现的一种新病，其症状主要表现为怀孕母猪流产、早产、产死胎、 木乃伊胎及仔猪感染后的成活率下降，成年猪的呼吸道症状，同时还会导致免疫抑制 而继发多种其它疾病。目前，该病在全世界几乎所有养猪地区都有流行，给世界养猪 业造成了巨大的经济损失，引起了国内的广泛关注。2006年夏季我国南方诸省爆发 猪无名高热病，损失严重，疫情持续反弹，其中PRRS是最主要病原之一。目前PRRS 老疫区并未消灭，新疫区又不断发生，且由于继发病的增多，使猪场防疫无所适从， 防疫形势十分严峻。目前，7>知的猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)的诊断方法有间接ELISA、免疫荧 光检测法(IFA )。 (l)间接ELISA主要用于检测血清中的抗体成分。该方法是将特异性 抗原包被在固相载体的表面，形成固相抗原，加入待检样品，使其中的相应抗体结合 到固相载体的抗原上，再加入酶标记的抗抗体，形成抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物， 最后加入底物溶液显色。固相载体上的酶催化底物成为有色产物。通过比色测知样品 中抗体的含量。但是，ELISA法要求抗原纯度高、特异性好，否则会出现非特异性反 应，操作程序较复杂，需反复洗涤，若洗涤次数不够或过多易造成假阳性或假阴性， 并易造成操作者受害或环境污染，实验时间较长，需两个小时以上得出检测结果。该 法必须具备酶标仪和洗板机，这在基层实验室和小型门诊较难达到，且试验受温度等 条件限制，给检测带来不便。(2)荧光免疫检测法(IFA)根据抗原抗体特异性免疫反 应原理设计，把感染病毒的细胞固定在玻片上，将待检测血清滴于上面，带有病毒的 血清中含有相应抗体，结合与玻片上，加入焚光试剂，即可显示出焚光。在荧光免疫显微镜下可直接观察检测结果。IFA法灵敏度高，但必须具备荧光免疫显微镜和暗室 条件，为获得良好荧光观察效果必须配置合适的滤光片，实验时间需两小时，结果检 测于免疫显微镜下进行，必须由有经验的专业技术人员判定检测结果。发明内容本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的问题，提供一种能够快速检测 猪繁殖与呼吸综合症抗体的试纸条，该试纸条不需要专业的技术人员进行操作，方法 简便易学，不用任何仪器进行辅助检测，检测结果特异性高，重复性好。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的 一种猪繁殖与呼吸综合症抗体快速检测试纸条，包括样品垫、玻璃纤维膜、硝 酸纤维素膜(NCM)、吸水垫和支持物；所述的硝酸纤维素膜含有一条由猪繁殖与 呼吸综合症病毒M蛋白包被而成的检测线和由兔抗PRRSV抗体包被而成的对照线； 所述的玻璃纤维膜结合由胶体金标记的猪繁殖与呼吸综合症病毒N蛋白；玻璃纤维 膜、硝酸纤维膜和吸水垫按照以下次序相连接并附着在支持物上玻璃纤维膜与靠 近硝酸纤维膜检测线的一端相连接，吸水垫与靠近硝酸纤维膜对照线的一端相连接； 样品垫附着在玻璃纤维膜上，样品垫的一端与硝酸纤维素膜相衔接。其中，所述的支持物只要是具有一定的硬度，可以将样品垫、玻璃纤维膜、硝 酸纤维素膜和吸水垫负载于其上以达到支持和负载的目的，均可作为本发明的支持 物；可以选用各种材料作为本发明的支持物，例如塑料板(优选为PVC)、硬纸板、 铝板等。所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白和猪繁殖与呼吸综合症病毒N蛋白可按 照常规的基因工程方法进行制备或表达，这些方法都是本领域技术人员所能掌握或 通晓的。所述的兔抗PRRSV抗体可参考以下方法制备得到用猪繁殖与呼吸综合症弱毒 疫苗采用多点注射法免疫阴性家兔3只，每隔2周加强免疫1次，共进行3次，最后一 次免疫10天后采血，分离血清，纯化后得兔抗PRRSVIgG。所述硝酸纤维素膜(该硝酸纤维素膜也可由尼龙膜来替换)上的;f全测线和对照 线之间的间隔优选为3-5mm,更优选为4mm。