痘苗病毒的生产和纯化
[0118] 取鉴定无误后的重组痘苗病毒，用BSC-1细胞进行培养增殖。将收获的病毒采用 密度梯度离屯、进行纯化，分装后保存于-8〇°C。
[0119]5、重组病毒的生长特性检测
[0120] 用VACV-0VA+B8R与对照病毒分别感染CV-1和BSC-1细胞，感染剂量为0.05M0I， 培养条件34°C/5%C〇2。分别于12、24、36、48、60和72小时收集病毒，进行滴度测定和隧 斑形成能力及隧斑特性的检测。 阳121] 6、细胞免疫应答检测 阳12引 C57化/6小鼠随机分组后腹腔感染106P即的病毒，7天后收集小鼠脾脏细胞，采用 美国BectonDickinson公司FACScan流式细胞仪进行细胞表面和细胞内标记物的流式细 胞检测，每份样品测定量为2X105细胞，采用Flow化软件对流式结果进行分析。
[0123]7、小鼠感染体征及行为观察
[0124] 实验组每组5只巧7BL/6小鼠，每只小鼠腹腔注射200μ1内含10申即的病毒（野 生型痘苗病毒、VACV-〇VA\VACV-B8R或VACV-0VA+B8R);腹腔注射PBS(200μ1)的 5 只 C57化/6小鼠为正常对照。注射后1-14天观察记录小鼠体征、行为和体重变化，一般情况 和神经行为学评分参考Bederso和Clark评分并略作改进：0分：一般情况良好，体毛光滑， 无神经功能障碍；1分：精神不振、弓背、四肢无力、活动迟缓，提尾见前肢回收屈曲，抓力减 弱；3分：毛色暗淡并有竖毛、脱毛现象，皮肤松弛，怠惰少动，后肢运动障碍；4分：无自主 活动，双后肢擁痕或小鼠死亡。 阳1巧]结果 阳126] -、质粒PSB8R-0VA的构建
[0127] 质粒PSCB8R-0VA的构建步骤如图1所示。使用引物从W野生型痘苗病毒基因组 DNA为模板获得带有相应酶切位点的B8R的上下游同源臂B8化和B8RR(见序列表1和2); 使用OVA引物从VACV-0VA中提取并扩增OVA基因（见序列表3)。将上述基因片段依序连接 入线性化的pSCll载体中，用酶切方法鉴定外源基因插入的正确性，并与使用VectorNTI 分析预测的酶切结果（图2)进行比对，确定正确连接的质粒（PSB8R-0VA)，并经测序验证无 误。
[0128] 二、痘苗病毒的重组和重组病毒的筛选
[0129] 在体外培养的CV-1细胞中采用脂质体转染法将PSB8R-0VA质粒转染至感染细胞 中，并利用CV-1细胞进行蓝斑筛选（图3)，连续单斑纯化5代。经基因测序并使用PCR和 WesternBlot进行分子生物学鉴定无误后，进行重组病毒（VACV-0VA+B8R)的体外增殖，并 将收获的病毒采用密度梯度离屯、进行纯化（图4)，分装后保存于-80°C。 阳130] 去除B8R基因的痘苗病毒中插入外源基因0VA，经多次连续纯化和传代，B8R稳定 缺失（图5)，插入的OVA可稳定存在（图6)，产物表达良好（图7)。图5中泳道1和2分 别为野生型痘苗病毒和VACV-0VA+产生的B8R条带，泳道3显示VACV-0VA+B8R无特异条带 产生。图6中泳道1和2分别为VACV-0VA+和VACV-0VA+B8R产生的OVA条带，泳道3显示 野生型痘苗病毒无特异条带产生。图7为用蛋白印迹法（WesternBlot)检测OVA蛋白表 达，其中泳道1-3分别为VACV-0VA\VACV-0VA+B8R和野生型痘苗病毒感染后细胞中OVA蛋 白的表达。 阳131] Ξ、痘苗病毒免疫优势等级梯度
[0132]C57化/6小鼠经腹腔感染10申即野生型痘苗病毒，7天后提取脾脏中的淋己细胞， 检测杀伤性T细胞的活化情况。结果如图8,在巧7BL/6小鼠中B8R是显性表位，它所诱导 的反应占抗痘苗病毒应答总体的30%W上。
[0133] 四、重组病毒的生物学特性
[0134] 为检测B8R缺失和外源基因插入对病毒感染复制等生物学特性的影响，对野生 型和重组病毒的生长及隧斑形成进行了对比。采用痘苗病毒、VACV-B8R、VACV-0VA+与 VACV-0VA+B8R分别感染CV-1和BSC-1细胞，在不同时间收获病毒并绘制病毒生长曲线。 VACV-0VA+B8R的生长曲线与对照组野生型痘苗病毒、VACV-OVA+和VACV-B8R均非常相似 (图9、图11)。同一时间点（感染后3天），在CV-1细胞中形成的病毒隧斑，其大小、形状 无明显差别（图11)，表明B8R缺失和/或外源OVA插入后，痘苗病毒本身的生物学特性，包 括隧斑形成和在细胞中的感染复制能力等均无明显改变。
[0135] 五、针对目的抗原的细胞毒性T细胞免疫应答
