表达猪类病毒基因的浣熊痘病毒的制作方法

专利名称：表达猪类病毒基因的浣熊痘病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及表达单独猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)基因或其与猪圆环病毒 (PCV)基因的组合的新颖重组浣熊痘病毒载体、及所述载体作为疫苗在由PCV及/或PRRSV 所引起的疾病预防中的用途。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)是正链RNA病毒，其是动脉病毒科 (Arteriviridae)动脉病毒属(genus Arterivirus)家族的成员。PRRSV感染猪，引起最初 于1987年在北美检测到的"神秘猪疾病"，随后所述疾病在1990年传播至欧洲并传遍欧洲。 自1990年以来，PRRSV已成为猪产业的主要全球性威胁，给猪群造成严重生产损失。
现称为猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)的神秘猪疾病(也称为蓝耳病、猪流行性流产 及呼吸综合症(PEARS)或呼吸综合症(SIRS))的特征在于妊娠母猪的繁殖障碍，此导致妊 娠期的最后阶段期间异常高数量流产、厌食症、死产、干瘪胎儿、母猪分娩后呼吸问题及仔 猪虚弱(出生之后不久即死于呼吸系统疾病或二次感染)。在仔猪中，感染PRRSV造成呼吸 窘迫及可能高达70%及更高仔猪死亡率的高死亡率。年长猪可能显示呼吸系统疾病或二次 感染的轻微体征。所述病毒在猪群体中快速传播，且畜群中高达95%的猪在最初感染后两 个至三个月内可能变成血清阳性。即使感染已经稳定化，也存在通过排菌幼小雌猪散布的 PRRSV将感染妊娠母猪及再次发生繁殖问题的强烈可能性。PRRS对猪饲养畜群的经济影响 相当大。 引起神秘猪疾病且首先在荷兰被分离出来的PRRSV称为莱利斯塔德病毒 (Lelystad virus) (LV)(温斯伍特(G. Wesvoort)等人，兽医季刊(Vet. Quarterly) 3 : 121-130(1991))。其后不久，在西班牙发现不同的01ot分离株(普拉纳(Plana)等人，兽医 微生物学(Vet. Microbiol. )，33 :203.211,1992)。随后，PRRSV的新颖分离株在若干公开案 中予以阐述(参见，例如，欧洲专利申请案第0529584A2号、W0 93/06211及WO 93/07898)。
其它公开案揭示PRRS病毒分离株的结构特征，例如全部莱利斯塔德病毒(LV)基 因组(蒙勒伯格(J. J. M. Meulenberg)等人，"猪流行性流产及呼吸综合症(PEARS)的致病因 子莱禾鹏塔德病毒与LDV及EAV有关(Lelystad virus, the causative agent ofporcine epidemic abortion and respiratory syndrome, is related to LDV and EAV)，，，病毒学 (Virology) 192 :62-72(1993));图宾根(Tubingen)(德国)PRRS病毒分离株(TV)基因组的 区段(考再曼(K-K. Cozelma皿)等人，"动脉病毒属成员猪繁殖与呼吸综合症病毒的分子表 征(Molecular characterization of porcine reproductive and respiratorysyndrome virus, a member of the Arterivirus group)"，病毒学193 :329-339(1993))及允许基因 克隆及测序的其它分离株。 通常，动脉病毒的病毒粒子直径为50-70nm且含有同质异构(很可能为二十面 体)核衣壳，所述同质异构核衣壳的直径为35nm，由紧密粘附的包膜围绕且具有蜂巢状表 面结构。基因组由单个线性正义ssRNA分子(尺寸为13-15kb)组成。PRRS病毒的尺寸为50-60nm，在核衣壳内含有约30_35nm的包膜及单个RNA分子。PRRSV的基因组RNA约为 15kb (15000个碱基对)。所述基因组编码RNA复制酶(0RFla及0RFlb)、糖蛋白GP2至GP5、 整合膜蛋白M及核衣壳蛋白N(ORF 2至7)。基因组RNA是经由全长反义复制中间体合成。
PRRSV基因组的单链RNA分子在3'末端含有多聚腺苷酸尾(poly-A tail)。所述 结构含有7个编码病毒蛋白的开放读码框(ORF)。 0RF1至0RF7之间显示小重叠区段。病 毒蛋白的合成是自具有不同长度亚基因组转录物(mRNA)但具有相似的3'多聚腺苷酸化 末端、及源自非编码5'末端序列的5'前导序列的群组产生。所述病毒蛋白表达形式视为 巢式mRNA，且先前已对冠状病毒予以阐述(斯巴安(W.J.M. Spaan)等人，普通病毒学杂志 (J. Gen. Virol. )69 :2939-2952 (1988))。基于莱利斯塔德(LV)及图宾根(TV) PRRSV病毒分 离株核苷酸序列且通过与用其它动脉病毒所观察到者同源，已提出在病毒基因组中ORFl(a 及b)编码病毒聚合酶及复制酶。0RF2至0RF6编码病毒包膜蛋白，且0RF7编码核衣壳蛋 白。病毒复制酶及聚合酶是大尺寸蛋白，分别为260kDa及163kDa，且两者均含有三个可能 的糖基化位点。位于3'末端的包膜蛋白(ORF 2至6)较小，介于30kDa与19kDa之间。所 有所述都含有两个以上可能的糖基化位点，尤其0RF3含有7个位点。所有所述蛋白都在氨 基(N-)及羧基(C-)末端含有疏水性序列，其可作为前导序列及膜锚着点。通常，其为疏水 性蛋白，此与其与膜相关联的位置一致。0RF6具有3个位于在N末端的90个氨基酸残基内 的疏水性区段。由0RF7编码的蛋白(可能对应于病毒核衣壳)与在N末端的精氨酸、赖氨 酸及组氨酸残基一起极具碱性。LV及TV病毒聚合酶、结构蛋白及核衣壳的氨基酸序列与 LDV病毒相比显示介于29%与67%之间的一致性，且与EAV病毒相比显示介于20%与36% 之间的一致性。 由PRRSV引起的疾病给全球猪产业造成严重损失。为此，人们已研究开发能够预 防由PRRSV引起的感染的疫苗。以前疫苗研发的原理是PRRSV可在宿主细胞(猪)的基本肺 泡巨噬细胞及在猴肾细胞系中生长的事实。在很大程度上，曾在W092/21375、W0 93/06211、 W0 93/07898及西班牙专利第P9301973号中阐述的抵抗PRRSV的先前疫苗是获自在巨噬 细胞上生长的病毒并随后经灭活的常用疫苗。揭示所述疫苗能够避免猪繁殖与呼吸综合症 (PRRS)并预防母猪繁殖变异。 也对猪兴隆具有重要意义者是另一种广泛传播的称为断奶后多系统衰竭综合症 (P丽S)的疾病。P丽S(通常侵袭约5-18周龄的断乳仔猪)以流行比例对猪造成当前或潜在 的健康威胁，并严重影响全球猪产业的经济利益。P丽S的临床体征由渐进性体重损失、呼吸 困难、呼吸急促、贫血、腹泻及黄疸组成。尽管在断乳仔猪中更为普遍，但所述衰弱性疾病可 侵袭包括猪、公猪及成年猪在内的任何猪家族动物。死亡率可自1%至2%不等，且在一些 复杂情形下全世界死亡率可高达40%。已确定猪圆环病毒2型(通常称为PCV-2)是P丽S 的主要致病因子(艾伦(G.M. Allan)等人，"来自患有消耗性疾病综合症的猪的新颖猪圆环 病毒(Novel porcine circoviruses from pigswith wasting disease syndromes)，，，兽医 记录(Vet. Rec.)，第142巻，第467-468页，1998 ;艾伦(G.M.Allan)等人，"在美国及欧洲 自患有消耗性疾病的猪分离猪圆环病毒类病毒(Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USAand Europe)"，兽医学诊断石开究 杂志(J. Vet. Diagn. Invest.)，第10巻，第3-10页，1998)。因此，在商业猪事务内，通过研 发抵抗PCV2(P丽S的病原体)的有效疫苗以对具有危险的动物实施大规模疫苗接种来预防猪家族中P丽S发作是重要目标。 美国专利第6，217，883号(与法国专利第2， 781， 159B号对应)涉及5种经分 离PCV菌株及其与至少一种猪细小病毒抗原的组合在多价免疫原性组合物中的用途，所述 PCV菌株来自自加拿大、加利福尼亚及法国感染P丽S的猪取样的肺部或神经节样品。由 0RF1至0RF13组成的PCV2开放读码框(ORF)编码的蛋白质在所述专利中予以粗略阐述，但 无展示免疫原性特性的任何具体蛋白质的例证。所述专利揭示由DNA质粒、线性DNA分子 及含有并在活体内表达编码PCV抗原的核酸分子的重组病毒组成的载体。
美国专利第6， 368， 601号涉及分离自肺部或神经节样品的新颖猪圆环病毒菌株， 所述肺部或神经节样品获自受断奶后多系统衰竭综合症(P丽S)侵袭的农场。具体来说， 所述专利阐述所述菌株的经纯化制备品、常用减毒疫苗或灭活疫苗、重组活疫苗、质粒疫苗 及亚单位疫苗以及试剂及诊断方法。所述专利进一步揭示包含经分离DNA分子序列的载 体，所述经分离DNA分子序列可用于在活体外表达载体中产生亚单元或用作拟整合至病毒 或质粒型活体内表达载体中的序列。所述专利粗略阐述猪疱疹病毒、猪腺病毒或痘病毒且 更具体来说阿捷申氏病(Aujesky' s disease)病毒、牛痘病毒、鸟痘病毒或猪痘病毒的载 体。 先前，某些猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)基因(0RF2、0RF3、0RF4、0RF5、0RF6、 0RF7)已在不同载体系统中表达杆状病毒、伪狂犬病病毒、TGEV及质粒DNA。所有所述表 达系统都受能够在一个病毒构建体中表达仅一个或两个开放读码框所限制。