一种制备本发明检测猪繁殖与呼吸综合症抗体的试纸条的方法，包括(1 )用喷膜机将胶体金标记的猪繁殖与呼吸综合症病毒N蛋白复合物喷涂在玻 璃纤维膜上，备用；(2 )将猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白和兔抗PRRSV IgG依次间隔3-5mm喷在 硝酸纤维膜上，分别作为检测线和对照线，将包被好的硝酸纤维膜封闭其余蛋白结合位点，洗涤，干燥，备用；(3) 将硝酸纤维膜、玻璃纤维膜、样品垫、吸水垫按照以下次序粘贴在支持板 上将玻璃纤维膜连接在靠近硝酸纤维膜检测线的一端，边缘附着在硝酸纤维素膜 上；样品垫附着在玻璃纤维膜上，与硝酸纤维素膜衔接；吸水滤纸板连接在竭酸纤 维素膜的另一端，边缘附着在硝酸纤维素膜上；(4) 将粘好的支持板材料切成60mm长、4mm宽的试纸条，即得。 本发明试纸条的应用方法1、 操作方法在检测前先将样本和试纸条放在室温条件下放置一段时间(10 分钟)，使其恢复至室温；从铝箔袋中取出检测试纸条；在椭圆形加样孔内加入3—5 滴(100_200/il )待4企猪血液或血清样品；将试纸条平放在桌面上，在室温下静置 20分钟判定结果；2、 结果判断无效对照线和斗全测线都不出现色线；阴性对照线出现一条色线，检测线不出现色线；弱阳性在对照线出现一条颜色较深的紫红色线，而在检测线出现一条颜色 很浅的紫红色线；阳性在对照线和检测线各出现一条颜色较深的紫红色线，样品中的抗体表 达水平越高，检测线(T)色线颜色越深。本发明利用基因工程技术表达PRRSV核蛋白(N蛋白)和M蛋白，采用酶联 免疫原理和膜层析技术制成快速检测猪血液或血清中的抗体的试纸条。与ELISA和 IFA相比，本发明试纸条具有以下明显的优势安全性好，无需培养病毒本身，避 免了因操作病毒造成的病毒扩散；可以大批量制备，工艺简单，生产成本低廉；抗 原成分稳定均一，操作简便省力，不用仪器，检测结果特异性高，重复性好。整个 实验仅需15分钟。操作简便、快速、准确、灵敏度高、直观、结果容易判定。本发明结合胶体金标记技术和膜层析技术，可快速检测样本中可能存在的猪 繁殖与呼吸综合症抗体，达到快速检测、及时控制疫情的目的，为下一步的分离鉴 定创造了有利条件，节省了大量的人力物力。检测方法方便、快速、简便，不需特 殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨；操作简单、易于推广、适合基层以及突发事件的大批量现场检测，适合流行病调查，对猪繁殖与呼吸综合症病毒感染诊 断起到辅助作用。
图1 本发明试纸条的正面示意图；图2 本发明试纸条的侧面示意图；图3检测结果示意图从左至右依次为检测线和对照线显色为阳性；对照 线显色为阴性；；险测线和对照线两条带未显色为无效。附图标记说明1:吸水垫；2:硝酸纤维膜(6:包被基因工程表达PRRSV M 蛋白；7:包被兔抗PRRSV IgG) ; 3:含有胶体金标记抗原的玻璃纤维膜；4:样 品垫；5:反应支持物。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本 领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方 案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1 本发明检测猪繁殖与呼吸综合症抗体试纸条的制备 1基因工程表达PRRSVN蛋白的制备① 材料来源(1)毒林、菌种PRRSV美洲抹ATCC-VR2332 、表达载体、受体菌BL21 均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所流行病学与诊断中心保存；(2)限制性内 切酶EcoRI, Xhol, Taq酶，pET30 ( a) 、 T4DNA连"l妻酶购于大连宝生物/^司；(3 ) IPTG、卡那霉素购于上海生工，ProBord纯化试剂、Trizol试剂盒购于Invitrogen公司。② N蛋白的制备(1)表达载体的构建可参考周艳君等的所公开的方法进行(周艳君，童光志， 薛强等.猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-la株核蛋白基因在原核系统中的高效表达与 初步应用[J].中国预防兽医学4艮.2002, 6:401-404.)