[0136] 野生型痘苗病毒诱导的针对B8R的效应杀伤性T细胞占CD8叮细胞总数的10. 3% 左右，VACV-0VAH秀导的杀伤性T细胞应答中，针对B8R的反应仍占主导（7. 8% )，但较野生 型病毒明显降低，而针对OVA的反应达到4. 7%，较之其他次要表位为高；与野生型痘苗病 毒和VACV-0VA+不同，VACV-0VA+B8R诱导的杀伤性T细胞应答中针对B8R的免疫应答被完 全消除，但可成功诱导针对OVA的特异性细胞免疫应答且应答强度居首位（图12)。显示去 除B8R后，原本在免疫优势梯度中居于次要表位的外源性抗原OVA成为显性表位，可成功诱 导较强的初次免疫应答并具有免疫记忆效应，且抗原性明显增强。
[0137] 六、小鼠感染体征及神经行为测评
[0138] 从病毒感染后第6天开始，部分小鼠出现感染体征和行为障碍，但 VACV-0VA+B8R组小鼠体重下降较VACV-0VA+组小鼠明显缓慢和轻微，而与未感染组小鼠体 重变化接近（图13)。神经行为评分的变化同样显示去除B8R可显著降低痘苗病毒的毒力 (图 14)。
[0139] 综上所述，B8R缺失和OVA导入对痘苗病毒的生物学特性无明显影响；去除B8R 后，外源性OVA成为显性表位，针对OVA的细胞免疫应答和免疫记忆效应明显增强；去除 B8R还可显著降低痘苗病毒的毒力。从而去除B8R可有效降低痘苗病毒的免疫优势效应，增 加外源性抗原的免疫原性。去除痘苗病毒本身的显性表位，可为疫苗和基因治疗提供更为 有效的载体。
[0140] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W作出若干改进和润饰，运些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种降低自身免疫优势并提高安全性的重组WR株痘苗病毒。2. 通过去除显性表位B8R重组痘苗病毒的方法，其特征在于利用病毒同源重组，以OVA 取代B8R，获得B8R基因缺失的重组痘苗病毒。包括如下步骤： 51、 构建质粒PSB8R-0VA; 52、 在CV-1细胞中与野生型痘苗病毒重组； 53、 单斑筛选获得重组病毒（VACV-0VA+B8R)。3. 根据权利要求2所述的通过去除显性表位B8R重组痘苗病毒的方法，其特征在于，在 质粒pSCll中插入B8R左右侧同源序列（分别为B8RL和B8RR)及0VA，抗性筛选标记为氨 节青霉素抗性基因。4. 根据权利要求2所述的通过去除显性表位B8R重组痘苗病毒的方法，其特征在于，所 述步骤S1的具体步骤为：以野生型痘苗病毒为模板，通过PCR获得B8R左右侧同源片段，以 B8RL替代质粒pSCl1的TKL片段，B8RR替代质粒pSCl1的TKR片段，在P7. 5启动子后插入 OVA片段。5. 根据权利要求2所述的通过去除显性表位B8R重组痘苗病毒的方法，其特征在于，利 用质粒PSB8R-0VA对野生型痘苗病毒进行同源重组，最终以OVA取代病毒中的B8R。6. 根据权利要求2通过去除显性表位B8R重组痘苗病毒的方法，其特征在于，所述步骤 32的具体步骤为：培养(^-1细胞至80%单层时，以0.05101感染野生型痘苗病毒并采用脂 质体法将PSB8R-0VA质粒转染至感染细胞中，2天后收毒。7. 根据权利要求2所述的通过去除显性表位B8R重组痘苗病毒的方法，其特征在于，利 用蓝斑筛选和密度梯度离心纯化重组病毒。8. 根据权利要求2所述的通过去除显性表位B8R重组痘苗病毒的方法，其特征在于，所 述步骤S3的具体步骤为：取步骤S2收集的病毒冻融三次并超声破碎后感染CV-1细胞，利 用X-gal进行蓝斑筛选；单斑纯化5代，鉴定无误后进行重组痘苗病毒（VACV-0VA+B8R)的 体外增殖，最后采用密度梯度离心纯化病毒。
【专利摘要】本发明公开了一种通过去除显性表位B8R重组痘苗病毒的方法及其病毒，从而降低痘苗病毒免疫优势同时提高其安全性的方法。构建以OVA替代B8R的质粒pSB8R-OVA，在CV-1细胞中与野生型痘苗病毒(WR株)重组，筛选纯化获得重组病毒。本发明去除了显性表位B8R对外源抗原免疫原性的影响，可有效降低痘苗病毒的免疫优势效应，增加外源性抗原的免疫原性，从而提高以痘苗病毒为载体的活疫苗的有效性。同时，可有效降低痘苗病毒作为疫苗载体的毒力，提高其安全性。去除痘苗病毒本身的显性表位，可为疫苗和基因治疗提供更为有效的载体。
【IPC分类】C12N7/01, C12N7/02
【公开号】CN105255840
【申请号】CN201510700706
【发明人】汪洋, 马茜, 许杰
【申请人】西安医学院
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月16日