例如，美国专利第5， 888， 513号涉及猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)的致病病毒的重 组蛋白，其与PRRSV西班牙分离株(PRRS-01ot)的0RF2至0RF7相对应，其已在杆状病毒表 达系统中使用Sf 9(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)昆虫细胞)细胞培养物作为容 许宿主产生。所述专利阐述适于调配能够保护猪家畜免于PRRS的疫苗且适于制备用以检 测抗PRRSV抗体以及猪生物样品中的PRRSV的诊断试剂盒的重组蛋白。具体来说，所述专利 涉及包含重组杆状病毒的重组表达系统及表达来自至少一种经分离核苷酸序列的经分离 病毒亚单位蛋白的方法，所述至少一种经分离核苷酸序列选自由来自杆状病毒转移载体的 PRRS-01ot分离株的0RF2至0RF7组成的群组。所述专利也阐述含有至少一种重组PRRSV 蛋白的重组疫苗。 存在大量关于用于表达猪抗原且用作疫苗的重组浣熊痘病毒主题的出版资料。例 如，美国专利第6， 294， 176号揭示一种重组浣熊痘病毒(RCNV)载体，其使猪繁殖与呼吸综 合症病毒(PRRSV)、猪流感病毒血凝素(SIV HA)、猪流感病毒神经氨酸酶(SIV NA)及猪细 小病毒(PPV)的开放读码框(0RF)的一个或两个外来DNA序列(例如PRRSV的0RF 2_7中 的一个)插入浣熊痘病毒基因组的HindIII "U"基因组区域、HindIII "M"基因组区域或 HindIII "N"基因组区域内的非必需区域中。在所述专利中阐述淙熊痘病毒病毒基因组在 所述病毒基因组的浣熊痘病毒宿主范围基因中含有缺失。所述专利通过向浣熊痘病毒基因 组中插入外来DNA序列提供用于产生重组浣熊痘病毒的同源载体。在实例中，所述专利仅 显示如何预备将外来DNA插入至HindIII "U"基因组区域中。DNA序列分析显示，专利权所 有人所揭示的HindIII "U"基因组区域并非重组淙熊痘病毒基因组的血凝素(ha)及/或 胸苷激酶(tk)插入区域。 美国专利第7， 109， 025号揭示使用重组猪腺病毒的病毒载体及疫苗。具体来说，所述专利阐述活体内复制及包含异源核苷酸序列的重组猪腺病毒，所述异源核苷酸序列在 能够使猪腺病毒在活体内复制并表达所插入异源核苷酸序列的条件下插入至猪腺病毒中。 所述专利进一步阐述使用来自猪腺病毒(PAV)血清型3或5(PAV-3或PAV-5)的腺病毒 基因组并插入异源核苷酸序列，所述异源核苷酸序列编码至少一种在位于主要晚期启动子 (MLP)下游的PAV-3或PAV-5基因组的E3区域的非必需区中的产物。所述专利也涉及包 含所有或部分参考核苷酸序列的DNA片段。显示重组PAV载体可表达选自由下列组成的群 组的猪病原体伪狂犬病病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、细小病毒、猪霍乱病 毒、猪圆环病毒2型、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)及猪肺炎支 原体(Mycoplasma hyopneumoniae)。 美国专利第6， 497， 883号涉及含有来自猪圆环病毒2型的外来DNA的重组痘病毒 (例如鸟痘病毒)的用途与治疗或预防由猪圆环病毒2型引起的疾病的方法。具体来说，所 述专利的重组痘病毒包含由猪圆环病毒2型的0RF1至13组成的经分离DNA分子，其中所 述重组痘病毒是重组ALVAC金丝雀痘病毒。 美国专利第7， 211， 379号涉及通过借助投与包含PCV_2抗原的免疫原性组合物诱 发抵抗PCV-2的免疫反应来降低猪中猪圆环病毒2型(PCV-2)的病毒负荷的方法。所述专 利将所述抗原阐述为含有外源PCV-2核苷酸序列的载体，其中所述PCV-2核苷酸序列编码 并表达0RF4、 0RF13或0RF4及0RF13。在所述专利中所示的一些实施例中，免疫原性组合 物包括一或多种其它猪病原体。所述专利所揭示的方法中所用的组合物另外包含至少一 种来自至少一种其它猪病原体的免疫原或表达所述免疫原的载体，其中所述其它猪病原体 选自由下列组成的群组PRRS、猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌(Escherichia coli)、萎縮性鼻炎、伪狂犬病、猪霍乱、猪流感、脑心肌炎病毒及PPV。所述专利中所揭示的 载体包含DNA载体质粒、诸如大肠杆菌等细菌、诸如下述病毒杆状病毒、包括猪疱疹病毒 或阿捷申氏病病毒(伪狂犬病)的疱疹病毒、包括猪腺病毒的腺病毒及包括牛痘病毒、鸟痘 病毒、金丝雀痘病毒、浣熊痘病毒及猪痘病毒的痘病毒。 美国专利第6， 241， 989号及其续篇美国专利第7， 087， 234号的揭示内容涉及含有 一种以上插入至胸苷激酶基因或血凝素基因中的外源基因的多价重组淙熊痘病毒。在所述 两个相关专利中所揭示的内容是所述多价重组浣熊痘病毒作为疫苗来赋予猫抵抗随后猫 病原体的攻击的免疫性的用途。也揭示通过重组过程制造多价重组浣熊痘病毒的方法，所 述重组过程涉及构建插入载体(外源基因插入至其中)；及使插入基因的侧翼是可重组至 浣熊痘病毒胸苷激酶基因或血凝素基因中的序列；向易感染宿主细胞中引入含有所述外源 基因的插入载体及浣熊痘病毒二者；及自所得蚀斑中选择重组浣熊痘病毒。所述专利的多 价重组浣熊痘病毒可在猫细胞中感染并复制，且含有一个以上插入至非病毒复制所必需的 由淙熊痘病毒基因组的血凝素基因或胸苷激酶基因组成的区域中的外源基因，值得注意的 是，其中所述外源基因可操作地连接于用于表达的启动子；且每一外源基因编码猫病原体 抗原。所述专利阐述编码诸如下述猫病原体抗原的外源基因猫白血病病毒(FeLV Env)、 猫免疫缺陷病毒(FIV Gag)、猫免疫缺陷病毒(FIV Env)、猫传染性脑膜炎病毒(FIPV M)、 猫传染性脑膜炎病毒(FIPV N)、猫杯状病毒(FCV衣壳蛋白)、猫泛白细胞减少症病毒(FPV VP2)及狂犬病-G。 除兽医疫苗技术中所作的所有努力外，业内仍公认需要可充分地保护猪不受一或
7多种病毒感染的安全且有效的单价或多价PCV及/或PRRSV重组疫苗。也需要通过投与能 够给与猪抵抗P丽S及/或PRRS的充分保护性免疫反应的重组疫苗来预防由PCV及/或 PRRSV引起的感染或疾病的安全且有效的方法。在投与猪后除获得安全性及功效外，通过所 述重组疫苗也将获得优于常用灭活PRRSV疫苗的其它益处，即消除意外感染游离病毒或回 复至其病原性状态的灭活病毒的风险。显然，研发安全且有效的以浣熊痘病毒为载体的猪 疫苗在使用时将达成重要优点，其可预防严重猪疾病、确保疫苗生产期间雇员安全且完全 消除病原性病毒未亡灭活的任何机会及商业生产中所用的去污染程序。
本说明书中所引用的所有专利及出版物的全文都以引用方式并入本文中。

发明内容
在本发明的最广泛方面中，本发明提供安全且有效的重组痘病毒载体疫苗，其中 所述载体表达一或多种由一或多种猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)分离株编码的抗原 蛋白，优选为在ha及/或tk基因座的一或多种猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)分离株 的多个开放读码框单独或与一或多个猪圆环病毒2型(PCV-2)的开放读码框组合所编码的 抗原蛋白。在一特定实施例中，所述载体进一步包含编码带有FeLV P27+表型的猫白血病 病毒的糖蛋白的核酸分子。FeLV P27+或PCV-2衣壳基因可用作筛选不同组合中的无性系 的单标签。本发明也提供通过向需要保护的猪投与强效新颖重组疫苗来保护猪抵抗断奶后 多系统衰竭综合症及/或猪繁殖与呼吸综合症的方法。 因此，本发明第一方面提供包含一或多个编码猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV) 蛋白的外源核酸分子的重组浣熊痘病毒载体(rRCPV)，其中 a.)至少一个核酸分子插入至所述浣熊痘病毒基因组的血凝素基因座或胸苷激酶 基因座中；或 b.)至少两个核酸分子插入至所述浣熊痘病毒基因组的血凝素基因座或胸苷激酶 基因座中；或 c.)至少一个核酸分子插入至血凝素基因座中且至少一个核酸分子插入至浣熊痘 病毒基因组的胸苷激酶基因座中；或 在一个实施例中，所述浣熊痘病毒载体包含至少两个插入至血凝素基因座中的核
酸分子及至少两个插入至浣熊痘病毒基因组的胸苷激酶基因座中的核酸分子。 在一个实施例中，所述重组浣熊痘病毒载体进一步包含除在所述浣熊痘病毒基因
组的胸苷激酶及血凝素基因座外也在所述浣熊痘病毒基因组的第三非必需位点中插入编
码猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)蛋白的核酸分子。重组浣熊痘病毒基因组的任何非必
需位点都可涵盖用于本发明。 在一个实施例中，浣熊痘病毒基因组的第三非必需位点是丝氨酸蛋白酶抑制剂位 点。 在一个实施例中，一或多个外源核酸分子的每一个都编码一或多个猪繁殖与呼吸 综合症病毒的开放读码框。所述开放读码框选自由0RF1、 0RF2、 0RF3、 0RF4、 0RF5、 0RF6、 0RF7及其组合组成的群组。 在一个实施例中，所述痘病毒载体编码相同猪繁殖与呼吸综合症病毒蛋白的至少 两个拷贝。相同蛋白的所述两个拷贝可由两个不同核酸分子编码，或其可由相同核酸分子编码。相同蛋白的所述两个拷贝可操作地连接于一个启动子，或相同蛋白的所述两个拷贝 可操作地连接于各别启动子。相同蛋白的所述两个拷贝可由选自由0RF1 、0RF2、0RF3、0RF4、 0RF5、 0RF6、 0RF7及其组合组成的群组的猪繁殖与呼吸综合症病毒开放读码框编码。