，也可按照以下方法构建将PRRSV病毒培养液经差速离心、超速离心后，收获的病毒粒子用Trizol试剂盒提耳又病毒核酸，应用特异性引物(上游5'GTGGGAATTCTTGTCAAATATGCC AAATAA3，,下游5'ATTCTAACCTC GAGGATCC CAAA GAATA CC3，)经RT-PCR扩增N蛋白基因，用EcoRI、 XhoI酶切所获得N蛋白基因和原核表达载体pET30 (a), 分别回收0.4kb、 5.3kb的目的片段，用T4DNA连接酶于低温下连接，以BL21 菌种制备的感受态进行转化。(2) N蛋白基因的诱导表达活化阳性菌种，于37。C摇床中以200转/分剧烈振摇，至菌液的OD值约为0.5时， 加人诱导剂IPTG至终浓度为1 mmol/L,继续振摇3—4小时，收获细菌。将菌体用 200mmol/L Tris-Cl (pH=7.5 )洗2次，然后用PBS悬浮细菌至终浓度lmg/ml。(3) PRRSV N蛋白的纯化将超声裂解后的菌体以10000r/min离心，经0.22)tmi微孔滤膜过滤后，加入lmL 镍亲合层析基质，装柱，4。C作用30min。依次用10 ~ 20倍柱床体积、含10mM咪唑 和20mM咪唑，500mMNaCl的磷酸盐緩冲液洗涤3次；再用含IOO ~ 500 mM咪唑的 磷酸盐緩冲液洗脱含His2tag的重组N蛋白，分管收集，洗脱流速控制在2 ~ 3ml/min。2基因工程表达PRRSVM蛋白的制备① 材料来源(l)毒林、菌种PRRSV美洲抹ATCC-VR2332、表达载体pET-32a、受体菌 BL21均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所流行病学与诊断中心保存；Taq DNA 聚合酶、T4 DNA连接酶和限制性内切酶及各种》务饰酶，Trizol试剂盒，购于大连宝 生物公司；IPTG、氨卞青霉素上海生工；其它试剂均为国产。(3)引物合成。P 上游(5'隱CCTGGATCCTACTCAGCCATAGAAACCT-3，)； P下游(5，陽CATAAGCT CGCTTGCCG TTGTTATTTG-3'),上、下游引物分别包含设计为SamHI、 /fzwJIII 酶切位点。② PRRSVM蛋白的制备 (1 )表达载体的构建将PRRSV病毒培养液经差速离心、超速离心后，收获的病毒粒子用Trizol试剂 盒提耳又病毒核酸，应用特异性引物(P上游5'-CCTGGATCCTACTCAGCCATAGA AACCT-3; P下游5，-CATAAGCTCGCTTGCCG TTGTTATTTG-3，)经RT-PCR扩增 M蛋白基因，用SawHI、 ///"^III酶切所获得M蛋白基因和原核表达载体pET-32a。分 别回收0.3kb、 5.9kb的目的片段，用T4 DNA连接酶于低温下连接，以BL21菌种制 备的感受态进行转化，小量提取质粒。(2 ) PRRSV M蛋白的诱导表达将含有重组质粒的BL2!菌种在含氨卞抗生素的LB平板上划线，37。C培养过夜， 挑取单个菌落，于含氨千抗生素的LB中37。C摇床培养至OD600为0.5-0.6时加入诱导 剂IPTG至终浓度0.6mM,继续振摇培养4小时，收获细菌。离心后将菌体用0.5M NaCl、 20mM Tris'Cl(pH二7.6)洗两次，然后用PBS悬浮细胞。 (3 ) PRRSVM蛋白的纯化将超声裂解后的菌体以10000r/min离心，经0.22um微孔滤膜过滤后，加入lmL 镍亲合层析基质，装柱，4。C作用30min。依次用10 ~ 20倍柱床体积、含10mM咪 唑和20mM咪唑，500mM NaCl的磷酸盐緩冲液洗涤3次；再用含IOO ~ 500 mM咪唑 的磷酸盐緩冲液洗脱含His2tag的重组M蛋白，分管收集，洗脱流速控制在2 3ml/min。3制备兔抗PRRSV高免血清用猪繁殖与呼吸综合症弱毒疫苗(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所生产)采 用多点注射法免疫阴性家兔3只，每隔2周加强免疫1次，共进行3次，最后一次免疫 IO天后采血，分离血清，纯化后得兔抗PRRSVIgG。4胶体金颗粒制备将氯化金(中国医药集团上海化学试剂公司)配制成0.01%水溶液，取100ml煮 沸2 min后，边搅拌边加入柠檬酸三钠(1% ) 2 ml,煮沸至溶液颜色变成酒红色后， 继续煮沸至适宜浓度(OD535 =0. 