-172146位（对应序列2的1-802位，命 名为下游同源右臂B8RR)，分别克隆替换pSCll质粒的T化和TKR，进而将OVA基因连接到 pSCll质粒的启动子P7. 5之后，得到重组质粒PSB8R-0VA。
[0054] 具体操作如下： 阳化5] 1)野生型痘苗病毒WR株基因组DNA和VACV-0VA+病毒基因组DNA提取
[0056] (1)取-80°C冻存的野生型痘苗病毒和VACV-0VA+病毒各200μ1，4°C解冻。
[0057] (2)加入等体积的PLYbuffer,縱满混匀，室溫放置15分钟。 阳化引做加入0. 5倍体积的无水乙醇，移液器混匀。
[0059] (4)转移裂解液至吸附柱中，13000rpm离屯、1分钟，将过滤柱转移至一个新的收集 管中。 W60]巧）向过滤柱中加入650μ1Washbuffer, 13000巧m离屯、1分钟，弃废液。
[0061] (6)重复洗一次，弃废液。 阳06引 （7)将过滤柱放入收集管中1300化pm离屯、2分钟W去除残留的乙醇。
[0063] (8)过滤柱放入新的收集管中，向过滤柱中加入30-50μ1DEPC水，室溫静置3分 钟。
[0064] (9) 13000巧m离屯、1分钟，洗脱DNA。 W65] (10)野生型痘苗病毒基因组DNA和VACV-OVA+基因组DNA放置于-20°C备用。
[0066]。引物设计与合成
[0067] 根据野生型痘苗病毒WR株的基因组DNA序列设计并合成如下两对引物：
[0068] 扩增B8R上游同源臂的引物对：
[0069] BS化-F1:5'-cccMGCTTatgtttctgtaagcgttggc-3^ (下划线之前部分为保护 碱基，下划线部分为Hindlll酶切位点识别序列，其后序列为GenBank:AY243312. 1的第 169650-169669位，即序列1的第1-20位）
[0070] BS化-R1:5'-ggGGTACCaatgaacaaaactgcgag-3^ (下划线之前部分为保护碱 基，下划线部分为化nl酶切位点识别序列，其后序列为GenBank:AY243312. 1的第 170589-170606位的反向互补序列，即序列1的第940-957位的反向互补序列）；
[0071] 扩增B8R下游同源臂的引物对：
[0072] B8RR-F1 ：5' -tcccCCCGGGgttaccacttttcttagcatgc-3'(下划线之前部分为保 护碱基，下划线部分为Xmal酶切位点识别序列，其后序列为GenBank:AY243312. 1的第 171345-171366位，即序列2的第1-22位）
[0073] B8RR-R1 :5' -tatGGCGCCttatagcggggagacgatc-3^ (下划线之前部分为保护 碱基，下划线部分为KasI酶切位点识别序列，其后序列为GenBank:AY243312. 1的第 172128-172146位的反向互补序列，即序列2的第784-802位的反向互补序列）。
[0074] 根据OVA基因序列设计并合成引物：
[00"7日]0VA-F1 ：5' -catRCCATGGatRRRctccatcRRCRcaR-3'(下划线之前部分为保护碱基， 下划线部分为化〇1酶切位点识别序列，其后为序列3的第1-19位）
[0076] 0VA-F2 ：5' -tcccCCCG^ttaaggggaaacacatctgc-3'(下划线之前部分为保护碱 基，下划线部分为Xmal酶切位点识别序列，其后为序列3的第1161-1180位的反向互补序 列）。
[0077]3)重组质粒PSB8R的构建及鉴定
[007引 （1)W步骤1中野生型痘苗病毒基因组DNA为模板，W步骤2中合成的B8R上下游 同源臂引物对分别进行PCR，获得带有相应酶切位点的B8R的上下游同源臂B8化和B8RR， W步骤1中VACV-OVA+基因组DM为模板，w步骤2中合成的OVA引物对进行PCR，获得带 有相应酶切位点的OVA基因片段。
[0079]PCR扩增体系为：DNA1μ1，(1ΝΤΡmix(2. 5πιΜ)5μ1，正向引物Ρ(10μΜ)1μ1，反向 引物R(10μΜ) 1μ1，10XTaqbuffer5μ1，Taq酶 1μ1，加DEPC水至总体积 50μ1。
[0080] PCR扩增条件为：95 °C预变性5分钟；95 °C变性30秒，58 °C退火30秒，72 °C延伸80 秒，循环30次；72°C延伸10分钟，最后置于4°C;
[0081]PCR扩增结果：PCR产物上样电泳，B8化为974bp，B8RR为82化P，OVA为1200bp， 切胶回收目的条带。