在一个实施例中，两个或更多个核酸分子插入至淙熊痘病毒基因组的血凝素基因 座及/或胸苷激酶基因座中。 在一个实施例中，两个或更多个外源核酸分子编码至少两个选自由下列组 成的群组的猪繁殖与呼吸综合症病毒的开放读码框0RF5-0RF6、 0RF5-0RF6-0RF7、 0RF3-0RF5-0腦、0RF3-0RF4-0RF7、 0RF3-0RF4-0RF5-0RF7、 0RF3-0RF4-0RF6-0RF7及 0RF3-0RF4-0RF5-0RF6-0RF7 。 在一个实施例中，猪繁殖与呼吸综合症病毒是ISU12(爱荷华州)、Olot/91 (西班
牙)或二者。 在一个实施例中，所述重组浣熊痘病毒载体进一步包含编码猪圆环病毒2型
(PCV2)的开放读码框(ORF)的核酸分子。 在一个实施例中，猪圆环病毒2开放读码框是0RF2。 在一个实施例中，PCV20RF2可单独插入至浣熊痘病毒基因组的胸苷激酶基因座 中。 在一个实施例中，所述重组浣熊痘病毒载体进一步包含编码猫白血病病毒P27+表 型的糖蛋白的核苷酸序列。 在一个实施例中，浣熊痘病毒是活病毒且可复制。 本发明第二方面提供包含免疫有效量的一或多种任何本文所述重组浣熊痘病毒 载体及任选地适宜载剂、稀释剂或佐剂的重组猪疫苗。 在一个实施例中，所述重组猪疫苗包含免疫有效量的两种或更多种本文所述重组
浣熊痘病毒载体及任选地适宜载剂或稀释剂。 在一个实施例中，浣熊痘病毒是活病毒且可复制。 在一个实施例中，所述疫苗不含佐剂。 在一个实施例中，所述疫苗以单次剂量或重复剂量投与。 在一个实施例中，所述重组猪疫苗进一步包含至少一种其它猪抗原。其它猪抗原 选自由下列组成的群组猪肺炎支原体抗原、副猪嗜血杆菌抗原、多杀巴斯德菌抗原、猪链 球菌抗原、胸膜肺炎放线杆菌抗原、支气管败血性博德特菌抗原、猪霍乱沙门氏菌抗原、猪 丹毒杆菌抗原、钩端螺旋体细菌抗原、猪流感病毒抗原、猪细小病毒抗原、大肠杆菌抗原、猪 呼吸冠状病毒抗原、轮状病毒抗原、阿捷申氏病的致病病原体抗原、猪传染性胃肠炎抗原及 其组合。 本发明第三方面提供诱发抵抗猪繁殖与呼吸综合症病毒的免疫反应的方法，其包
含向猪类动物投与由一或多种本文所述重组浣熊痘病毒载体构成的重组猪疫苗。 在一个实施例中，所述免疫反应是体液或抗体调介的反应。在一个实施例中，所述
免疫反应是细胞调介或T细胞调介的免疫反应。 在一个实施例中，所述保护性免疫反应是通过投与介于约4. 5Logl。TCID5。/ml至约 7. 5Logl。TCID5。/ml范围内的疫苗剂量诱发。 在一个实施例中，用于诱发免疫反应的重组猪疫苗包含一或多种活的且可复制的
9重组浣熊痘病毒载体。 在一个实施例中，用于诱发免疫反应的重组猪疫苗包含两种或更多种活的且可复 制的重组浣熊痘病毒载体。 本发明第四方面提供预防猪繁殖与呼吸综合症及断奶后多系统衰竭综合症的方
法，其包含向需要保护的猪类动物投与包含免疫有效量的一或多种本文所述重组浣熊痘病
毒载体及任选地适宜载剂、稀释剂或佐剂的重组猪疫苗。 在一个实施例中，所述重组浣熊痘病毒载体是活载体且可复制。 本发明第五方面提供本发明任一载体或疫苗的用途，其用以制备用于诱发对抗哺
乳动物猪类病毒的保护性免疫反应或预防哺乳动物猪繁殖与呼吸综合症及/或断奶后多
系统衰竭综合症的药剂。


图1是pFD2000A-FDAH质粒的核酸序列(SEQ ID NO :1) 图2是pFD2001TK-FDAH质粒的核酸序列(SEQ ID NO :2) 图3是pFD2003SEL-FDAH质粒的核酸序列(SEQ ID NO :3) 图4是pFD2003SEL-GPV-PV-FDAH质粒的核酸序列(SEQ ID NO :4) 图5是PCV2A 0RF2-FDAH的核酸序列(SEQ ID NO :5) 图6是PCV2B 0RF2-FDAH的核酸序列(SEQ ID NO :6) 图7是PRRSV ISU12-0RF3-FDAH的核酸序列(SEQ ID NO :7) 图8是PRRSV ISU12-0RF4-FDAH的核酸序列(SEQ ID NO :8) 图9是PRRSV ISU12-0RF5-FDAH的核酸序歹lj (SEQ ID NO :9) 图IO是PRRSV ISU12-0RF6-FDAH的核酸序列(SEQ ID NO :10) 图11是PRRSV ISU12-0RF7-FDAH的核酸序列(SEQ ID NO :11) 图12是PRRSV 01ot91-0RF5_FDAH的核酸序列(SEQ ID NO :12)
具体实施例方式
在阐述本发明方法及治疗方法学之前，应了解本发明并不限于所述特定方法及实
验条件，因为所述方法及条件可以变化。也应了解，本文所用的术语仅出于阐述特定实施例
的目的而非意欲限制本发明的范围，因为本发明的范围仅受限于随附权利要求书。 除非上下文另外明确指出，否则本说明书及随附权利要求书中所用的单数形式
"一 (a、an)"及"所述(the)"包括复数个指示物。因此，例如，"所述方法"的指示物包括一
或多种方法及/或本文所述类型步骤及/或在阅读本揭示内容后所属领域的技术人员显而
易见者等。 因此，在本申请案中，可使用所属领域的技术人员所熟知的常用分子生物学、微 生物学及重组DNA技术。文献中对所述技术进行了充分阐释。参见，例如，伯德(Byrd， CM)及赫鲁比(Hruby， DE)，分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)，第269 巻牛痘病毒及痘病毒学(Vaccinia Virus and Poxvirology)，第3章，第31-40页；萨 姆布鲁克(Sambrook)，弗里茨赫(Fritsch)及玛尼蒂斯(Maniatis)，分子克隆实验室 手册(Molecular Cloning :A Laboratory Ma皿al)，第二版(1989)冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，纽约(本文中"萨姆布鲁克等人， 1989") ;DNA克隆实践途径(DNA Cloning :A Practical Approach)，第I及II巻(格 洛弗(D.N. Glover)编辑，1985);寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(给特 (M. J. Gait)编辑，1984);核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)(黑姆斯(B. D. Hames) 及希金斯(S. J. Higgins)编辑，(1985));转录及转i華(Transcription And Translation) (黑姆斯及希金斯编辑，(1984));动物细胞培养(Animal Cell Culture)(弗莱士尼 (R. I. Freshney)编辑，(1986));固定化细胞及酶(Immobilized Cells And Enzymes) (IRL出版社，(1986));珀巴奥(B. Perbal)，分子克隆的实践指导(A Practical Guide To Molecular Cloning) (1984);奥苏贝尔(F. M. Ausubel)等人(编辑)，现代分子生物学实验 技术(Current Protocols in MolecularBiology)，约翰威利父子出版公司(John Wiley & Sons) (1994)。 尽管任何与本文所述方法及材料类似或等效者都可用于本发明的实践或测试中， 但目前所述是优选方法及材料。本文所提及的所有出版物的全文都以引用方式并入本文 中。 定义 本文所用的术语具有所属领域的技术人员所公认及习知的含义，然而，为方便及 完整起见，下文将对特定术语及其含义予以阐明。 术语"约"意指在20%内，更优选在10%内且更优选在5%内。
术语"佐剂"是指可增强对抗原的免疫反应的化合物或混合物。佐剂可用作缓慢释 放抗原的组织库，且也可用作非特异性增强免疫反应的淋巴样系统激活剂(胡德(Hood)等 人，免疫学(Immunology)，第二版，1984，本杰明/卡明门洛园(Benjamin/Cummings :Menlo Park)，加利福尼亚，第384页)。视环境而定，在无佐剂存在下单独用抗原实施基本攻击可 能不能引发体液或细胞免疫反应。佐剂包括但不限于完全弗氏佐剂(complete Freund' s adjuvant)、不完全弗氏佐剂、皂苷、诸如氢氧化铝等矿物凝胶、诸如溶血卵磷脂等表面活性 物质、普流尼克(pluronic)多元醇、聚阴离子、肽、油或烃乳液、钥孔虫戚血兰素、二硝基苯 酚及潜在有用的人类佐剂，例如BCG(卡介苗(bacille Calmette-Guerin))及短小棒状杆 菌(Corynebacterium parvum)。优选地，佐剂是医药上可接受的佐剂。 术语"抗原"是指可在动物中剌激抗体产生或T细胞反应的化合物、组合物或免疫 原性物质，包括注射或吸收至动物中的组合物。所述术语可用以指单个大分子或指抗原性 大分子的均质或异质群体。抗原与特定体液或细胞免疫的产物反应。术语"抗原"广义上涵 盖包括蛋白质、多肽、抗原蛋白片段、核酸、寡糖、多糖、有机及无机化学品或组合物及诸如 此类在内的部分。而且，抗原可衍生自或获自任何病毒、细菌、寄生虫、原生动物或真菌，且 可为整个生物体。术语"抗原"包括所有相关抗原表位。类似地，表达抗原的寡核苷酸或多核 苷酸(例如在核酸免疫应用中)也包括于所述定义中。也包括合成抗原，例如，多表位、侧翼 表位及其它重组或合成衍生抗原(伯格曼(Bergmann)等人，(1993)欧洲免疫学杂志(Eur. J. Immunol.) 23 :27772781 ;伯格曼等人，(1996)免疫学杂志(J. Immunol.) 157 :3242 3249 ; 苏赫贝尔(Suhrbier， A.) (1997)免疫学与细胞生物学(Immunol, and Cell Biol. )75: 402408 ;加德纳(Gardner)等人，(1998)第12届世界AIDS会议，日内瓦(Geneva)，瑞士， 1998年6月28日至7月3日)。