9312),冷却后加入双蒸水恢复到原体积，置4。C 保存。5胶体金标记N蛋白制备及纯化将待标记N蛋白倍比稀释，分别取100/xl加入l ml月交体金中，10min后加入10% NaC1100jul， 4。C静止lh。取胶体金颜色没有发生改变的最高稀释倍数为准，在此基 础上加30%为最佳标记量。取一定量调配好的胶体金用0.2 mo1/L K2C03调至pH = 9.0,按最佳标记量加入表达抗原N蛋白，室温作用20min,加入Tris-HCl (pH8.0, 20mmol/L) 配制的BSA,使终浓度为1%, 4。C放置2h后使用。将金标抗原3000r/ min离心30 min,取上清，60000 g离心60 min，沉淀用0.02 mo1/ L pH7.2含O.l % BSA 的PBS溶解，恢复到原体积。再超离l次，沉淀用少许上述PBS溶解，使OD535nn^ 1.5。 0.22]Lim滤膜过滤，4。C保存备用。6、试纸条的组装(1 )用喷膜机将胶体金标记的猪繁殖与呼吸综合症病毒N蛋白复合物喷涂在玻璃纤维膜上，备用；(2) 将猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白和兔抗PRRSVIgG依次间隔3-5mm喷在 硝酸纤维膜上，分别作为检测线和对照线，将包被好的硝酸纤维膜封闭其余蛋白结 合位点，洗涤，干燥，备用；(3) 将硝酸纤维膜、玻璃纤维膜、样品垫、吸水垫按照以下次序粘在支持板上 将玻璃纤维膜连接在靠近硝酸纤维膜^r测线的一端，边缘附着在硝酸纤维素膜上； 样品垫附着在玻璃纤维膜上，与硝酸纤维素膜衔接；吸水滤纸板连接在硝酸纤维素 膜的另一端，边缘附着在硝酸纤维素膜上；(4) 将粘好的支持板材料切成60mm长、4mm宽的试纸条，即得。试验例1本发明猪繁殖与呼吸综合症抗体快速检测试纸条的相关试验 1材料来源猪繁殖与呼吸综合症病毒抗原，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所生产；高免血清的制备用中国农业科学院哈尔滨兽医研究所生产的弱毒疫苗，用多 点注射法免疫阴性健康猪4头，每隔2周加强免疫1次，共进行3次，最后l次免 疫10后天采血；分离血清。参考血清猪圓环病毒(PCV)阳性血清、猪流型性腹泻病毒(PEDV)阳性 血清、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阳性血清、猪轮状病毒(PRoV)阳性血清、 猪伪狂犬病毒(PRV)阳性血清、猪细小病毒(PPV)阳性血清均为中国农业科学 院哈尔滨兽医研究所流行病学与诊断中心保存。待检血清采自黑龙江、天津、福建等全国各地36个猪场的1285头份血清和 全血(其中460头为假设健康猪被采猪全血)，鸡血清、鸭血清、鹅血清、羊血清 各15份，共计825份血清和460份全血。并把上述血清、全血编号待检；对照试剂盒ELISA和IF试剂盒由中国农业科学院中国农业科学院哈尔滨兽医 研究所提供。一、本发明试纸条敏感性试验同一份PRRSV阳性高免血清，同时用本发明试纸条(实施例1所制备)和间 接ELISA试剂盒景象检测，最低检出量ELISA为1:2560-5120,本发明试纸条为 1:2560。壽1感性相似。用本发明试纸条、ELISA试剂盒和IF试剂盒，分别对上述 825份血清进行检测，结果基本一致，其中，825份猪血清中阳性739份，阴性147份。在作上述ELISA实验时时，825份猪血清中，滴度在l: 16以上的样品666份， 在1: 16以下的样品76份。用本发明试纸条对上述采猪场的460份血液进行检测， 并把检测结果和对应血清检测结果进行对照，结果基本完全相符。其最小检出量为 ELISA 1:2560, IF 1:16。二、 本发明试纸条特异性试验用本发明试纸条对猪圆环病毒(PCV)阳性血清、猪流型性腹泻病毒(PEDV) 阳性血清、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阳性血清、猪轮状病毒(PRoV)阳性血 清、猪伪狂犬病毒(PRV)阳性血清、猪细小病毒(PPV)阳性血清进行检测，均 不出现红色斑点线，而用纯化的PRRSV阳性高免血清和未纯化的PRRSV阳性血清 则出现红色斑点线。