[0082] (2)首先用限制性内切酶化ndin和化nl对上游同源臂B8化进行双酶切，与经同 样双酶切的pSCl1质粒的大片段进行连接，得到中间质粒pSC-A，接着用限制性内切酶Xmal 和KasI对下游同源臂B8RR进行双酶切，与经同样双酶切的中间质粒pSC-A的大片段进行 连接，得到中间质粒pSC-B，最后用限制性内切酶化〇1和Xmal对OVA基因片段进行双酶切， 与经同样双酶切的中间质粒pSC-B的大片段进行连接，获得重组质粒，酶切和测序鉴定无 误后，得到质粒PSB8R-0VA。
[0083] 2、痘苗病毒的重组和筛选
[0084] 1)痘苗病毒重组
[0085] (1)^了25培养瓶培养〇^-1细胞至80%单层；
[0086] 似W0. 05M0I感染野生型痘苗病毒，37°C培养2小时；
[0087] (3)去除病毒液，按照转染试剂Lipofectamine2000说明书转染pSBSR-OVA至感 染细胞中，培养48小时；
[0088] (4)收集细胞，反复冻融Ξ次，进行超声破碎后，保存于-80°C。
[0089]2)重组痘苗病毒的筛选
[0090] (1)用6孔板培养CV-1细胞至80 %单层； 阳0川 似取经超声破碎后的病毒悬液，做倍比稀释，感染CV-1细胞，37°C培养2小时；
[0092](3)每孔覆盖3ml琼脂培养基，培养2天；
[0093] (4)每孔加入2ml含X-gal的上层琼脂培养基，培养过夜；
[0094](5)观察蓝斑产生情况，挑取孤立蓝斑进行进一步筛选，连续单斑纯化5代，至病 毒纯化。 阳0巧]3、重组痘苗病毒的鉴定
[0096] 将经多次单斑纯化的重组病毒进行小量增殖，然后进行PCR、基因测序和Western Blot等分子生物学鉴定。
[0097] 1)PCR和基因测序鉴定
[0098] (1)提取经小量增殖的重组痘苗病毒的基因组DNA;
[0099] 似鉴定引物设计： 阳100]B8R鉴定引物：
[0101] B8R-JDF1 :5, -CATGCCATTATGATAAGTAC-3,（VACV-WR第 170296-170215 位）
[0102] B8R-JDR1 :5' -TTGTTCGGTAACGGATAGAC-3'（VACV-WR第 171919-171938 位的反向 互补序列） 阳103]OVA鉴定引物：
[0104]OVA-Fl:5'-CATGCCATGGATGGGCTCCATCGGCGCAG-3' 阳105] OVA-Rl: 5'-TCCCCCCGGGTTAAGGGGAAACACATCTGC-3' 阳106] (3)W纯化的重组痘苗病毒的基因组DM为模板，用上述3对鉴定引物进行PCR检 测反应，同时分别设置野生型VACV-WR和/或VACV-0VA+的DNA为模板的对照。
[0107] PCR扩增体系为： 阳10引 DNA 1μΙ dNTPmix (2. 5mM) 5μΙ 正向引物F (10μΜ) 1μΙ 反向引物R (10μΜ) ΙμΙ lOXTaqbuffer 5μ1 Taq酶 1μI 加化PC水 至总体积50μΙ
[0109]PCR扩增条件为：95°C预变性5分钟；95°C变性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸 100秒，循环30次；72°C延伸10分钟，最后置于4°C;
[0110] (4)PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，观察结果并回收目的片段，将回收的目 的片段送测序。 阳111] 2)目的蛋白鉴定
[0112] (1)小量增殖经纯化的重组痘苗病毒，至70%细胞病变时，收取细胞；
[0113] (2)离屯、，将上清转移至15ml离屯、管内，加入等体积饱和硫酸锭溶液，置于旋转摇 床4°C过夜，使蛋白质充分沉淀；
[0114] 0)细胞用PBS洗两次后，加1mlRIPA裂解液混匀，摇床冰上震荡1小时， 4°C/1200化pm离屯、10分钟，取上清置于新的1.5ml离屯、管中，-20°C过夜后，将上清液 4°C/1200化pm离屯、10分钟，弃上清保留沉淀；
[0115] (4)将上述两步收获的混匀，-20°C保存备用。
[0116] (5)按照改良的BCA蛋白定量分析试剂盒提供的蛋白定量方法，进行蛋白的定量 分析。一抗采用兔抗OVA抗体，二抗采用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，暗室中进行曝 光检测重组痘苗病毒的OVA蛋白表达。
[0117] 4、重组