"由…编码"或"编码"是指编码多肽序列的核酸序列，其中所述多肽序列含有具有 至少3个至5个氨基酸、更优选至少8个至10个氨基酸、且甚至更优选至少15个至20个 氨基酸的氨基酸序列，由所述核酸序列编码的多肽。也涵盖可与由所述序列编码的多肽在 免疫学上视为一致的多肽序列。因此，抗原"多肽"、"蛋白质"或"氨基酸"序列可与抗原的 多肽或氨基酸序列具有至少70%相似性，优选至少约80%相似性，更优选约90_95%相似 性且最优选约99%相似性。 本文所用的术语"外源"意欲涵盖在浣熊痘病毒基因组外部产生、起源、衍生或发 展者，即，自痘病毒基因组外部起源，例如，自相对于浣熊痘病毒基因组视为外来的PRRSV 获得或分离的基因物质。 在本发明上下文中所用的"基因"是遗传功能所相关的核酸分子(染色体、质粒 等)中的核苷酸序列。基因是(例如)生物体的遗传单位，其包含在生物体基因组内占据特 定物理位置("基因基因座(gene locus)"或"遗传基因座(genetic locus)")的多核苷酸 序列(例如，哺乳动物的DNA序列)。基因可编码所表达的产物，例如多肽或多核苷酸(例 如，tRNA)。或者，基因可界定特定事件/功能的基因组位置，例如蛋白质及/或核酸的结合 (例如，噬菌体附着位点)，其中所述基因不编码所表达的产物。通常，基因包括诸如多肽编 码序列等编码序列及诸如启动子序列、多聚腺苷酸化序列、转录调控序列(例如，增强子序 列)等非编码序列。许多真核基因具有由"内含子"(非编码序列)中断的"外显子"(编 码序列)。在某些情形下，基因可与一或多个另外基因(例如，重叠基因)共享序列。
对抗原或疫苗组合物的"免疫反应"是在个体中形成对存在于所关注抗原或疫苗 组合物中的分子的体液及/或细胞调介的免疫反应。对本发明来说，"体液免疫反应"是抗 体调节的免疫反应，且涉及产生对本发明抗原/疫苗具有亲和性的抗体，而"细胞调介的免 疫反应"是由T淋巴细胞及/或其它白细胞调介的免疫反应。"细胞调介的免疫反应"是通 过递呈与主要组织相容性复合物(MHC)的I型或II型分子相关联的抗原表位而引发。此激 活抗原特异性CD4+T辅助细胞或CD8+细胞毒性T淋巴细胞("CTL") 。 CTL对与主要组织 相容性复合物(MHC)所编码且在细胞表面上表达的蛋白质一起递呈的肽抗原具有特异性。 CTL帮助诱发及促进细胞内微生物的细胞内破坏或感染所述微生物的细胞溶解。细胞免疫 的另一方面涉及辅助T细胞的抗原特异性反应。辅助T细胞用于帮助剌激所述功能，并使 非特异性效应细胞的活性集中抵抗在表面上显示肽抗原与MHC分子的细胞。"细胞调介的免 疫反应"也是指产生细胞因子、趋化因子及激活T细胞及/或其它白细胞所产生的其它分子 (包括衍生自CD4+及CD8+T细胞者)。特定抗原或组合物剌激细胞调介的免疫反应的能力 可通过数种分析法测定，例如通过淋巴组织增生(淋巴细胞激活)分析法、CTL细胞毒性细 胞分析法、通过分析对经敏化个体中的抗原具有特异性的T淋巴细胞、或通过测量T细胞响 应抗原再剌激而产生的细胞因子。所述分析法已为所属领域的技术人员所熟知。参见，例 如，埃里克森(Erickson)等人，免疫学杂志(J. Immunol.) (1993) 151 :4189-4199 ;都(Doe) 等人，欧洲免疫学杂志(Eur. J. Immunol.) (1994)24 :2369-2376。
"免疫原性0RF"或"免疫原性orf "是指能引发免疫反应的开放读码框。
本文所用的"免疫有效量"是指通过所属领域的技术人员所习知的标准分析法测 量足以引发免疫反应(细胞(T细胞)或体液(B细胞或抗体)反应)的抗原或疫苗的量。 例如，对于本发明来说，"免疫有效量"是> 4. 5至7. 5Logl。TCID5。/mL的最小保护剂量(效价)。抗原作为免疫原的效力可通过增殖分析法、通过细胞溶解分析法(例如铬释放分析 法以测量T细胞溶解其特异性耙细胞的能力)或通过测量B细胞活性水平(通过测量对血 清中的抗原具有特异性的循环抗体水平)来测量。而且，免疫反应的保护水平可通过攻击 具有经注射抗原的免疫化宿主来测量。例如，若期望免疫反应的抗原是病毒或肿瘤细胞，则 "免疫有效量"的抗原所诱发的保护水平可通过检测对动物实施病毒或肿瘤细胞攻击后的 存活率百分比或死亡率百分比来测量。 本文所定义的淙熊痘病毒基因组中的"非必需位点"意指病毒基因组中非病毒感 染或复制所必需的区域。浣熊痘病毒基因组中的非必需位点的实例包括但不限于胸苷激 酶(TK)位点、血凝素(HA)位点及丝氨酸蛋白酶抑制剂位点。浣熊痘病毒的TK位点阐述 于卢策-华莱士 (C. Lutze-Wallace)，西杜(M. Sidhu)及卡普乐(A. Ka卯eler)，病毒基因 (Virus Genes) 10 (1995)，第81-84页。淙熊痘病毒的TK基因的序列也可参见PubMed登录 号DQ066544及U08228。浣熊痘病毒的HA位点阐述于卡瓦拉罗(Cavallaro KF)及埃斯波 西托(Esposito， JJ)，病毒学(Virology) (1992) ，190(1) :434-9。淙熊痘病毒的HA基因的 序列也可参见PubMed登录号AF375116。 术语"核酸分子"或"核酸序列"具有其普通含义，是指重复核苷酸(例如指导蛋 白质合成过程的嘌呤及嘧啶碱基重复单元)长链，即，其编码并表达蛋白质物质。与术语在 权利要求书中的使用一样，核酸是指编码猪繁殖与呼吸综合症病毒蛋白的已知外源或外来 基因，期望为开放读码框基因。 本文所用的术语"开放读码框"或"ORF"或"orf "是指无间插终止密码子下编码 特定病毒蛋白所需要的最小核苷酸序列。"可操作地连接"是指元件的排列，其中所阐述组件经构造可实施其通常功能。因 此，当存在调节蛋白及合适酶时，可操作地连接于编码序列(例如，编码所关注抗原的序 列)的给定启动子能够实现编码序列的表达。在一些情形下，某些控制元件不需要与编码 序列邻接，只要所述控制元件起指导其表达的作用即可。例如，启动子序列与编码序列之间 可存在未经转译而经转录的间插序列，且所述启动子序列仍可视为"可操作地连接"于所述 编码序列。因此，在细胞中，当RNA聚合酶将编码序列转录至mRNA (其随后经反式RNA剪接 并转译成由所述编码序列编码的蛋白质)中时，编码序列"可操作地连接"于转录及转译控 制序列。 术语"猪(porcine及swine)"可互换使用，且是指任何猪科(Suidae)家族成员动 物，例如猪(Pig)。"保护性"免疫反应是指疫苗引发免疫反应(体液或细胞调介的免疫反应)的能 力，其用以保护哺乳动物不受感染。所提供的保护无需为绝对的，即，感染无需完全预防或 根除，只要与猪哺乳动物的对照群体(例如未投与疫苗的感染动物)相比存在统计学显著 改良即可。保护可限于减轻感染症状发作的严重性或迅速性。 本文所用的术语"重组体"仅仅是指通过标准基因工程方法所产生的浣熊痘病毒 构建体。 术语"可复制的"是指能够在适宜宿主细胞中复制、重制或再制的微生物，例如，诸
如淙熊痘病毒等病毒。 术语"疫苗"或"疫苗组合物"在本文中可互换使用，且是指包含至少一种可在动
13物中诱发免疫反应及/或保护动物免于由感染所引起的疾病或可能死亡的免疫活性组份 的医药组合物，且可能包括或可能不包括一或多种能够增强活性组份的免疫活性的其它组 份。疫苗可另外包含其它典型医药组合物组份。"载体"是能够在宿主生物体中复制且基因插入至其中以构建重组DNA分子的DNA 分子。 概述 根据本发明，提供独特的重组痘病毒载体，其中所述载体包含一或多个编码猪繁 殖与呼吸综合症病毒蛋白的外源核酸分子。在一个实施例中，所述痘病毒载体可编码相同 猪繁殖与呼吸综合症病毒蛋白的至少两个拷贝。所述相同蛋白的两个拷贝可由两个不同核 酸分子编码或所述相同蛋白的两个拷贝可由相同核酸分子编码。所述相同蛋白的两个拷贝 可操作地连接于一个启动子或各别启动子。 所述蛋白可由分别在血凝素(ha)及/或胸苷激酶(tk)基因座的一或多种猪繁 殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)分离株的开放读码框(例如0RFla或0RFlb至0RF7，优选 为0RF5、 0RF6及/或0RF3/0RF4/0RF7)与或不与猪圆环病毒2型(PCV-2)的一或多个开 放读码框(例如0RF1至0RF13，优选为0RF2)编码。用于插入本文所述任何核酸分子的 痘病毒基因组的另一第三非必需位点是丝氨酸蛋白酶抑制剂位点。在一个特定实施例中， 两个或更多个外源核酸分子编码两个或更多个选自由下列组成的群组的猪繁殖与呼吸综 合症病毒的开放读码框0RF5-0RF6、 0RF5-0RF6-0RF7、 0RF3-0RF5-0RF6、 0RF3-0RF4-0RF7、 0RF3-0RF4-0RF5-0RF7、 0RF3-0RF4-0RF6-0RF7及0RF3-0RF4-0RF5-0RF6-0RF7 。