三、 批内和批间的重复性试验(1 )批内重复性试验3份阴阳血清样品在同一批次试纸条试验中每份样品平 行设6个重复。(2)批间重复性试验在5个不同试验日重复测定6份样品。 试验结果为批内重复变异系数为3.2-8.9%之间，批间重复变异系数为 4.1-9.3%之间。四、 符合率试-验用本发明试纸条对上述猪场的460 f分血液进行4企测，并4巴4企测结果和对应血清 检测结果进行对照，结果基本完全相符。用本发明试纸条检测与用ELISA、 IF两种 方法4企测的符合率为99.60%和97.83%。五、 保存期试验2002年12月以来对保存的纸条试剂盒进行了试验，结果表明，试剂盒保存期 均在2年以上。建"^义试剂盒在-20。C保存，有效期为12-18个月。
权利要求
1、一种快速检测猪繁殖与呼吸综合症抗体的试纸条，其特征在于包括样品垫(4)、玻璃纤维膜(3)、硝酸纤维素膜(2)、吸水垫(1)和支持物(5)；所述的硝酸纤维素膜含有一条由猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白包被而成的检测线(6)和由兔抗猪繁殖与呼吸综合症病毒抗体包被而成的对照线(7)；所述的玻璃纤维膜结合有胶体金标记的猪繁殖与呼吸综合症病毒N蛋白；玻璃纤维膜(3)、硝酸纤维膜(2)和吸水垫(1)按照以下次序相连接并附着在支持物(5)上玻璃纤维膜与靠近硝酸纤维膜检测线(6)的一端相连接，吸水垫与靠近硝酸纤维膜对照线(7)的一端相连接；样品垫附着在玻璃纤维膜上，样品垫的一端与硝酸纤维素膜相衔接。
2、 按照权利要求l所述的试纸条，其特征在于所述的支持物(5)是具有一定 硬度的塑料板、硬纸板或铝板。
3、 按照权利要求l所述的试纸条，其特征在于，所述的兔抗PRRSV抗体按照以 下方法制备得到用猪繁殖与呼吸综合症弱毒疫苗采用多点注射法免疫阴性家兔3 只，每隔2周加强免疫1次，共进行3次，最后一次免疫10天后采血，分离血清，纯化 后，即得。
4、 按照权利要求l所述的试纸条，其特征在于所述的硝酸纤维素膜能够由尼 龙膜代替。
5、 按照权利要求l所述的试纸条，其特征在于所述硝酸纤维素膜上的检测线 和对照线之间的间隔为3-5mm。
6、 按照权利要求5的试纸条，其特征在于所述硝酸纤维素膜上的检测线和对 照线之间的间隔为4mm。
7、 一种制备权利要求1所述的检测猪繁殖与呼吸综合症抗体的试纸条的方法， 包括(1 )用喷膜机将胶体金标记的猪繁殖与呼吸综合症病毒N蛋白复合物喷涂在玻璃 纤维膜上，备用；(2 )将猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白和兔抗PRRSV IgG依次间隔3-5mm喷在硝 酸纤维膜上，分别作为检测线和对照线，将包被好的硝酸纤维膜的其余蛋白结合位 点封闭，洗涤，干燥，备用；(3)将硝酸纤维膜、玻璃纤维膜、样品垫、吸水垫按照以下次序粘贴在支持板上将玻璃纤维膜连接在靠近硝酸纤维膜检测线的一端，边缘附着在硝酸纤维素膜 上；样品垫附着在玻璃纤维膜上，与硝酸纤维素膜衔接；吸水滤纸板连接在硝酸纤 维素膜的另一端，边l^附着在硝酸纤维素膜上；(4 )将粘好的支持板材料切成60mm长、4mm宽的试纸条，即得。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)抗体的试纸条及其制备方法。本发明试纸条由样品垫(4)、玻璃纤维膜(3)、硝酸纤维素膜(2)、吸水垫(1)和支持物(5)组成；其中，所述的硝酸纤维素膜含有一条由PRRSVM蛋白包被而成的检测线(6)和由兔抗PRRSV抗体包被而成的对照线(7)；所述的玻璃纤维膜结合有胶体金标记的PRRSV N蛋白。本发明试纸条可以大批量制备，工艺简单，生产成本低廉。利用本发明试纸条检测猪繁殖与呼吸综合症，无需培养病毒本身，安全性好。本发明试纸条灵敏度高、重复性好，操作简便、快速、准确，直观，结果容易判定。
文档编号G01N33/569GK101216488SQ20081000044
公开日2008年7月9日 申请日期2008年1月10日 优先权日2008年1月10日
发明者崔尚金 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所