一种杂交瘤、单克隆抗体及其用图
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种杂交瘤、单克隆抗体及其用途，具体地说是涉及一种能识别黑尾叶蝉的单克隆抗体。
【背景技术】
[0002]黑尾叶蝉属于同翅目，叶蝉科，是我国和亚洲其它地区的主要水稻害虫之一。黑尾叶蝉取食和产卵时刺伤寄主茎叶，破坏输导组织，受害处呈现棕褐色条斑，可致植株发黄或枯死，一年可发生4?7代，在福建，广东等省冬季无滞育期。在其他地区，多以3?4龄若虫和少数成虫在冬季作物或杂草上过冬。成虫多在叶鞘内产卵，若虫前期喜群集，迀移性不大，常栖息于茎干下部或叶背面。老龄若虫转株为害，受惊动时则迅速横行躲避或跳落水面逃逸。成虫趋光性强，并有趋绿习性，因而在生长旺盛，发棵嫩绿的水稻田块里，成虫迀入量多，危害严重。
[0003]本发明公开的单克隆抗体结合酶联免疫吸附试验(ELISA)，由于具有灵敏度高、特异性强、适于大量检测田间黑尾叶蝉的特点，为应用该抗体进行黑尾叶蝉的鉴定，田间黑尾叶蝉的发生动态监测及天敌对黑尾叶蝉的捕食作用研宄奠定基础。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一种杂交瘤细胞NC-4D12，已于2014年12月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称:CCTCC)(中国武汉市武汉大学)，保藏号:CCTCC No:C2014241o
[0005]一种杂交瘤，该杂交瘤为杂交瘤细胞NC-4D12 CCTCC No:C2014241o
[0006]一种单克隆抗体，该抗体是由杂交瘤细胞NC-4D12 CCTCC No:C2014241分泌的单克隆抗体。
[0007]作为优选，所述杂交瘤细胞NC-4D12由下述方法制备得到:用抗原蛋白免疫BaLb/c小鼠，然后BaL b/c小鼠脾细胞与SP 2/0细胞在50%聚乙二醇作用下进行融合，融合后进行HAT培养，然后吸取杂交瘤细胞培养上清液进行ELISA检测，筛选出阳性且不与稻田其他昆虫和蜘蛛的抗原发生反应的细胞株，用有限稀释法克隆至能稳定分泌单克隆抗体的细胞株NC-4D12，即获得单克隆抗体杂交瘤细胞；其中，所述抗原蛋白来自研磨黑尾叶蝴虫体所得的上清液。
[0008]作为优选，所述抗原蛋白免疫BaL b/c小鼠的具体步骤为:选取10?12周龄的健康BaL b/c小鼠3只，采用腹腔注射法，每只注射用等量福氏完全佐剂乳化的抗原200 μ L ;3周后免疫使用等量福氏不完全佐剂乳化抗原200 μ L ;再过3周后用不加佐剂的抗原免疫。
[0009]作为优选，所述融合具体为:最后一次免疫后3天，收集抗血清，在无菌条件下取小鼠脾淋巴细胞用于细胞融合；采用聚乙二醇作融合剂，小鼠骨髓瘤细胞系为SP 2/0，整个过程在无菌条件下操作，将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞放入50mL离心管中，混合离心后，吸尽上清液，弹匀细胞；将离心管置于37°C水浴预温的盛水烧杯中，在Imin内加入50%PEG
0.1mL,静止Imin后，逐渐加入已经预温至37°C的RMP1-1640培养基40mL，使PEG稀释而失去作用，离心后弃上清液。
[0010]作为优选，所述HAT培养具体为:将沉淀的细胞悬于40mL HAT培养基后，分装于事先加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，置于5% 0)2温箱中在37°C下培养；3天后换一半HAT培养基，5天后再换一半HAT培养基，再5天改用HT培养基继续培养。
[0011]保藏编号CCTCC No:C2014241的杂交瘤细胞分泌得到的单克隆抗体用于识别黑尾叶蝉的应用。
[0012]本发明抗体是将研磨黑尾叶蝉虫体所得的上清液作为免疫原，利用单克隆抗体制备技术获得的针对黑尾叶蝉特异的单克隆抗体；该抗体被用于黑尾叶蝉的鉴定、动态监测以及研宄捕食性天敌对其的控制作用；本发明通过BaL b/c小鼠腹腔注射单克隆抗体细胞株，即可获得大量的该单克隆抗体，与多克隆抗体相比，具有纯度高，专一性强，重复性好等优点。
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
[0014]试验动物:8?12周龄BaL b/c小鼠(由浙江中医药大学实验动物中心提供)，试剂:福氏完全佐剂和不完全佐剂(购自Sigma公司)。
[0015]实施例1
一种单克隆抗体，该抗体是由杂交瘤细胞NC-4D12 CCTCC No:C2014241分泌获得，适于黑尾叶蝉样本检测的单克隆抗体。
[0016]杂交瘤细胞的制备，具体包括以下步骤:
(1)抗原的准备:将黑尾叶蝉供水饥饿Id后，置于-20°c冰箱中冰冻致死；取出称重后，加入少量0.01moL/L的PBS，研磨后加入适量的PBS后离心(4500r/min，15min)，分离上清液后低温离心(15000r/min, 1min),将上清液定容至0.05g/mL后用紫外分光光度仪测定抗原蛋白含量；将抗原液少量分装后_80°C冰冻保存；在临用前取少量于_20°C保存；
(2)选取10?12周龄的健康BaLb/c小鼠3只，采用腹腔注射法，每只注射用等量福氏完全佐剂乳化的抗原200 μ L ;3周后免疫使用等量福氏不完全佐剂乳化抗原200 μ L ;再过3周后用不加佐剂的抗原免疫；最后一次免疫后3天，收集抗血清(多克隆抗体)，在无菌条件下取小鼠脾淋巴细胞用于细胞融合；
(3)采用聚乙二醇(PEG-4000)作融合剂，小鼠骨髓瘤细胞系为SP2/0。整个过程在无菌条件下操作；将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞放入50mL离心管中，混合离心后(100r/min，2min)，吸尽上清液，以手指弹匀细胞；将离心管置于37°C水浴预温的盛水烧杯中，在Imin内缓慢加入细胞融合剂(50%PEG) 0.7mL ;静止Imin后，逐渐加入已经预温至37°C的RMP1-1640培养基40mL，使PEG稀释而失去作用；离心后(1000r/min，2min)弃上清液；将沉淀的细胞悬于40mL HAT培养基后，分装于事先加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，置于5%0)2温箱中在37°C下培养；3天后换一半HAT培养基，5天后再换一半HAT培养基，再5天改用HT培养基继续培养，此时亲本均已死去，如有细胞生长即为杂交瘤细胞；
(4)当小孔中细胞生长到覆盖孔底四分之一面积时，即可吸取上清液用间接ELISA检测抗体；选出强阳性且不与稻田其他昆虫和蜘蛛的抗原发生反应的细胞株，用有限稀释法进行多次克隆化培养，直至所有孔均为阳性为止，获得分泌单克隆抗体的细胞株NC-4D12，细胞株NC-4D12进一步扩大培养，用于制备单抗腹水和液氮冻存；
(5)取8周龄左右BaL b/c小鼠，腹腔注射0.3 mL降植烷，7?10天后腹腔注射5?10 X 15个杂交瘤细胞，注射后7?10天可见小鼠腹腔明显膨胀，取腹水，2000r/min离心