也在ha及/或tk基因座插入表达带有FeLV P27+表型(在FeLV P27 ELISA中为蓝 色)的猫白血病病毒(FeLV)的糖蛋白的基因。在所述构建体中，FeLV P27+或PCV-20RF2 (衣 壳基因)用作单标签来筛选不同组合中的无性系。优选的PRRSV分离株包含ISU12(爱荷 华州)及01ot/91(西班牙)菌株，但其它分离株可容易地代替在下文实例中阐释本发明的 菌株。 因此，本发明的目的是在一个病毒构建体中表达在浣熊痘病毒(RCNV)基因组的 血凝素(ha)及/或胸苷激酶(tk)基因座的四个或更多个单独猪繁殖与呼吸综合症病毒 (PRRSV)的美国及欧洲菌株的开放读码框(ORF)或其与猪圆环病毒(PCV2)的ORF的组合以 制造强效疫苗。 本发明的另一 目的是使用新颖克隆筛选系统，所述系统利用有限稀释及 蓝-至-白蚀斑途径或有限稀释及病毒ELISA而非常用筛选标签(如LacZ)作为筛选标签。
上述目的是通过提供包含重组浣熊痘病毒载体(rRCNV)的新颖疫苗实现，其中所 述rRCNV表达分别在血凝素(ha)及/或胸苷激酶(tk)基因座的一或多种PRRSV分离株的 多个开放读码框(优选为0RF5、0RF6及/或0RF3/0RF4/0RF7)与或不与PCV-2的开放读码 框(优选为0RF2)。 先前表达系统的能力限于在一个病毒构建体中仅表达PRRSV基因的一个或两个 开放读码框(ORF)。本发明有利地容许表达四个或更多个单独猪繁殖与呼吸综合症病毒 (PRRSV)的美国及欧洲菌株的0RF或其与猪圆环病毒2型(PCV-2)的开放读码框的组合。迄 今业内无阐述，本发明的优良表达系统容许在一个病毒构建体中将来自PRRSV的多个ORF 插入至浣熊痘病毒(RCNV)基因组的ha及/或tk基因座及/或丝氨酸蛋白酶抑制剂基因座中由此产生保护猪抵抗PRRS的强效重组疫苗。 本发明使用利用有限稀释及蓝_至_白蚀斑途径或有限稀释及ELISA用作筛选标 签的筛选系统。非常有益地，所述筛选系统在一个病毒构建体中可提供多个位点表达。
淙熊痘病毒(赫尔曼(Herman)菌株)首先由赫尔曼(Y. F. Herman)于1961-1962 年在马里兰(Maryland)阿伯丁 (Aberdeen)自无临床症状的浣熊呼吸道中分离出来(赫尔 曼(Y. F. Herman)，"天然存在淙熊痘病毒的分离及表征(Isolation and characterization of anaturally occurring pox virus of raccoons)，，，细菌学进展(Bacteriol. Proc.)， 第64届美国微生物学学会年会(64th Annual Meeting of the American Society for Microbiology)，第117页(1964))。在本发明rRCNV-PRRS构建体中，将一或多种PRRSV基 因菌株的多个开放读码框(例如，0RF5、 0RF6及/或0RF3/0RF4/0RF7)插入至浣熊痘病毒 (RCNV)基因组的ha及/或tk基因座中使无毒性赫尔曼菌株进一步减毒。有利地，本发明 以rRCNV为载体的PRRSV疫苗也使疫苗生产期间雇员的安全性得以改良，且完全消除了病 原性病毒未亡灭活的机会及商业生产期间所用的去污染程序。 本发明涵盖，本发明中所阐述的科学进步及新颖方法可由所属领域的技术人员应 用于具有多个获自PRRSV菌株而非ISU12及01ot/91的开放读码框的抗原蛋白，且可在浣 熊痘病毒载体的tk及/或ha基因座插入以提供用于抵抗PRRS的免疫原性疫苗。例如，诸如 北美菌株VR-2332、欧洲菌株莱利斯塔德病毒及诸如此类等其它菌株可容易地代替ISU12 及/或Olot/91菌株。或者，由于RNA病毒易发生突变，因此可分离新领域分离株或病毒突 变体的期望ORF基因并用于本发明重组疫苗中。尽管如此，在迄今发现的PRRSV的许多突 变体及众多分离株间存在高度同源性，且因此，在本发明疫苗构建体中使用某些开放读码 框(例如0RF5或0RF6)具有可显著有效抵抗PRRS的优点。对于具有约40%的较低同源性 的分离株，本发明构建体的实用优点在于其可容易地容纳来自多种病毒来源的若干ORF的 抗原蛋白以提供有效广谱疫苗。通过对仔猪成功实施疫苗接种程序而进行的所述PRRS预 防对猪产业极具重要性，此是因为对于所述疾病没有有效的长期治疗方案。
本发明进一步涵盖，可用于本发明的痘病毒载体可包含但不限于浣熊痘病毒、金 丝雀痘病毒、家禽痘病毒、猪痘病毒、牛痘病毒及诸如此类，但期望使用淙熊痘病毒。虽然灭 活痘病毒载体可用于本发明方法的实践中，但优选为活载体。 本发明也提供保护猪抵抗断奶后多系统衰竭综合症(P丽S)及/或猪繁殖与呼吸 综合症(PRRS)的新颖方法，其通过向需要保护的猪投与强效新颖重组疫苗来实施。
在本发明方法中，将免疫有效量的本发明疫苗投与至需要保护以抵抗P丽S及/或 PRRS的猪(尤其是幼小仔猪)以在动物中诱发保护性免疫反应。给与猪的有效免疫量是 可获得疫苗的充分免疫反应以保护猪不受PCV-2及/或PRRSV的有害影响的量。当疫苗能 够如疫苗领域中的标准值所要求保护至少相当数量的经接种猪时，视为获得保护性免疫反 应。给动物接种并引发满意疫苗接种效应的免疫学有效剂量或有效免疫量可通过常规测试 (例如，通过标准滴定研究)容易地测定或容易地滴定。 本发明新颖疫苗构建体可用于约3月龄健康仔猪的疫苗接种以预防断奶后多系 统衰竭综合症(P丽S)及/或猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)。也可将所述疫苗给与生育之前 的成熟或成年母猪(即，大于3个月)。所述疫苗可以单次剂量投与，或若抗体效价下降且 认为需要加强注射则以重复剂量投与。期望地，所述疫苗以单次接种方式投与至健康动物
15以提供抵抗疾病的长期保护，保护动物至少一年至三年或更长时间。适当剂量可通过标准 剂量滴定研究来测定。所述疫苗可含有免疫有效量的任何一种本文所述以重组浣熊痘病毒 为载体的构建体。在另一实施例中，所述疫苗可含有免疫有效量的任何两种或更多种本文 所述的重组浣熊痘病毒载体构建体。 所述疫苗可容易地通过任一投与途径给与，经口、经鼻内、经皮(即，施于皮肤表 面上或皮肤表面处以全身吸收)、非经肠等，尽管一些途径对于特定动物及处理者可能在逻 辑上较为困难。非经肠投与途径包括但不限于皮下、肌内、静脉内、腹膜内、皮内(即，注射 或置于皮肤下)途径及诸如此类。优选地，所述疫苗是经皮下投与。 虽然本发明疫苗高度期望使用活浣熊痘病毒以获得最佳且强效免疫功效，但是所 述痘病毒载体可为活载体或通过常用程序灭活以制备灭活病毒疫苗，例如使用BEI(二元 氮丙啶)、甲醛及诸如此类，BEI是优选灭活剂。 有益的是，表达PCV-2及/或PRRSV的多个0RF的活重组RCNV(单独或与适宜 载剂、稀释剂及佐剂组合)是有用的疫苗。疫苗产物可任选地含有多种典型无毒性医药 上可接受的添加剂、稀释剂及佐剂，包括但不限于防腐剂；稳定剂；乳化剂；氢氧化铝；磷 酸铝；pH调节剂，例如氢氧化钠、盐酸等；表面活性齐U，例如吐温(Tween) 80(聚山梨醇酯 80，可自西格玛化学公司(Sigma Chemical Co.)，圣路易斯(St. Louis)，密苏里州(MO)购 得)；脂质体；免疫剌激复合物(iscom)佐剂；合成糖肽，例如胞壁酰二肽；增量剂，例如葡 聚糖或葡聚糖与例如磷酸铝、硫酸葡聚糖、DEAE-葡聚糖及诸如此类的组合；聚羧乙烯，例 如卡波姆(CARB0P0L) (聚丙烯酸聚合物，可自古德锐驰(B. F. Goodrich)公司，克里夫兰
向
(Cleveland)，俄亥俄州(Ohio)购得)；乙烯马来酸酐或乙烯/马来酸酐共聚物(EMA ，线性
乙烯/马来酸酐共聚物，具有大致等量的乙烯及马来酸酐，其估计平均分子量为约75， 000 至100，000，可自孟山都公司(Monsanto Co.)，圣路易斯(St. Louis)，密苏里州(M0)购得); 丙烯酸系共聚物乳液，例如苯乙烯与丙烯酸及甲基丙烯酸的混合物的共聚物，如NE0CRY1^ A640(例如美国专利第5，047， 238号，与苯乙烯混合的丙烯酸及甲基丙烯酸的未聚结水性 丙烯酸共聚物，可自聚乙烯基化学(Polyvinyl Chemicals)公司，威尔明顿(Wilmington), 马萨诸塞州(MA)购得)；细菌细胞壁，例如分枝杆菌细胞壁提取物；衍生自棒状杆菌的佐 剂，例如短小棒状杆菌；衍生自丙酸杆菌的佐剂，例如痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acne);牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(卡介苗或BCG);亚病毒微粒佐剂，例如环状 病毒(orbivirus);霍乱毒素；N， N-二 (十八烷基)-N' ， N' _双(2-羟基乙基)-丙二 胺(阿夫立定(avridine));单磷酰脂质A;二甲基二 (十八烷基)溴化铵(DDA，可自柯达 (Kodak)，罗彻斯特(Rochester)，纽约州(NY)购得)；其合成物及混合物。可在本发明疫 苗中使用的其它添加剂包括但不限于右旋糖、常用抗氧化剂及常用螯合剂，例如乙二胺四 乙酸(EDTA)。可任选地补充疫苗调配物的其它医药上可接受的佐剂包括但不限于聚阴离 子、聚阳离子、肽、矿物油乳液、免疫调节齐U、多种组合及诸如此类。适宜佐剂的其它非限制 性实例包括角鲨烷及角鲨烯(或其它动物来源的油)；聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物， 例如普罗尼克(PLUR0NIC) (L121，例如，可自巴斯夫公司(BASF Aktiengesellschaft)，路 德维希港(Ludwigshafen)，德国购得)；皂苷；Quil A(皂树皮经纯化形式的商品名，可自 斯泰克(Iscotec AB)，瑞典及苏珀福斯(Superfos Biosector a/s)，维德伯克(Vedbaek)， 丹麦购得)；矿物油，例如玛考(MARCOL)②(液体饱和烃的经纯化混合物，可自埃克森美孚(Exxon-Mobil)，费尔法克斯(Fairfax)，弗吉尼亚州(VA)购得)；植物油，例如花生油；白 细胞介素，例如白细胞介素-2及白细胞介素-12 ;干扰素，例如Y干扰素；动物痘病毒蛋白
