抗美沙酮代谢物eddp杂交瘤细胞株及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗美沙酮代谢物EDDP杂交瘤细胞株及 其产生的单克隆抗体的应用。
【背景技术】
[0002] 美沙酮代谢物EDDP即为美沙酮在肝脏内经生物转化，通过去甲基化形成无药理 活性的吡咯烷（pyrrolidine)衍生物，其化学名为2-亚乙基-1，5-二甲基-3, 3-二苯基吡 咯烷（EDDP)。
[0003] 美沙酮是一种人工合成的麻醉药品，属于国家严格管制的麻醉药品之一。美沙酮 可以用来治疗海洛因及鸦片成瘾。美沙酮是一种长效阿片类药物，和海洛因等毒品不同，吸 毒人员服用美沙酮后，不会产生对毒品的依赖，也就是说不会产生毒品戒断后的痛苦症状， 由于美沙酮是特殊药品，所以对它的保管特别严格，一旦有人非法带出医院，将视为携带毒 品送交公安部门处理。通过检测美沙酮代谢物EDDP来确定是否服用美沙酮。
[0004] 现有技术中，美沙酮可以采用仪器分析。仪器分析依赖技术要求高、检测时间长、 成本高，检测结果可靠性不高。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种抗美沙酮代谢物EDDP杂交瘤细胞株。
[0006] 本发明抗美沙酮代谢物EDDP杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株9G2. 5,于2015年 1月15日保藏于中国典型培养物保藏中心（China Center for Type Culture Collection， 简称CCTCC)，保藏号为CCTCC N0:C201507;保藏地址是中国武汉武汉大学。该杂交瘤细胞 株能够产生高特异性的抗美沙酮代谢物EDDP单克隆抗体，生产效率高，成本低。
[0007] 本发明的另一个目的是提供杂交瘤细胞株9G2. 5分泌的抗美沙酮代谢物EDDP单 克隆抗体。该单克隆抗体具有较高的特异性、敏感性，交叉反应率低。
[0008] 本发明的第三个目的是提供抗美沙酮代谢物EDDP单克隆抗体的制备方法，包括 步骤如下：
[0009] 步骤（1).小鼠免疫
[0010] 选择8周龄的BALB/c雌鼠用美沙酮代谢物EDDP人工抗原注射小鼠后小腿肌肉； 所述的后小腿肌肉部位为小鼠腿部暴露在外部有大块肌肉的地方，而小鼠的大腿大部分被 腹部皮肤包裹，也可找到膝关节区分小腿大腿；
[0011] 取8周龄的BALB/c雌鼠，用美沙酮代谢物EDDP人工抗原注射小鼠后小腿肌肉，每 隔1周注射一次，共注射4次；第一次美沙酮代谢物EDDP人工抗原免疫量为20 y g/只，第 一次美沙酮代谢物EDDP人工抗原免疫之前进行抗原乳化步骤，抗原乳化步骤是将美沙酮 代谢物EDDP人工抗原免疫量稀释于20ulPBS缓冲液中，得到稀释抗原，与等体积量的弗氏 完全佐剂乳化；后续二次美沙酮代谢物EDDP人工抗原免疫量为20ug/只，抗原乳化步骤与 第一次相同；最后1次美沙酮代谢物EDDP人工抗原免疫量改为5ug/只，抗原乳化步骤与第 一次相同。
[0012] 步骤（2).淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合
[0013] 2-1.饲养细胞制备：小鼠摘眼球处死，浸泡于75 %酒精中消毒，撕开小鼠腹外皮 肤，暴露其腹膜，注入37°C预热的IMDM无血清培养基，轻揉小鼠腹腔，悬浮腹腔细胞，吸出 腹腔液；离心，沉淀物用1XHAT的IMDM培养液重悬，得到饲养细胞悬液。
[0014] 2-2.小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用含体积分数为 10 % FBS的IMDM培养基进行传代培养，细胞融合前一天进行传代以保证小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0适合生长状态良好用于细胞融合。
[0015] 2-3.淋巴细胞制备：取经步骤⑵处理的BALB/c雌鼠靠近淋巴结皮下部位的淋 巴结，研磨淋巴细胞至悬液；淋巴细胞悬液离心，取沉淀；在沉淀中加入MDM培养基，调整 淋巴细胞的浓度至1 X 107个/mL。
[0016] 2-4.淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合：采用聚乙二醇融合法。将调整浓度后的淋巴细 胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞个数比为2 :1混合均匀，离心洗绦细胞，去除上清液，置 于37°C水浴，加入lmL 37°C预温的PEG 1450,再加入25ml 37°C预温的MDM无血清培养基 终止PEG作用；离心，取沉淀；然后在沉淀中加入步骤2-1的饲养细胞悬液，接种到96孔细 胞培养板中，置于37°C，5 % 0)2培养箱中培养。
[0017] 步骤（3).杂交瘤细胞的筛选
[0018] 3-1?初筛：