或其混合物。适宜稳定剂的实例包括但不限于蔗糖、明胶、蛋白胨、诸如NZ-胺或NZ-胺AS 等经消化的蛋白质提取物。乳化剂的实例包括但不限于矿物油、植物油、花生油及其它可用 于可注射或鼻内疫苗的标准可代谢无毒性油。期望地，氢氧化铝与诸如皂苷或Quil A等其 它佐剂混合以形成诸如皂苷_氢氧化铝或Quil A-氢氧化铝等组合。 优选佐剂包含乙烯/马来酸酐共聚物、苯乙烯与丙烯酸及甲基丙烯酸混合物的共 聚物、矿物油乳液或其组合。可显著增强本发明rRCNV-PRRS构建体效能的尤其优选佐剂 系统包含诸如EMA-31 (线性乙烯/马来酸酐共聚物，具有大致等量的乙烯及马来酸酐，其 估计平均分子量为约75， 000至100， OOO，可自孟山都公司(Monsanto Co.)，圣路易斯(St. Louis)，密苏里州(M0)购得)等乙烯/马来酸酐共聚物与诸如NE0CRYL (与苯乙烯混合 的丙烯酸及甲基丙烯酸的未聚结水性丙烯酸共聚物(丙烯酸系_苯乙烯乳液)，可自聚乙烯 基化学(Polyvinyl Chemicals)公司，威尔明顿(Wilmington)，马萨诸塞州(MA)购得)等 丙烯酸共聚物乳液的组合。 本发明重组疫苗组合物也可任选地含有一或多种其它猪抗原的混合物，所述一或 多种其它猪抗原是例如猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌、多杀巴斯德菌、猪链球菌、胸膜肺炎 放线杆菌、支气管败血性博德特菌、猪霍乱沙门氏菌、猪丹毒杆菌、钩端螺旋体细菌、猪流感 病毒(SIV)、猪细小病毒、大肠杆菌、猪呼吸冠状病毒、轮状病毒、阿捷申氏病的致病病原体、 猪传染性胃肠炎等。 所属领域的技术人员所习知的任一方法均可用于制备本发明的基因构建体。例 如，可利用特定限制位点使用标准方法将任何期望核酸序列插入至浣熊痘病毒载体中。或 者，如本文所述，当期望插入较大序列时或当期望插入多个基因时，可利用同源重组技术。 在所述方法中，插入位点(拟向其中插入多个基因)侧翼的质粒序列含有与存在于浣熊痘 病毒基因组中的序列具有充分同源性的序列以调介重组。所述侧翼序列必须与非浣熊痘病 毒生长及繁殖所必需的浣熊痘病毒区域同源，例如血凝素基因座或胸苷激酶基因座或丝氨 酸蛋白酶抑制剂基因座。尽管可使用一个启动子来推动两个拟重组外源基因的表达，但是 在插入载体中使用两个启动子(各启动子可操作地连接于单个基因)也将提供充分表达。
通常，病毒rRCNV-PRRS可通过蓝-至-白蚀斑途径构建，例如，通过以下五 个主要步骤(1)将PRRSV ISU12 (爱荷华州)及Olot/91 (西班牙分离株)菌株的 0RF5、 0RF6、 0RF7或0RF3克隆至质粒pFD2000A及/或pFD2003SEL中；(2)构建质粒 pFD2000A PRRS 0RF7 (Pn)-0RF5 (Olot) (PSEL)-0RF6 (PSEL)-0RF5 (PSEL)或质粒pFD2000A PRRS 0RF3 (Pu) -0RF5 (Olot) (PSEL) -0RF6 (PSEL) -0RF5 (PSEL) ; (3)通过三方面感染/转染创建无性系 库C0S7细胞、步骤2中的质粒及rRCNV-FeLV ; (4)通过有限稀释及蓝-至-白蚀斑途径实 施无性系筛选；及(5)通过PCR、ELISA及西方墨点法测定rRCNV-PRRSbtJ勺分子特征。或者， 可使用白-至-蓝蚀斑途径，其中实施以下五个主要步骤(l)将PRRSV ISU12及Olot/91 菌株的0RF5及0RF6、FeLV P27克隆至质粒pFD2000A及/或pFD2003SEL中；(2)构建质粒 pFD2000A FeLV P27 (Pu)-PRRS 0RF5(01ot) (PSEL)-0RF6 (PSEL)-0RF5 (PSEL)或pFD2000A PRRS 0RF5 (Olot) (P弧)-0RF6 (P弧)-0RF5〃LacZ (P7.5) ; (3)通过三方面感染/转染创建无性系库 C0S7细胞、步骤2中的质粒及RCNV ; (4)通过有限稀释及FeLV P27ELISA或LacZ实施无性系筛选；及(5)通过PCR、ELISA及西方墨点法测定rRCNV-PRRS幽的分子特征。
本发明rRCNV-PRRS-PCV可通过以下五个主要步骤构建(l)将PRRSV ISU12及 01ot/91菌株的0RF5、 0RF6、 0RF3及PCV20RF2 (衣壳基因)克隆至质粒pFD2000A及/或 pFD2003SEL中;(2)构建质粒pFD2000A PRRS 0RF3 (Pn)-0RF5 (Olot) (PSEL)-0RF6 (PSEL)-ORF 5 (P弧)-PCV20RF2 (Pu或P弧)；(3)通过三方面感染/转染创建无性系库C0S7细胞、步骤2 中的质粒及RCNV ; (4)通过有限稀释及PCV2ELISA(作为筛选标签)实施无性系筛选；及(5) 通过PCR、ELISA及西方墨点法测定rRCNV-PRRSPCT的分子特征。或者，可使用白_至_蓝蚀 斑途径，其中实施以下四个主要步骤(l)将PCV20RF2克隆至质粒pFD2001TK或pFD2006TK 中以产生质粒pFD2001TK PCV 0RF2 ; (2)通过三方面感染/转染创建无性系库C0S7细胞、 步骤l中的质粒及rRCNV-PRRS 0RF3 (Pn)-0RF5 (Olot) (PSEL)-ORF6 (PSEL)-ORF5 (PSEL) ;(3)通 过有限稀释及PCV2ELISA或LacZ实施无性系筛选；及(5)通过PCR、ELISA及西方墨点法测 定rRCNV-PRRS〃PCV的分子特征。
实例 以下实例展示本发明的某些方面。然而，应了解所述实例仅用于阐释而非欲将本 发明完全限定于所述条件及范围。应了解，当给出典型反应条件(例如，温度、反应时间等) 时，也可使用规定范围以上及以下的条件，虽然通常较为不适宜。所述实例是在室温(约 23t:至约28t:)及大气压力下实施。除非另有说明，否则本文所提及的所有份数及百分比 都以重量计，且所有温度都以摄氏度表示。
实例1 :构建rRCNV-PRRS (蓝-至-白蚀斑途径) rRCNV-PRRSbtw是通过以下五个主要步骤构建(l)将PRRSV ISU12 (爱荷华 州)及01ot/91 (西班牙分离株)菌株的0RF5、 0RF6、 0RF7或0RF3克隆至质粒pFD2000A 及/或pFD2003SEL中；(2)构建质粒pFD2000A PRRS 0RF7或0RF3 (Pn)-0RF5 (Olot) (P弧)-0RF6 (P弧)-0RF5 (P弧)；(3)通过三方面感染/转染创建无性系库C0S7细胞、步骤2 中的质粒及rRCNV-FeLV ; (4)通过有限稀释及蓝-至-白蚀斑途径实施无性系筛选；及(5) 通过PCR、 ELISA及西方墨点法测定rRCNV-PRRSbtw的分子特征。 所述蓝-至-白蚀斑筛选途径使用具有FeLV P27+表型(在FeLV P27ELISA 中为蓝色)的亲本病毒rRCNV-FeLV。 通过介于rRCNV-FeLV与pFD200A PRRS 0RF7-0RF5 (Olot) -0RF6-0RF5之间的RCNV HA侧翼序列的同源重组，重组rRCNV-PRRS的表 型将自蓝蚀斑变成白蚀斑，这是因为PRRSV ORF插入ha基因座以替代亲本菌株中的FeLV gag-env gp85序列(rRCNV-FeLV-蓝蚀斑)。
实例2 :构建rRCNV-PRRS (白-至-蓝蚀斑途径) rRCNV-PRRSwtb是通过以下五个主要步骤构建(1)将PRRSV ISU12及Olot/91菌 株的0RF5及0RF6、 FeLV P27克隆至质粒pFD2000A及/或pFD2003SEL中;(2)构建质粒 pFD2000A FeLV P27 (Pn)-PRRS 0RF5 (Olot) (PSEL)-0RF6 (PSEL)-0RF5 (PSEL) ;(3)通过三方面 感染/转染创建无性系库C0S7细胞、步骤2中的质粒及RCNV ; (4)通过有限稀释及FeLV P27ELISA或LacZ实施无性系筛选；及(5)通过PCR、ELISA及西方墨点法测定rRCNV-PRRS^ 的分子特征。 所述白-至-蓝蚀斑筛选途径使用具有FeLV P27+或LacZ表型(在FeLV P27ELISA 或LacZ+表型中为蓝色)的重组病毒rRCNV-PRRS幽，而野生型RCNV在FeLV P27ELISA或LacZ染色中显示白色。 实例3 :构建rRCNV-PRRS-PCV rRCNV_PRRSpcv是通过以下五个主要步骤构建(1)将PRRSV ISU12及01ot/91菌 株的0RF5、 0RF6、 0RF3及PCV20RF2 (衣壳基因)克隆至质粒pFD2000A及/或pFD2003SEL 中;(2)构建质粒pFD2000A PRRS 0RF3 (Pu)-0RF5 (Olot) (PSEL)-0RF6 (PSEL)-0RF5 (PSEL)-PCV2 0RF2(Pn或P^) ;(3)通过三方面感染/转染创建无性系库C0S7细胞、步骤2中的质粒及 RCNV ; (4)通过有限稀释及PCV2ELISA(作为筛选标签)实施无性系筛选；及(5)通过PCR、 ELISA及西方墨点法测定rRCNV-PRRSpev的分子特征。 所述PCV2途径使用PCV-2衣壳ELISA作为单标签来筛选无性系，且用以在一个病 毒构建体中创建新颖rRCNV-PRRS/PCV组合疫苗。 或者，所述rRCNV-PRRSp。v是通过以下四个主要步骤构建(l)将PCV2 0RF2(衣壳 基因)克隆至质粒pFD2001TK及/或pFD2006TK中以产生质粒pFD2001TKPCV20RF2 (P^或 PSJ ; (2)通过三方面感染/转染创建无性系库C0S7细胞、步骤1中的质粒及rRCNV-PRRS ; (3)通过有限稀释及PCV2ELISA(作为筛选标签)实施无性系筛选；及(5)通过PCR、ELISA 及西方墨点法测定rRCNV-PRRS〃PCV的分子特征。