[0019] 融合细胞在5 % C02培养箱中培养3天后，换用1 X HT的IMDM培养液继续培养4天 后，观察96孔细胞培养板里的融合细胞生长情况，在细胞生长到细胞团簇（在16倍物镜和 10倍目镜下观察，细胞大小占满1/3视野）时，吸取融合细胞培养上清液，采用间接ELISA 方法筛选阳性克隆。
[0020] 所述的1 X HT的頂DM培养液含有体积分数为15 %的FBS。
[0021] 3-2?复筛：
[0022] 将筛选到的阳性克隆进一步用竞争抑制ELISA方法进行复筛，筛选出竞争抑制率 最高的9G2. 5杂交瘤细胞株做克隆培养。
[0023] 3-3.杂交瘤细胞株9G2. 5的克隆化：
[0024] 杂交瘤细胞株9G2. 5的克隆化培养按有限稀释法进行，准确计数细胞，用含体积 分数为15 % FBS的頂DM培养基稀释成4个/mL的细胞悬液，然后以每孔200ul稀释后的 细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，7天后观察细胞生长情况，并检测细胞培养板中细胞 培养上清液的抗体水平，选择3个抗体效价最高的单克隆，做再次克隆化培养，直至单克隆 孔抗体检测阳性率达到100 % ;然后挑取单克隆细胞，命名为9G2. 5,扩大培养后进行抗美 沙酮代谢物EDDP单克隆抗体纯化。
[0025] 步骤（4).抗美沙酮代谢物EDDP单克隆抗体纯化
[0026] 将筛选到的单克隆细胞株9G2. 5用含体积分数为10 % FBS的MDM培养基接种到 24孔细胞培养板中，第二天接种到细胞培养瓶中，培养1天后，接种到细胞滚瓶中，滚瓶培 养4天后，收集培养上清液，将培养上清液浓缩后得到含有抗美沙酮代谢物EDDP单克隆抗 体的细胞培养浓缩液，然后用HiTrap PROTEIN G HP亲和柱纯化，得到纯化后的抗美沙酮代 谢物EDDP单克隆抗体。
[0027] 所述的PBS缓冲液为含有0. 008M十二水磷酸氢二钠、0. 15M氯化钠、0. 002M二水 磷酸二氢钠的水溶液，pH为7. 4 ;
[0028] 所述的1 X HAT的頂DM培养液含有体积分数为15 %的FBS。
[0029] 本发明最后一个目的是提供杂交瘤细胞株9G2. 5分泌的抗美沙酮代谢物EDDP单 克隆抗体在制备检测美沙酮代谢物EDDP胶体金试纸条上的应用。美沙酮代谢物EDDP胶体 金试纸条产品具有快速，操作简单等优点。为美沙酮代谢物的检测提供了一种有效的现场 尿检手段。本发明提供的EDDP杂交瘤细胞株所分泌的抗体用于胶体金试纸条上的标记原 料，尿检的检测阈值在l〇〇ng/ml。
[0030] 本发明所具有的有益效果：
[0031] 1.本发明在制备抗美沙酮代谢物EDDP单克隆抗体过程中，采用小剂量肌肉注射 免疫方法，免疫效价高。
[0032] 2.杂交瘤细胞株9G2. 5能够高效、稳定分泌抗美沙酮代谢物EDDP单克隆抗体，并 且该单克隆抗体的效价高、特异性好、敏感性高，能够大量生产，可用于制备检测美沙酮代 谢物EDDP的酶联免疫分析法试剂盒、胶体金试纸条等免疫学检测试剂。
[0033] 3.采用本发明包含抗美沙酮代谢物EDDP单克隆抗体的胶体金试纸条能快速且灵 敏地检测尿液，具有高灵敏度特点，适用于l〇〇ng/ml阈值的检测。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合实施例对本发明做进一步的分析（下面实施例中PBS缓冲液为含有 0. 008M十二水磷酸氢二钠、0. 15M氯化钠、0. 002M二水磷酸二氢钠的水溶液，pH为7. 4 ;后 小腿肌肉部位为小鼠腿部暴露在外部有大块肌肉的地方，而小鼠的大腿大部分被腹部皮肤 包裹，也可找到膝关节区分小腿大腿；1XHAT的MDM培养液含有体积分数15 %的FBS ; 1 XHT的MDM培养液含有体积分数为15 %的FBS)。
[0035] 本发明抗美沙酮代谢物EDDP杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株9G2. 5,于2015年 1月15日保藏于中国典型培养物保藏中心（China Center for Type Culture Collection， 简称CCTCC)，保藏号为CCTCC N0:C201507 ;保藏地址是中国武汉武汉大学。
[0036] 本发明涉及的杂交瘤细胞株9G2. 5可分泌一种抗美沙酮代谢物EDDP单克隆抗体。
[0037] 制备本发明涉及的杂交瘤细胞株9G2. 5并分泌抗美沙酮代谢物EDDP单克隆抗体 的方法，包括步骤如下：
[0038] 步骤（1).小鼠免疫：
[0039] 取8周龄的BALB/c雌鼠，用美沙酮代谢物EDDP人工抗原注射小鼠后小腿肌肉，每 隔1周注射一次，共注射4次；第一次美沙酮代谢物EDDP人工抗原免疫量为20 y g/只，第 一次美沙酮代谢物EDDP人工抗原免疫量进行抗原乳化步骤，抗原乳化步骤是将美沙酮代 谢物EDDP人工抗原免疫量稀释于20ulPBS缓冲液中，得到稀释抗原，与等体积量的弗氏完 全佐剂乳化；后续二次美沙酮代谢物EDDP人工抗原免疫量为20ug/只，抗原乳化步骤与第 一次相同；最后1次美沙