实例4 :rRCNV-PRRS候选疫苗在猪中的功效研究在有或无免疫增强佐剂下调配上述构建体(rRCNV-PRRSbtw、 rRCNV_PRRSwtb及
rRCNV-PRRSpev)，并在猪中评价疫苗功效。攻击研究的成功结果将显示重组PRRS、 PCV或组
合疫苗在猪中的功效。 实例5 :构建rRCNV-PRRSV 简单来说，病毒rRCNV-PRRSV是通过将猪呼吸与繁殖综合症病毒(PRRSV) ISU12(美国菌株)的包膜糖蛋白(orf 5)基因及基质蛋白(orf 6)基因及PRRSV Olot 91(欧洲菌株)基因的包膜糖蛋白(orf 5)基因插入至RCNV基因组(无毒性赫尔曼菌株) 的血凝集(ha)基因座中来构建。 rRCNV-PRRSV的构建过程通过两个主要步骤来提供。第一，将PRRSV ISU 12菌 株的经PCR扩增的603bp orf 5及525bp orf6及PRRSV Olot 91菌株的606bp orf 5亚 克隆至质粒pFD2003SEL载体(在启动子Pll控制下含有lacZ报告基因)中，以产生质粒 pFD2003SEL-PRRSV Olot 91 orf5-(SEL)-ISU 12orf 6(SEL)_ISU 12orf 5 (SEL)。 PRRSV ISU 12orf5及orf6及PRRSV Olo 91 orf5基因二者在启动子P弧控制下共表达。第二，实施 C0S-7细胞中的rRCNV-FCV(2280-DDl)及质粒pFD2003SEL-PRRSV01ot 91 orf5-(SEL)-ISU 12 orf 6 (SEL)-ISU 12 orf 5 (SEL)的三方面共感染/转染以通过ha基因座处的等位 基因交换产生rRCNV-PRRSV。通过五个蚀斑纯化相继循环在非洲绿猴肾细胞中克隆蓝 蚀斑(Lac+)。将候选无性系在非洲绿猴肾细胞中使用补充有0.05%乳清蛋白水解产物 (LAH) 、30 ii g/mL硫酸庆大霉素(gentamicin sulfate)及5%胎牛血清的最低必需培养基 (MEM)进一步再扩展两次，且其后通过基因特异性PCR证实。第七通道用以制备预备种源 (pre-master seed)。种源是通过对预备种源及指定rRCNV-PRRSV分别实施1 : 20， 000稀 释建立，其中作为活载体的浣熊痘病毒能够表达在ha基因座的PRRSV ISU 12及Olot 91 菌株的PRRSV包膜糖蛋白(orf5)及基质蛋白(M) 。 PRRSV疫苗的种源病毒活浣熊痘病毒载 体(rRCNV-PRRSV)是通过PRRSV orf5或orf6基因特异性PCR测试确定。正在仔猪及母猪
19中实施猪呼吸与繁殖综合症病毒疫苗的免疫原性研究，单独活/灭活浣熊痘病毒载体或其 与苏瓦克PCV2—剂(SuvaxynPCV20ne Dose)及或苏瓦克MH-1 (Suvaxyn MH-one)、或活嵌合 cPCVl-2及或经修饰的活猪肺炎支原体(例如，J菌株)的组合。 实例6 :猪繁殖与呼吸综合症病毒疫苗在仔猪中的免疫原性研究，单独活浣熊痘 病毒载体或其与苏瓦克PCV2 —剂(Suvaxyn PCV20ne Dose)的组合 为展示PRRSV部分的功效，将以两次剂量方案以2-3周间隔向猪投与rRCNV-PRRSV 疫苗(冻干的饼)及作为稀释剂的含佐剂的无菌水或苏瓦克PCV2 —剂(Suvaxyn PCV20ne Dose)，随后在第二次疫苗接种后实施毒性PRRSV攻击或PRRSV/PCV2共攻击2-3周。 rRCNV-PRRSV部分的功效将基于PRRSV病毒血症减轻及由PRRSV引起的肺损伤减轻来评价。 苏瓦克(Suvaxyn) PCV20ne含有用FDAH的专利佐剂调配的灭活猪第一型_圆环病毒2型 嵌合体(cPCVl-2)。
材料和方法
测试动物 所述研究使用至少40只(20只疫苗接种及20只对照)混合饲养雄性及雌性常见 猪(3周龄或更大)。用于所述研究的猪自商业农场购得，且使用耳标标识。将自单个畜群 来源获得猪。在第一次疫苗接种时，通过埃特斯畜检ELISA(IDEXX HerdCheckELISA)试剂 盒(S/P比率小于0. 4)测定，猪呈现PRRSV血清阴性。
测li式錢
测li鹏制勺誠 冻干部分所述疫苗由活rRCNV-PRRSV组成。将在五次平行测定分析中滴定疫 苗的病毒效价以确定研究中的投与剂量。液体部分稀释剂为苏瓦克PCV2—剂(Suvaxyn PCV20ne Dose)或20%的SL-CD佐剂。在疫苗接种时，将rRCNV-PRRSV的冻干部分用液体
部分再水化。
研究设计 所提出的研究为随机化完全区组设计(优效性试验)。将同胎幼仔(Litter)分配 至各研究平行测定中。随后将各研究中同胎幼仔内的仔猪如下分成两个群组
群组疫苗动物数量
vi-疫苗接种冻干rRCNV-PRRSV (饼)+苏瓦克PCV2 —剂(S證xynPCV2 0neDose)> 20
ci-对照苏瓦克PCV2 —剂(SuvaxynPCV20neDose)(稀释剂)> 20
V2-疫苗接种冻干rRCNV-PRRSV (饼)+水-SL-CD佐剂(稀释剂)> 20
C2-对照水-SL-CD佐剂(稀释剂)> 20 疫苗接种 疫苗接种途径为在颈右侧上经肌内。
20
对于研究1中的猪将给与群组VI两次2. 0mL剂量的rRCNV_PRRSV+苏瓦克PCV2
一剂；将给与对照群组CI中的猪两次2. OmL剂量的苏瓦克PCV2 —剂。对于研究2中的猪将给与群组V2两次2. OmL剂量的rRCNV_PRRSV+水/SL-CD ;
将给与对照群组C2中的猪两次2. OmL剂量的水-SL-CD佐剂。 第一次疫苗接种在3周龄时实施，且在2-3周之后重复疫苗接种。 所有动物将在第二次疫苗接种后两周至三周实施毒性攻击。 用至少2 x 104' 8FAID5。的野生型病原性PCV2 (菌株40895)及用至少2 x10"TCIDs。的PRRSV(ISU-12或等效物)对群组V1及C1中的猪进行攻击。在攻击之前将所述两种攻击物质在一起混合至少30分钟。攻击剂量为鼻内4mL(2mL/鼻孔)。
用至少2 x 104°TCID5。的PRRSV(ISU_12或等效物)对群组V2及C2中的猪进行攻击。攻击剂量为鼻内2mL(lmL/鼻孔)。攻击报告参见附件2。 在攻击当天通过PCV2特异性及PRRSV特异性间接免疫荧光分析(IFA)对攻击病
毒进行滴定。
纖 在攻击后(DPC)第-2天至第10天每天观测所有猪的临床体征及温度。将任何异常观测报告给研究主管或农场兽医。 所监测的临床体征可包括但不限于食欲不振、嗜睡、抑郁症、腹泻、喷嚏、咳嗽、流
鼻涕、眼分泌物、呼吸困难及死亡。若任何猪在攻击后观测时间段期间死亡，则将实施尸检
且尸检报告附于最后报告中。 样品收集及测试 样品收集 鼻擦拭物 在PRRSV及PCV2分离株第一次疫苗接种后(DPV1)第0天收集鼻擦拭物以确保在疫苗接种之前测试动物中无PRRSV或PCV2感染。 将鼻擦拭物样品放置于含有3mL MEM的单独灭菌管中，并在-S(TC下或低于_50°C下储存直至测试，所述MEM中含有乳清蛋白水解产物(LAH)及庆大霉素(60ii g/mL)、青霉素(100U/mL)及链霉素(lOOii g/mL)。
血清样品在0DPV1、0DPV2、7DPV2、14DPV2、-1、6及9对猪进行抽血以获得血清样品(不多于lOmL)用于ELISA测试，且在_1、3、6及9抽血用于PCR测试。
■ 将在10-11DPC对所有动物进行尸检。收集肺以用于肺损伤记分。 样品测试 酶联免疫吸附分析(ELISA) 通过埃特斯⑧畜检ELISA试剂盒(威斯布鲁克(Westbrook) ， ME)检测PRRSV的血清抗体。简单来说，将血清样品l : 40稀释于样品稀释剂中，并将100iiL每种样品一式两份(一个孔用于PRRSV抗原且一个孔用于正常宿主细胞(NHC)抗原)添加至涂敷有抗原的96孔板中。在于室温下培育30分钟时间段后，倒出液体，并将所述板用约300i! L磷酸盐缓冲洗涤溶液洗涤3-5次。随后向所有孔中添加100 y L抗猪-HRP0偶联物。将板在室温下培育30分钟。在培育时间段后，再次如上洗涤板。随后向各孔中添加lOOyL TMB底物溶液。将所述板在室温下培育15分钟，随后向所有孔中添加100 L终止溶液以终止反应。随后在650nm处于微量板读数器上测量光密度(OD)。任意血清效价将以样品/阳性(S/P)比率报告，且通过使样品OD-PRRSV减去样品OD-NHC的数值除以平均阳性对照-PRRSV减去平均阳性对照-NHC的数值来测定。
PCR测试 利用PRRSV特异性RT-PCR测试来检测血清中PRRSV的存在。RNA提取将在血清样品上使用恰普(QIAamp)⑧病毒RNA微型试剂盒(瓦伦西亚(Valencia) ， CA)实施。
各个体猪的肺将由两个独立记分员针对总肉眼可见损伤基于损伤所侵袭肺薄壁组织的量来检验。损伤记分员不知情各猪的治疗方案一致性。简单来说，各肺叶中的肺损伤记分将通过估计展示PRRSV样损伤(基于颜色及纹理)的肺叶百分比来确定，并乘以所述肺叶的可能点值。各肺叶的最大记分是通过所述肺叶占总肺体积的相对百分比来测定。随后将所有肺叶的背侧及腹侧方面的记分相加在一起以获得各猪的总记分。每一动物的可能的最大总记分是100。
一级结果 为主张肺损伤减少，对肺上所存在损伤的总记分予以评定。
二级结果 二级结果为PRRSV病毒血症的发生。
乡充i十，條
估i十量 为对肺损伤严重性的降低予以评价，估计量将为减轻部分(MF)统计量。减轻部分将如下计算 MF，—"""""') 其中=魏克森等级和统计量(Wilcoxon Rank sum statistic) n。=对照群组中个体的数量 nv =每一疫苗接种群组中个体的数量 *注将对每一研究平行测定的MF统计量予以估计。 i十算区间估i十的方法的陈沭 将计算每一研究平行测定的减轻部分的95%置信区间。 假设陈沭 为主张肺损伤严重性降低 H0:MV = MC HA:MV#MC 其中 Mv =疫苗接种群组中肺 损伤记分等级的中值
M。=对照群组中肺损伤记分等级的中值 所述研究将测试零假设，即对于每一研究平行测定疫苗接种群组与安慰剂对照群组之间无肺损伤严重性(等级)差异。
其它统计学考虎 猪同胎幼仔分布将在同胎幼仔内随机分配。
乡充i十，條
统i十学方法
一级结果 动物内记分的测试再现性将通过同类相关进行评定。若认为测试再现性足够，则将通过取来自每一记分员的肺记分的平均值来计算每只猪的平均肺记分。通过魏克森等级和以计算的肺记分作为因变量且以所包括的治疗作为自变量对各研究平行测定的两个治疗群组间计算的肺记分进行比较。若存在足够完全区组，则将通过同胎幼仔对所述分析进行分级。估计HL偏移。自魏克森统计量估计MF。
二级结果 针对病毒血症发生对二级结果予以评定。单次发生病毒血症将把猪归类为病毒血症阳性(是或否)。在一般化线性混合模型中以病毒血症发生(是或否)作为二项式因变量且以所包括的治疗作为自变量对治疗群组间的病毒血症进行比较。若存在足够完全区组，则将同胎幼仔作为随机效果协变量包括于模型中。 所有统计学分析将使用SAS系统(赛仕研究所(SAS Institute)公司)实施。显著性水平设置为p〈0. 05。 在上文中，已出于阐释而非限制目的提供本发明特定实施例的详细说明。应了解，所属领域的技术人员基于所述揭示内容显而易见的所有其它修改、分支及等效物均意欲包括在所主张的本发明范围内。
权利要求
一种重组浣熊痘病毒载体(rRCNV)，其包含一或多个编码猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)蛋白的外源核酸分子，其中(a)至少一个核酸分子插入至所述浣熊痘病毒基因组的血凝素基因座或胸苷激酶基因座中；或(b)至少两个核酸分子插入至所述浣熊痘病毒基因组的血凝素基因座或胸苷激酶基因座中；或(c)至少一个核酸分子插入至所述血凝素基因座中且至少一个核酸分子插入至所述浣熊痘病毒基因组的胸苷激酶基因座中。
2. 如权利要求1所述的重组浣熊痘病毒载体，其中至少两个核酸分子插入至所述血凝 素基因座中且至少两个核酸分子插入至所述浣熊痘病毒基因组的胸苷激酶基因座中。
3. 如权利要求1或2中任一权利要求所述的重组浣熊痘病毒载体，其进一步包含除在 所述浣熊痘病毒基因组的胸苷激酶及血凝素基因座外也在所述浣熊痘病毒基因组的第三 非必需位点中插入编码猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)蛋白的核酸分子。
4. 如权利要求3所述的重组浣熊痘病毒载体，其中所述浣熊痘病毒基因组的所述第三 非必需位点是丝氨酸蛋白酶抑制剂位点。
5. 如权利要求1至4中任一权利要求所述的重组浣熊痘病毒载体，其中所述痘病毒载 体编码相同猪繁殖与呼吸综合症病毒蛋白的至少两个拷贝。
6. 如权利要求5所述的重组浣熊痘病毒载体，其中所述相同蛋白的所述两个拷贝是由 两个不同核酸分子编码。
7. 如权利要求5所述的重组浣熊痘病毒载体，其中所述相同蛋白的所述两个拷贝是由 相同核酸分子编码。
8. 如权利要求7所述的重组浣熊痘病毒载体，其中所述相同蛋白的所述两个拷贝可操 作地连接于一个启动子。
9. 如权利要求6或7中任一权利要求所述的重组浣熊痘病毒载体，其中所述相同蛋白 的所述两个拷贝可操作地连接于各别启动子。
10. 如权利要求6、7、8或9中任一权利要求所述的重组浣熊痘病毒载体，其中所述相同 蛋白的所述两个拷贝是由选自由0RF1、0RF2、0RF3、0RF4、0RF5、0RF6、0RF7及其组合组成的 群组的猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)开放读码框(ORF)编码。
11. 如权利要求1或2中任一权利要求所述的重组浣熊痘病毒载体，其中所述外源核酸 分子的每一者都编码PRRSV ORF。
12. 如权利要求11所述的重组浣熊痘病毒载体，其中所述ORF是选自由0RF1、 0RF2、 0RF3、 0RF4、 0RF5、 0RF6、 0RF7及其组合组成的群组的一或多者。
13. 如权利要求2所述的重组浣熊痘病毒载体，其中所述两个或更多个外源核酸分 子编码两个或更多个选自由下列组成的群组的PRRSV ORF :0RF5-0RF6、 0RF5-0RF6-0RF7、 0RF3-0RF5-0腦、0RF3-0RF4-0RF7、 0RF3-0RF4-0RF5-0RF7、 0RF3-0RF4-0RF6-0RF7及 0RF3-0RF4-0RF5-0RF6-0RF7 。
14. 如权利要求1至13中任一权利要求所述的重组浣熊痘病毒载体，其中所述猪繁殖 与呼吸综合症病毒是ISU12(爱荷华州(1owa))、01ot/91(西班牙)或二者。
15. 如权利要求1至14中任一权利要求所述的重组浣熊痘病毒载体，其中两个或更多个核酸分子插入至所述浣熊痘病毒基因组的血凝素基因座中。
16. 如权利要求15所述的重组浣熊痘病毒载体，其进一步包含编码猪圆环病毒2型 (PCV2)的开放读码框的核酸分子。
17. 如权利要求16所述的重组浣熊痘病毒载体，其中所述PCV2开放读码框是0RF2。
18. 如权利要求17所述的重组浣熊痘病毒载体，其中所述PCV20RF2各别插入至所述浣 熊痘病毒基因组的胸苷激酶基因座中。
19. 如权利要求15至18中任一权利要求所述的重组浣熊痘病毒载体，其进一步包含编 码猫白血病病毒P27+表型的糖蛋白的核苷酸序列。
20. 如权利要求1至19中任一权利要求所述的重组浣熊痘病毒载体，其中所述浣熊痘 病毒是活病毒且可复制。
21. —种重组猪疫苗，其包含免疫有效量的如权利要求1至20中任一权利要求所述的 重组浣熊痘病毒载体及任选地适宜载剂、稀释剂或佐剂。
22. —种重组猪疫苗，其包含免疫有效量的两种或更多种如权利要求1至20中任一权 利要求所述的重组浣熊痘病毒载体及任选地适宜载剂或稀释剂。
23. 如权利要求21或22中任一权利要求所述的重组猪疫苗，其中所述浣熊痘病毒是活 病毒且可复制。
24. 如权利要求21或22所述的重组猪疫苗，其进一步包含至少一种其它猪抗原。
25. 如权利要求24所述的重组猪疫苗，其中所述其它猪抗原选自由下列组成的群组 猪月巿炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)抗原、畐U猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis) 抗原、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)抗原、猪链球菌(Str印tococcus suis)抗 原、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)抗原、支气管败血性博德特 菌(Bordetella bronchis印tica)抗原、猪霍舌L沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)抗 原、猪丹毒杆菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)抗原、钩端螺旋体细菌(l印tospira bacteria)抗原、猪流感病毒抗原、猪细小病毒抗原、大肠杆菌(Escherichia coli)抗原、 猪呼吸冠状病毒抗原、轮状病毒抗原、阿捷申氏病(Aujesky' s disease)的致病病原体抗 原、猪传染性胃肠炎(Swine Transmissible Gastroenteritis)抗原及其组合。
26. —种诱发抵抗猪繁殖与呼吸综合症病毒的免疫反应的方法，其包含向猪类动物投 与免疫有效量的如权利要求21至25中任一权利要求所述的重组猪疫苗。
27. 如权利要求24所述的方法，其中所述重组猪疫苗包含活的且可复制的重组浣熊痘 病毒载体。
28. —种预防猪繁殖与呼吸综合症及断奶后多系统衰竭综合症的方法，其包含向需要 保护的猪类动物投与包含免疫有效量的如权利要求16至19中任一权利要求所述的重组浣 熊痘病毒载体及任选地适宜载剂、稀释剂或佐剂的重组猪疫苗。
29. 如权利要求28所述的方法，其中所述重组浣熊痘病毒载体是活载体且可复制。
30. 如权利要求26所述的方法，其中所述疫苗的免疫有效量介于约4. 5Logl。TCID5。/ml 至约7. 5Logl。TCID5。/ml范围内。
31. 如权利要求26所述的方法，其中所述疫苗是以单次剂量或以重复剂量投与。
32. 如权利要求21至25中任一权利要求所述的重组猪疫苗，其中所述疫苗不含佐剂。
全文摘要
本发明涉及新颖重组浣熊痘病毒载体疫苗，其中所述载体表达在血凝素(ha)及/或胸苷激酶(tk)基因座的一或多种猪繁殖与呼吸综合症病毒菌株的多个开放读码框(优选为ORF5、ORF6及/或ORF3/ORF4/ORF7)单独或与猪圆环病毒2型(PCV-2)的开放读码框(优选为ORF2)组合所编码的一或多种抗原蛋白。
文档编号C12N15/86GK101730742SQ200880017817
公开日2010年6月9日 申请日期2008年5月28日 优先权日2007年5月30日
发明者信觉·朱, 斯蒂芬·奇图·吴, 迈克尔·A·吉尔 申请人:惠氏有限责任公司